珠三角地区人群血浆中邻苯二甲酸酯的暴露水平研究

陶斯湄，朱冬林,陈艳华，吴惠勤,周 熙,徐长志，谢芝芝，陶 玲，席 云*

(1.中山大学附属第三医院 药剂科，广东 广州 510630；2.中山大学附属第三医院 检验科，广东 广州510630；3.广州博康生物技术有限公司，广东 广州 510440；4.广东省测试分析研究所 广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东省分析测试技术公共实验室，广东 广州 510070)

塑化剂，亦称增塑剂，是一种用于增加物品柔软性和伸展性的高分子材料助剂，被广泛应用于食品包装、玩具、家具、洗化用品中。目前常见的塑化剂有200多种，其中邻苯二甲酸酯类(PAEs)占比最多，约占总产量的80%[1-2]。研究表明，PAEs具有致癌、致畸、致突变等效应[3-4]，摄入过量可损害肺、肾脏、睾丸等器官[5-7]。PAEs的分子结构具有芳香族基团，有一定的类雌激素活性，因此被称为环境类雌激素。其在人体内过量累积会使男性的雄激素水平下降，使女童发育性早熟。2007年，欧盟开始在玩具和儿童用品的生产中禁止使用邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)，以及限制使用邻苯二甲酸二异壬酯(DiNP)、邻苯二甲酸二异癸酯(DiDP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DnOP)[8]。2011年6月起，我国也将PAEs列入非法和滥用的食品添加剂名单[9]。

由于PAEs在塑料中与高聚物基质间以非共价键的形式连接，相互作用力较弱，导致PAEs在塑料制品的生产、使用与储存过程中极易释放到环境中[10]。研究证实，PAEs广泛存在于大气、土壤、水等环境介质[11-13]，在食物中也有检出[14-15]。人体可通过皮肤、消化道和肺部等途径吸收食品与环境中的PAEs[16-17]。通过生物监测技术研究人体生物样品(血液、唾液、尿液等)中PAEs的浓度水平和指纹特征，能够反映该人群对污染物暴露的情况，而血液是研究PAEs暴露水平的重要介质[18-19]。

珠三角地区人口密集，经济发展快速，塑料制品用量大，因此人群PAEs暴露具有潜在的健康风险，但相关研究较少。本文采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法对随机采集的珠三角地区人群血浆中的16种PAEs进行分析，发现该地区人群血浆中PAEs的暴露水平相比其它地区较低，但DEHP具有较高水平，需引起重点关注。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1290-6590高效液相色谱-三重四极杆串联质谱(美国Agilent公司)。16种PAEs混标(1 000 μg/mL)：邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DiBP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DnBP)、邻苯二甲酸二(2-甲氧基乙基)酯(DMEP)、邻苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯(BMPP)、邻苯二甲酸二(2-乙氧基乙基)酯(DEEP)、邻苯二甲酸二戊酯(DPP)、邻苯二甲酸二己酯(DHXP)、邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)、邻苯二甲酸二环己基酯(DCHP)、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)、邻苯二甲酸二苯酯(DPhP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DnOP)、邻苯二甲酸二壬酯(DNP)、邻苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯(DBE)，以及对应的16种D4-PAEs混标(10 μg/mL)均购于天津阿尔塔科技有限公司。正己烷、乙腈(色谱纯，美国Thermo Fisher公司)；甲酸(色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司)。

1.2 样品采集与前处理

随机采集100例珠三角地区人群的血浆样品(53例女性、47例男性，年龄在1～92岁)。样品进行抗凝处理后，以3 000 r/min离心10 min，将上层血浆转移至玻璃离心管，于4 ℃保存待测。

在1.0 g血浆样品中加入2 ng PAEs内标，涡旋混匀，用0.5 mL乙腈沉淀蛋白后，加入1 mL正己烷，涡旋1 min，3 000 r/min离心5 min后，取上层清液。重复萃取3次，合并上清液，浓缩至干，用0.2 mL乙腈复溶，以2 000 r/min离心5 min后，上清液进行HPLC-MS/MS分析。

