温敏型铜银荧光纳米簇的绿色制备及细菌成像研究

陆可钰，孔令灿，潘红阳，朱 松*

(1.江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江南大学分析测试中心，江苏 无锡 214122；2.无锡市疾病预防控制中心，江苏 无锡 214023)

温度影响各种化学和生物反应的进程，是生物体内被测量最频繁的基本参数[1]。因此准确测量细胞温度及其在细胞内的变化有助于促进细胞生物学和生物医学的发展[2]。传统的温度传感器是基于对侵入式探头的热量检测，且无法远程测量高分辨率的局部温度。基于荧光的温度传感器因非侵入性检测和耐用性等优点而备受关注[3]，并显示出巨大的优势。最近，许多用于温度测量的荧光探针被开发，如荧光染料[4]、荧光聚合纳米颗粒[5]、量子点(QDs)[6]、稀土掺杂的纳米颗粒[7]以及聚合物水凝胶纳米材料[8]等。但这些荧光探针由于稳定性差、毒性大或制备成本高等原因限制了其进一步应用。

金属荧光纳米簇(NCs)一般由几个至几百个金属原子组成，在从紫外(UV)到近红外区域的宽光谱区存在离散的能级和尺寸依赖性荧光，同时表现出超小尺寸、优异的生物相容性和强荧光性，因此它们作为潜在的生物标记物而备受关注，并广泛应用于生物成像、催化和离子传感等领域[9-12]。因此近年来荧光金属纳米团簇发展迅速。目前，单金属纳米簇在细胞成像和温度传感中也得到广泛研究[13-15]，但由于反应条件相对复杂、原材料昂贵或量子产率低等原因使其在细胞温度传感方面的应用受到限制。与单金属相比，由两种不同金属元素组成的双金属纳米簇在电子、光学和催化性能等方面具有更多的优势[16-17]。因此近年来，许多学者开始致力于双金属纳米材料的研究。例如,Zhang等[9]采用水热法合成Au-AgNCs，用于选择性分析Hg2+和Cu2+。Huang等[18]用硫辛酸制备高度荧光的Au/AgNCs检测Fe3+。Tian等[19]利用蛋清蛋白在微波辅助下合成了具有橙色荧光的AuAgNCs，并用于CN-检测和生物成像。但使用双金属纳米簇特别是大粒径(比如100 nm)金属纳米簇作为温度传感器检测细菌细胞体内温度的相关研究却非常少见。主要原因在于：双金属纳米簇的制备比较困难；大粒径的金属纳米簇一般不发光，为细胞中温度成像带来了困难；大粒径的纳米簇组装体进入细胞后，在酶的作用下，可能会面临解离的风险，导致发光的纳米材料进入细胞后不再发光。

本文在温和的反应条件下通过简单直接的绿色合成方法，以D-青霉胺为配体制备出水溶性的铜银荧光纳米簇(Cu-AgNCs)，并对其形貌、结构、荧光性能等进行了表征。所制备的Cu-AgNCs粒径较大，具有很高的量子产率和很好的聚集诱导发光现象，有望作为荧光纳米探针应用于温度传感和细胞成像等领域。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UV-2450型紫外可见分光光度计、F-4500型荧光光谱仪(日本岛津公司)，Nexus670型傅立叶变换红外光谱仪(美国Nicolet公司)，JEM-2100型透射电子显微镜(日本JEOL公司)，TCS SP8激光共聚焦显微镜(德国徕卡公司)。

D-青霉胺(98%)、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。硫酸铜(CuSO4·5H2O，98%)、硝酸银(AgNO3，99%)购自阿拉丁试剂(中国)公司。所有试剂均为分析纯。大肠杆菌(E.coli)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。实验用水均经Milli-Q纯水系统过滤制备。

1.2 Cu-AgNCs的制备

参照文献方法[20]制备Cu-AgNCs，并加以改进，具体过程如下：在室温下将8 mg的D-青霉胺、40 μL的CuSO4溶液(100 mmol/L)以及10 μL的AgNO3溶液(100 mmol/L)依次加至5 mL水中，搅拌反应5 min后初步制得Cu-AgNCs，所得样品离心去溶剂，将沉淀物重新分散于水中备用。

