拉曼光谱检测手性化合物研究进展

李 丹，胡瑞琪，李攻科，夏 凌

（中山大学 化学学院，广东 广州 510006）

手性是自然界中的一种常见现象，不仅与生物密切相关的蛋白质、氨基酸、糖、酶等物质都有手性，许多药物和农药也具有手性［1］。手性化合物的结构和理化性质非常相似，但药效和毒性却有很大的差别［2-3］。例如，L-3，4-二羟基苯丙氨酸是目前治疗帕金森最有效且应用最广泛的药物，而D-3，4-二羟基苯丙氨酸不仅没有药理活性，还对人体有害［4］。因此，建立准确、高效的手性化合物检测方法具有重要意义。迄今为止，已有许多分析技术用于手性化合物的检测，包括高效液相色谱法［5-6］、比色法［7-8］和荧光法［9-11］等。尽管这些技术在推动手性化合物的分析和检测中已有较大进展，但随着手性化学的发展，如何实现复杂体系中手性化合物、样品表面手性以及多手性中心化合物的检测等成为今后发展手性分析化学最大的挑战，选择合适的光谱技术以建立高效、准确检测手性化合物的方法具有重要的现实意义。

拉曼光谱具有无损和检测快速等优点，并能提供化合物特有的“指纹信息”，在分析手性化合物方面显示出很好的发展潜力。目前，用于检测手性化合物的拉曼光谱主要有拉曼光学活性（Raman photoactivity，ROA）光谱、对映选择性拉曼（Enantioselective Raman，esR）光谱、低频拉曼（Low frequency Raman，LFR）光谱以及表面增强拉曼散射（Surface-enhanced Raman scattering，SERS）光谱。ROA光谱法是传统的手性化合物检测方法，其测量结果准确，但是由于光谱信号弱、检测时间长，检测效率受到极大限制［12-14］。相对于ROA光谱，esR光谱检测速度快、成本低，但由于数据处理困难［15-17］，目前很少用于手性化合物的检测。与ROA光谱和esR光谱不同，LFR光谱和SERS光谱无需依靠偏振光的作用，LFR光谱检测的关键在于如何解析拉曼光谱的低频区信息［18-19］；而SERS光谱是以SERS基底为基础，通过放大基底与不同手性化合物间的相互作用进行检测。另外，SERS光谱法和其他方法联用也为手性化合物检测提供了一种新思路［20-22］。本文综述了ROA光谱、esR光谱、LFR光谱以及SERS光谱检测手性化合物的研究进展，并对目前存在的问题及未来研究趋势进行了总结和展望。

1 拉曼光学活性光谱

ROA光谱是一种用于手性化合物检测的特殊的拉曼光谱技术，来源于手性化合物左右圆偏振光的差分拉曼散射［12-14］，因此对物质的手性结构非常敏感［23-24］，是传统的手性化合物检测方法。得益于其在手性化合物检测方面的优势，ROA光谱最近在立体化学［25-26］、生物化学［27］、制药［28-29］和生命科学［30］等领域有广泛应用。

1993年，Polavarapu等［31］利用ROA光谱成功地确定了有机硫化物的绝对构型。这是首次利用ROA光谱法对手性化合物进行检测。然而受限于当时的实验条件，在接下来的十年中研究相对较少。2007年，Hug等［32］利用ROA光谱对手性氘代新戊烷进行了识别，再次展现了ROA光谱在手性检测方面的优势。随后，Chruszcz-Lipska等［33］通过ROA光谱法检测了西伯利亚冷杉针油中的乙酸龙脑酯对映体，首次采用ROA光谱完成了对复杂体系中手性化合物的检测。另外ROA光谱还可用于手性固体样品的检测，Hasegawa等［34］通过ROA光谱法对全氟烃基化合物的结晶固体样品进行分析，发现其具有显著的光学活性，成功实现了全氟烃基化合物对映体的区分（图1）。图1A是用于扫描ROA光谱仪的拉曼成像显微镜，该仪器由电荷耦合元件（Charge-coupled device，CCD）、光栅、物镜、边缘滤波器以及激发波长为532 nm的激光器组成。为了实现ROA的测量，需在物镜上方放置一个λ/4波板，以形成右旋或左旋的圆偏振光对样品进行照射（图1B）。图1C是仪器的安装示意图，其中边缘滤波器能起到消除瑞利散射光的作用，当进行ROA检测时，边缘滤波器会将消除瑞利散射光后的拉曼散射光引入光栅中，最后借助CCD对其进行检测。图1D是物镜与样品相距高度的示意图，其中物镜的共焦孔内径为25 μm。用此装置进行ROA检测，可以得到具有10 μm内径和30 μm深的激光斑点的拉曼光谱。