1.3 HPLC-MS/MS测定条件

色谱条件：捕集柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus RRHD(2.1 mm×50 mm,1.8 μm)；色谱柱：Agilent Extend C18RRHD(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；柱温：40 ℃；流动相：A为0.2%甲酸水溶液，B为乙腈；流速：0.45 mL/min；洗脱梯度：0～1.0 min，35%B；1.0～7.5 min，35%～57%B；7.5～10.0 min，57%～80%B；10.0～11.0 min，80%～90%B;11.0～14.5 min，90%～95%B；14.5～15.0 min，95%～100%B;15.0～16.0 min，100%B；16.0～18.0 min，100%～35%B；进样量：2 μL。

质谱条件：电喷雾(ESI)正离子模式扫描，多反应监测(MRM)模式采集；干燥气温度：350 ℃；干燥气流量：8 L/min；雾化气压力：3.1 MPa；鞘气温度：350 ℃；鞘气流量：11 L/min；毛细管电压：4 000 V。16种PAEs的质谱参数见表1。

表1 16种PAEs的质谱参数Table 1 Mass spectrometric acquisition parameters of 16 PAEs

*quantitative ion

1.4 质量控制

在每个样品分析前加入同位素内标，采用内标法定量，以3倍标准偏差为检出限。每20个样品添加1个方法空白样品。为降低实验空白，实验过程避免使用塑料制品。所有玻璃仪器均采用丙酮超声清洗后，以正己烷淋洗。

1.5 数据处理

采用SPSS 18.0进行统计分析。未检出PAEs的样品，则以1/2方法检出限(MDL)对应的浓度进行分析。不同性别与年龄人群的血浆中PAEs浓度采用t检验与单因素方差分析进行差异性比较。结果均以P<0.05作为差异显著性检验水平。

2 结果与讨论

2.1 HPLC-MS/MS测定血浆中PAEs

目前，HPLC-MS/MS法是检测血浆中PAEs的常用方法。但由于血浆样品基质复杂，需结合高效的样品前处理方法以降低基质效应。然而，由于PAEs广泛存在于环境中，因此复杂的前处理过程(如固相萃取)易造成较大空白，对血浆中低浓度PAEs的测定结果影响较大。本实验采用简单的蛋白沉淀和液液萃取前处理方法，通过加入同位素内标校正基质的干扰，同时降低了实验空白，提高了定量准确度。

在“1.3”优化条件下，16种PAEs标准样品的MRM色谱图见图1。16种PAEs的分离度良好，且3对同分异构体实现了基线分离，方法检出限为0.001～2.00 ng/g。空白样品中检出DMP、DiBP、DnBP与DEHP，检出量分别为(0.07±0.02) ng/g、(0.07±0.02) ng/g、(0.49±0.03) ng/g与(1.00±0.43) ng/g。实验结果经空白扣除。

2.2 人群血浆中PAEs的暴露水平

采用本方法对“1.2”的100例血浆中16种PAEs的残留量进行测定，结果如表2所示。其中检出DMP、DiBP、DnBP、DEHP、DCHP与BBP。100例样品中均有PAEs检出，上述6种PAEs的检出总量(∑PAEs)为12.4～1 399 ng/g，中值与平均值分别为39.8 ng/g与57.7 ng/g。其中DEHP的含量最高，检出率为100%，检出量为11.1～1 398 ng/g，中值与平均值分别为38.7 ng/g与57.0 ng/g。DiBP与DnBP两种同分异构体的检出量为

图1 标准样品中PAEs的 MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of PAEs in standard sample

DMP、DiBP、DnBP与DEHP是血液中常见的4种PAEs。王帅等[20]在哈尔滨市孕妇血液中检出上述4种PAEs，其质量浓度分别为84～622 ng/mL、87～876 ng/mL、116～833 ng/mL与87～1 264 ng/mL。除DEHP外，其它3种PAEs的暴露水平显著高于本实验。同时，本实验DMP、DiBP、DnBP与DEHP的暴露水平也低于黄晓群等[21]的报道值。近年来，随着对PAEs毒性研究的深入，以及对含PAEs制品监控力度的加大，环境中PAEs的水平逐渐降低。研究显示，我国室内灰尘中DEHP的含量从2012年的1 190 μg/g下降至2018年的25.6 μg/g[22]。同时，我国卫生部也将DEHP等17种PAEs列为违法添加的非食用物质，禁止在食品中使用。而食品是人体PAEs暴露的重要来源之一[23]。随着环境介质与食品中PAEs浓度的降低，人体内PAEs的暴露水平也逐渐下降。因此，与早期的研究结果相比，本实验在珠三角地区人群血浆中检测的PAEs暴露水平较低。