1.3 荧光量子产率的测定

首先将硫酸奎宁溶于0.1 mol/L硫酸溶液中(量子产率为54%)，在同一条件下分别测量Cu-AgNCs和硫酸奎宁的紫外吸收光谱(360 nm处)和荧光发射光谱(360 nm激发)，然后按照下式计算Cu-AgNCs的荧光量子产率[21]：

式中，st和x分别代表硫酸奎宁标准溶液和Cu-AgNCs溶液，φ和I分别为荧光量子产率和荧光强度，A和η分别为溶液的吸光度和折光率(水溶液中均为1.33)，为减少样品的自吸收效应，保持测试溶液在360 nm处的吸光值小于0.05。

1.4 细胞毒性实验

将大肠杆菌细胞在LB(Luria Bertani)培养基中于37 ℃在振荡培养箱中培养过夜进行活化。将活化好的细胞加入96孔板中，每孔菌液浓度约为108cfu/mL,在孔中加入LB培养基和不同浓度的Cu-AgNCs溶液(0～50 mg/L)继续培养24 h。实验设置空白对照组，每组设6 个平行复孔，随后加入20 μL的MTT(5 g/L)溶液，继续培养4 h。之后除去培养基，并向每孔中加入100 μL DMSO以溶解蓝紫色结晶。测定各孔在570 nm处的吸光值(OD)。实验至少重复3次。不同浓度Cu-AgNCs存在下的细胞存活率根据下式计算：细胞存活率(%)=OD实验组/OD对照组×100%。

1.5 细菌成像实验

将Cu-AgNCs(30 mg/L)溶液加至活化好的大肠杆菌中，在37 ℃下摇床培养24 h。取培养后的细菌于10 000 r/min 下离心3 min，去上清液后用水洗涤3次以除去未结合的纳米簇，再将细胞固定在载玻片上用激光共聚焦荧光显微镜进行观察。

不同温度下大肠杆菌成像实验过程如下：将Cu-AgNCs(30 mg/L)溶液加至活化好的大肠杆菌中后，将溶液平均分成3份，分别置于不同的共聚焦培养皿中，在37 ℃下培养箱培养24 h。测试前分别将上述培养皿中的细菌在不同温度(293、303、313 K)下培养10 min后，弃去培养液，立即进行激光共聚焦检测。

2 结果与讨论

2.1 Cu-AgNCs的表征

Cu-AgNCs的UV-Vis吸收光谱在305 nm处有强吸收峰,纳米簇水溶液在可见光下为透明的澄清液体，而在365 nm 紫外灯下则显示出强烈的红色荧光(图1A)，表明所制备的Cu-AgNCs具有良好的光致发光性。同时，荧光光谱表明Cu-AgNCs的最大激发波长和发射波长分别为340 nm和600 nm(图1B)，这与紫外灯下观察到的红色荧光相一致。根据“1.3”荧光量子产率的测定方法，测得所制备荧光纳米簇的量子产率可达到9.6%。

利用透射电子显微镜(TEM)对合成的Cu-AgNCs进行表征(图2A)，由图可知Cu-AgNCs近乎球形，平均粒径约为180 nm，且具有良好的分散性，所得结果与文献报道[20]相似。同时，利用TEM附带的X射线能谱仪(EDS)对所得样品进行元素分析，EDS谱图表明Cu和Ag同时存在(图2B)。从傅立叶变换红外光谱(FT-IR)结果(图3)可以看出，相比于纯的D-青霉胺，Cu-AgNCs在2 520 cm-1处的峰消失，这是由于S—H键发生了断裂并形成新的S—Cu(Ag)键。上述结果证明已形成了Cu-AgNCs。