图1 用于ROA检测的仪器总体视图（A）；样品室内部（B）；安装示意图（C）；焦点距样品表面的高度（D）［34］Fig．1 Overall view of the apparatus for ROA measurement（A）；inside of the sample room（B）；diagram of the setup（C）；the height position of the focal point from the sample surface（D）［34］

然而，ROA信号强度通常比传统拉曼光谱弱3~5个数量级［35］，且所需样品浓度高、采集时间长，应用受到很大限制。为了提高ROA光谱的检测效率，Li等［36］设计了一款以457 nm激光器作为光源的短波长ROA仪器，其灵敏度比商用的532 nm手性拉曼光谱仪高。短波长手性拉曼光谱仪的成功研制，实现了低功率、短时间、低浓度手性化合物的ROA检测［37］。此外，结合密度泛函理论计算［38］、机器算法［39］等技术手段也能加强ROA光谱对手性化合物的检测效率。

2 对映选择性拉曼光谱

传统的ROA光谱能较好地检测手性化合物，但其光谱信号弱、检测时间长。为了提高检测效率，Kiefer等［40］提出了一种全新的基于偏振分辨信号的拉曼手性检测方法，即esR光谱。该法仅需将半波延迟器添加到自动偏振分辨拉曼装置中，即可进行手性化合物的检测。与ROA光谱类似，esR光谱还充分利用了手性化合物的光学活性，即当线偏振光照射在样品上时，装置检测臂中的半波延迟器会使拉曼信号产生相位偏移［17］，导致对映体光谱的对称性被破坏，从而达到检测手性化合物的目的。

2018年，Kiefer等［41］利用esR光谱对手性2-丁醇进行分析，首次将esR光谱用于手性化合物的检测。随后，他们将esR光谱与部分最小二乘回归相结合，成功地确定了手性化合物5，6-二苯基-吗啉-2-酮的对映体纯度［42］。最近，Kiefer等［43］将esR光谱与多元数据分析方法相结合，对手性醇4-甲基戊-2-醇进行了分析，这项工作展现了esR光谱在检测手性化合物中的潜力。但是该项技术目前尚处于起步阶段，未来还需要更多的研究人员加入以推进其走向成熟。

3 低频拉曼光谱

LFR光谱又称低波数或太赫兹拉曼光谱，与目前常用的中频拉曼光谱相比，具有维护成本低、实验设置灵活、检测时间短等优点［18-19］。不同于ROA光谱和esR光谱，LFR光谱可以获得拉曼光谱低频区域的信息。因此，在不依赖于偏振光的作用下，仅通过分析拉曼光谱低频区域的特征峰信息，即可实现手性化合物的检测。这是因为拉曼光谱的低频区域信息丰富，且极易受极化变化的影响。然而，大多数的拉曼光谱仪都不能得到低频区的信息。近年来，体全息光栅的发展使LFR光谱检测成为可能。目前采用LFR光谱检测手性化合物的研究较少，Aviv课题组在该领域做出了突出贡献［44-46］。