由于DEHP的使用量较大，且在环境中的降解速率低于短链PAEs，导致其在人体中具有较高的暴露水平。研究表明，DEHP对肝脏、肾脏及甲状腺等均有明显的毒性效应[24-25]。同时，还具有生殖毒性，可引起男性不育症[26]。人体血浆中DEHP的高暴露水平预示了其潜在的健康风险，需引起重点关注。

表2 人群血浆中PAEs的暴露水平Table 2 PAEs exposure level in human plasma

*not detected

图2 血浆中PAEs的组成特征Fig.2 Component characteristics of PAEs in plasma

2.3 血浆样品中PAEs的组成特征

血浆中PAEs的组成特征见图2。结果显示，DMP、DiBP、DnBP、DEHP、DCHP与BBP的占比分别为0～1.44%、0～0.59%、0～15.65%、90.01%～99.96%、0～0.24%和0～1.53%，其平均值分别为0.29%、0.33%、1.25%、98.09%、0.003%和0.02%。所有样品中DEHP的占比均大于90%。DEHP是生产和消费量最大的PAEs，占PAEs总量的70%以上[26]。同时，由于长链PAEs的代谢速率较短链PAEs慢[27]，使得其易在血液中累积。

图3 不同性别(A)与不同年龄(B)人群血浆中的PAEs含量Fig.3 Contents of PAEs in human plasma with different sexs(A) and different ages(B)

2.4 性别与年龄对PAEs暴露的影响

不同性别与年龄人群血浆样品中PAEs的暴露水平见图3。采用t检验法与单因素方差分析分别研究不同性别与年龄组间PAEs暴露水平的差异。图3A结果显示，检出率较高的4种PAEs(DMP、DiBP、DnBP与DEHP)在女性血浆中的平均暴露水平高于男性，但仅DMP在两组样品中存在显著性差异(P<0.05)。研究表明，PAEs在人体内的暴露水平与人群生活习惯有关。相对于男性，女性处于室内环境的时间可能较长，而室内空气与灰尘是人体PAEs暴露的另一重要来源[28]。另外，个人护理品也是人体PAEs暴露的重要来源，而女性个人护理品的使用量相对于男性较高。

比较上述4种PAEs在不同年龄段人群的暴露水平发现(图3B)，DMP在21～40岁年龄段人群的暴露水平显著高于41～60岁人群，DiBP在0～20岁人群的暴露水平显著高于>60岁年龄段人群(P<0.05)。其它年龄段人群的暴露水平则无显著差异。有文献对比了同一地区儿童、青年与成人体内的PAEs代谢物浓度，发现儿童与青年的PAEs暴露水平高于成人[29]，这与本实验结果类似。不同年龄人群的PAEs暴露水平影响因素较多。室内灰尘与饮食是人群PAEs暴露的主要途径[23]。研究表明，儿童通过室内灰尘暴露的PAEs水平显著高于成人[22]。而我国不同年龄人群通过饮食暴露PAEs的水平差异研究较少，需在后续实验中进行研究。

3 结 论

本文采用HPLC-MS/MS法研究了珠三角地区人群血浆中PAEs的暴露情况。结果表明，DMP、DiBP、DnBP、DEHP、DCHP与BBP等6种PAEs检出。其中DEHP的检出率为100%。DMP、DiBP与DnBP的检出率分别为49.0%、98.0%、62.0%。仅5.00%的样品中检出DCHP与BBP。∑PAEs为12.4～1 399 ng/g，其中DEHP所占比例最高，为90.01%～99.96%。女性与低年龄组(≤40岁)人群的血浆中PAEs浓度较高，但仅DMP存在显著性差异。除DEHP外，珠三角地区人群的PAEs暴露水平较低。但DEHP暴露水平较高，显示具有潜在的健康风险，需引起重点关注。