2.2 Cu-AgNCs对温度变化的光学响应

制备得到的Cu-AgNCs在279～355 K温度范围内具有良好的温度敏感的荧光性质(图4)。从279 K增至355 K，Cu-AgNCs在580 nm处的荧光强度降低了约85%，但荧光光谱的位置未发生迁移。以荧光强度(Y)对温度(X)进行线性拟合，结果显示，二者之间呈良好的线性关系，其线性方程为：Y=0.022 3X+14.195，相关系数(r2)为0.995。此外，对Cu-AgNCs水溶液的荧光强度随温度变化的可逆循环性能进行了研究，通过连续6次测定在279 K 和323 K之间的多次加热和冷却循环，发现该荧光纳米簇呈现良好的可重复使用性(图5A)，并在加热和冷却过程中存在轻微的温度滞后(图5B)。该特性是温度敏感荧光材料的典型特征，并遵循玻尔兹曼分布；随着温度升高，分子碰撞频率和非辐射跃迁速率增加，而辐射跃迁速率保持不变，导致激发态(即荧光强度)发射强度降低[22-23]。以上结果表明Cu-AgNCs具有响应温度范围广、灵敏度高、重复性强，以及荧光强度与温度存在线性关系等特性，可用作温度荧光传感器对细胞和生物体内的温度进行检测。

图3 D-青霉胺(a)和Cu-AgNCs(b)的红外光谱图Fig.3 FT-IR spectra of pure D-penicillamine(a) and Cu-AgNCs(b)

图4 Cu-AgNCs荧光发射强度随温度的变化Fig.4 Emission spectral changes of Cu-AgNCs upon increasing temperatures from 279 K to 335 K at step of 5 Kinsert:linear relationship between emission intensity and temperature

2.3 细胞毒性及细菌成像实验

以大肠杆菌为典型细菌代表，考察了Cu-AgNCs对细菌的细胞毒性和荧光成像。MTT实验结果显示，当Cu-AgNCs质量浓度不超过30 mg/L时，细菌细胞存活率大于90%，即使Cu-AgNCs质量浓度达50 mg/L，细胞存活率仍在80%以上。表明Cu-AgNCs具有较低的细胞毒性。

由于其独特的荧光性质、良好的水溶性以及低毒性，制备的Cu-AgNCs可用于荧光标记和成像。图6显示了大肠杆菌与Cu-AgNCs(30 mg/L)培养24 h下的明场、荧光场及叠加图的激光共聚焦图片。从明场图中可见到纳米簇培养下的细菌细胞仍保持正常形态，表明Cu-AgNCs具有良好的生物相容性。而405 nm激光照射的荧光图像显示，通过细胞内吞作用，细菌内呈现出明亮的红色荧光且在细菌内部均匀分布，说明Cu-AgNCs已成功标记大肠杆菌细胞。同时，未观察到任何细胞损伤，表明Cu-AgNCs可用作细菌荧光成像的探针。

为深入理解大肠杆菌细胞中温度感应的纳米测量装置，通过共聚焦荧光显微镜检测了在293、303、313 K下Cu-AgNCs的细胞成像。图7显示了用30 mg/L的Cu-AgNCs与大肠杆菌孵育24 h后的共聚焦荧光图像。荧光图像随着温度的升高而大幅度猝灭，表明荧光发射强度明显受温度影响，所制备的纳米簇可作为多功能纳米测温装置用于细胞温度传感。以上结果显示，制备的Cu-AgNCs有望作为荧光探针在细胞成像方面得到应用。

3 结 论

在温和条件下以D-青霉胺为配体，通过一步法制备出水溶性的铜银荧光纳米簇(Cu-AgNCs)，所需原料简单易得，实验操作简便。实验制备的Cu-AgNCs粒径较大(平均粒径为180 nm)，具有很好的聚集诱导发光现象，在室温下显示红色荧光，量子产率可达到9.6%。同时，该荧光纳米簇的荧光强度和温度之间存在良好的线性关系。此外，以大肠杆菌为细菌代表的细胞毒性实验和共聚焦荧光成像测试表明，制备的荧光纳米簇细胞毒性小、生物相容性好，有望作为荧光纳米探针应用于温度传感和细胞成像等领域。