大多数拉曼光谱只能检测溶液中的手性化合物，很少用于手性固体样品的检测。2017年，Aviv等［44］首次提出利用LFR光谱对手性固体样品进行检测，成功实现了对氨基酸外消旋晶体和对映体纯晶体的分析。随后，Aviv等［45］利用LFR光谱法成功测定了晶体的对映体过量值，该法简单、快速，具有较高的手性灵敏度，为晶体表面的手性表征提供了一种新的方法。最近，Aviv等［46］通过对传统拉曼仪器的光学设置进行调整：在激发路径中添加半波延迟器，在收集路径中添加Glan-Taylor偏振器，最终成功检测了3对手性氨基酸（图2A）。在传统的拉曼装置中，其焦锥是对称的（图2B），当偏振光入射到对映体上时，D-对映体和L-对映体分别顺时针和逆时针旋转相同的角度，无法实现手性化合物的检测（图2C）。而通过上述调整后可产生不对称的焦锥（图2D），这种不对称会形成不对称散射截面。与传统的拉曼装置不同，改进后的装置能够选择激发和收集信号的偏振平面。当以偏振光束激发时，由于焦锥的不对称性，使得各偏振平面所采集到的拉曼信号强度不同。通过比较LFR信号的强度即可实现手性化合物的分析，该方法显示出LFR光谱作为一种通用的对映体鉴别工具的潜力（图2E）。

图2 LFR实验装置示意图（A）；传统的拉曼激发（B）及收集的焦点区域示意图（C）；改进的拉曼激发（D）及收集的焦点区域示意图（E）［46］Fig．2 Schematic diagram of the experimental setup of LFR（A）；schematic representation of conventional Raman excitation（B）and its collected focal area（C）；schematic representation of the modified Raman setup excitation（D）and its collected focal area（E）［46］

LFR光谱的检测重点在于对拉曼低频区的信息进行解析，以便快速分析手性化合物。然而，目前掌握的拉曼低频区信息有限，因此很难对拉曼峰的归属进行分析。同时，随着光谱分辨率的提高，其检测效率也会随之下降。因此，如何平衡好二者的关系，进一步提高检测效率，将成为今后LFR技术发展的一个重要方向。

4 表面增强拉曼散射光谱

传统的拉曼手性检测方法灵敏度低，限制了其应用。虽然通过增加激光功率可以提高检测方法的灵敏度，但这往往伴随着仪器的大型化和装置的复杂化，不适合现场实时检测［20-22］。近年来，SERS光谱在检测手性化合物方面显示了很好的应用前景。在SERS基底的作用下，SERS光谱不仅能实现手性化合物的检测，而且极大地提高了检测的灵敏度。另外，SERS光谱还能与其他方法联用检测手性化合物。

4.1 基于SERS基底的手性检测

SERS基底是利用SERS光谱法检测手性化合物的关键［47-49］。当手性化合物与SERS基底作用时，会导致周围环境发生轻微变化。由于SERS光谱对周围环境的微小变化非常敏感，因此可以利用SERS光谱捕捉的手性化合物与周围环境相互作用所产生的微小差别，实现手性鉴别。

手性SERS基底可以为手性化合物检测提供手性环境。不同对映体分子间存在空间结构的差异，当二者相互作用时，会形成不同的氢键配合物，通过SERS光谱识别和转换后，会产生SERS信号强度的差异［50］，最终实现对各种手性化合物的检测［51-54］。Jin等［55］以手性二氧化硅为模板，将聚多巴胺（PDA）和银纳米颗粒沉积于其上，制备了SiO2/PDA/Ag纳米复合材料。随后去除SiO2模板，得到具有SERS活性的手性PDA/Ag基底，基于氨基酸对映体与手性PDA/Ag基底作用时会显示不同的SERS信号强度，成功实现了对酪氨酸和苯丙氨酸对映体的检测。除了利用手性模板合成SERS基底以提供手性环境外，还可利用手性配体直接合成手性SERS基底。Lyutakov等［56］通过对同手性金属有机框架（MOF）进行金光栅表面接枝，构建了手性检测传感器。其中，金光栅表面可激发表面等离子体激元波，有助于产生电磁增强。手性金属有机框架负责选择性捕获溶液中的对映体，促进SERS的化学增强。最后基于对映体在手性基底上SERS信号强度的差异，实现了甲基苯亚砜、半胱氨酸和多巴对映体的选择性识别和检测。Xu等［57］以谷胱甘肽对映体作为手性稳定剂，基于铂骨架制备了具有强烈手性光学响应的手性三角金纳米环（TNRs）。手性三角金纳米环不仅可用于检测手性化合物，还可确定Aβ42蛋白错误折叠和聚集的过程（图3A）。这项研究开辟了基于手性SERS基底早期诊断蛋白质错误折叠疾病的新途径。最近，Guselnikova等［58］开发了一种手性MOF膜包覆的金基底，能够实现血浆中手性伪黄麻碱的原位SERS检测，其检出限低至1．0 pmol/L。实验结果表明，SERS可以在复杂体系中检测手性化合物。

然而，手性SERS基底制备困难，制约了手性SERS检测方法的发展。最近，Wang等［59］发现基于拉曼探针分子、SERS基底和手性目标物之间的电荷转移（CT）效应，可在不依赖手性SERS基底和偏振光的情况下实现手性化合物的检测。首先利用拉曼探针分子与SERS基底形成氢键组装体系，当引入不同的手性化合物后，会导致SERS光谱产生差异（图3B）［60］。Wang等［61］将Ag溶胶基底浸入对巯基吡啶（MPY）溶液中，构建了Ag-MPY组装体系。将手性醇对映体引入体系后，MPY分子与对映体之间会形成不同的CT效应，最终根据SERS特征峰的相对强度差异，实现了手性醇分子的检测，首次证明CTSERS适用于手性化合物的检测。随后，Wang等［62］将TiO2NPs引入到构建的手性传感器中，制备了Ag-TiO2-Ag三明治基底，TiO2的引入改善了体系的CT行为，提高了对手性化合物的检测效率，同时β-环糊精的引入实现了对手性目标物的立体选择性捕获，放大了对氨基硫酚的手性差异，最终实现了各种氨基酸对映体的检测。最近，Wang等［63］利用n-六硫醇、对巯基苯硼酸和垂直排列的Au-NRs阵列组成手性检测传感系统，基于手性芳香分子与手性检测传感系统间不同的氢键作用，借助CT-SERS成功地鉴定了10多种手性芳香分子。以L/D-扁桃酸的检测为例，对该法的手性鉴别机制进行分析。研究发现，含有疏水芳香环的L-或D-扁桃酸容易被n-六硫醇通过范德华作用和疏水作用拉入基底附近，因此可被灵敏地检测到。另一方面，扁桃酸对映体的亲水羧基和羟基则通过氢键与邻近的对巯基苯硼酸的羟基相互作用。由于扁桃酸对映体存在不同的空间结构，这导致所形成的复合物具有不同的电子结构和CT过程，使两个对映体系统出现了不同的SERS光谱（图3C）。该法展现了CT-SERS检测手性化合物的巨大潜力。

图3 手性Pt@Au TNRs基底的合成路线及Aβ42检测示意图［57］（A）；对映选择性传感器的制备过程示意图［60］（B）；传感器与L/D-扁桃酸对映体在鉴别过程中的相互作用示意图［63］（C）Fig．3 Synthesis route of chiral Pt@Au TNRs substrates and schematic diagram for Aβ42 detection［57］（A）；an illustration of the fabrication processes of the enantioselective sensor［60］（B）；schematic diagram of interaction between sensor and L/D-mandelic acid enantiomer during identification［63］（C）

4.2 SERS联用技术

近年来，多模态检测方法受到了广泛的关注。这种方法可以整合多个分析系统的相关参数和信息，大大简化了分析检测过程。目前SERS已与多种技术联用实现了手性化合物的检测［64-68］，如SERS手性各向异性［69］、SERS-手机湿润性测量［70］、SERS-电化学法［71］、峰值拟合辅助SERS［72］等。

Che等［69］借助手性纳米结构金膜为SERS基底构建了SERS手性各向异性（SERS-ChA）检测平台，该平台可以利用线偏振光或非偏振光通过SERS来区分对映体（图4A-i）。SERS-ChA被定义为同一手性平台上对映体分子的SERS强度差异，即SERS-ChA=IS-IR，其中IS和IR分别为S和R对映体的SERS强度。同时提出了g因子，即gSERS-ChA=2（IS-IR）/（IS+IR）。最大的lim|g|max=2表示对映体可以实现完全区分（图4A-ii）。当检测和量化一个未知样品时，首先需要建立一个标准曲线，然后将被测化合物稀释到SERS-ChA标准曲线中的浓度，通过测定混合样品在手性SERS基底上的拉曼信号值，代入标准曲线即可得到未知样品的绝对构型和对映体过量值，实现手性化合物的检测（图4A-iii），该方法无需预先分离待测样品，操作简单、成本低、灵敏度高。Lyutakov等［70］研制了一种基于手机润湿性测量和SERS的双模手性传感芯片，通过在常规的金光栅表面共价嫁接手性识别分子，即L/D-酒石酸，使手性胺的立体选择性识别成为可能。胺的手性感应包括两种分析模式，首先，由手性胺的对映选择性夹带引起的润湿性变化，可以通过手机应用程序进行监测和分析。其次，基于该芯片的SERS测量可以提供胺的化学结构信息，并可非常准确地计算出对映体的过量值。所开发的芯片适用于各种手性胺的检测，包括分析溶液中的酪氨酸、半胱氨酸、多巴胺和含有3，4-二羟基苯丙氨酸（DOPA）的商用药物中的右美沙芬（图4B）。Ling等［71］将不对称纳米多孔金碗（Nanoporous gold bowls，NPGB）与电化学-SERS（EC-SERS）联用，成功获得了对映体的特异性分子指纹，实现了对手性色氨酸的无标记SERS检测。其中，NPGB上的表面原子缺陷可形成局部不对称位点，以诱导手性化合物与NPGB间的相互作用；而外部电位可以最大程度地促进二者相互作用，实现SERS信号的放大，最终表现出SERS峰强度比率的明显变化。结合化学计量分析，可以进一步精确地量化对映体的比例。该法在疾病诊断和药物质量控制方面展现出良好的应用前景（图4C）。

图4 SERS-ChA鉴别对映异构体的示意图［69］（A）；L-或D-酒石酸涂层金光栅的制备示意图［70］（B）；NPGB/EC-SERS策略检测对映异构体的示意图［71］（C）Fig．4 Schematic illustration of the SERS-ChA method for enantiomer discrimination［69］（A）；schematic of the preparation of L-or D-tartaric acid coated gold gratings［70］（B）；schematic illustration of the NPGB/EC-SERS strategy for differentiation of enantiomers［71］（C）

5 结论与展望

本文主要从ROA光谱、eSR光谱、LFR光谱及SERS光谱4个方面介绍了拉曼光谱在手性化合物检测中的研究进展，并对各种方法的优缺点及应用场景进行了详细的讨论。其中ROA光谱、eSR光谱及LFR光谱主要借助偏振光及改进的拉曼光谱仪器，通过增强体系的手性信号达到检测目的；而SERS光谱则依靠材料与手性化合物的相互作用，实现手性化合物的检测。

虽然目前拉曼光谱可以在一定程度上实现对手性化合物的检测，但仍存在许多问题：（1）传统的拉曼光谱灵敏度低，限制了拉曼手性分析的进一步发展；（2）现有的拉曼手性分析大多局限于手性标准品的检测，在复杂体系中的应用较少；（3）手性拉曼检测方法大多依赖于偏振光及手性环境的作用，检测成本高、操作复杂。为了提高拉曼光谱在检测手性化合物方面的实用性，还需：（1）紧跟物理学和电子学的发展，将信号增强理论和拉曼光谱仪器的研制引入到研究中，提高检测效率；（2）结合前处理技术，消除基体干扰，快速检测复杂手性样品；（3）开发双模甚至多模检测方法，例如结合拉曼光谱和手性试剂衍生化法，简化检测过程。此外，在分析复杂体系时，往往需要结合精细的数据处理方法，以机器学习辅助拉曼手性分析也是未来研究的重点。拉曼光谱检测手性化合物的研究方兴未艾，作为具有发展潜力的分析检测方法，依靠拉曼光谱检测手性化合物将越来越受到人们的重视。