基于聚多巴胺纳米粒子的荧光增强型探针检测乙酰胆碱酶

杜方凯，李梦汝，莫远健，谭学才，黄乃阳，黄安娜

(广西民族大学 化学化工学院，广西高校食品安全与药物分析化学重点实验室，广西林产化学与工程重点实验室，广西 南宁 530006)

乙酰胆碱酶(Acetylcholinesterase,AChE)是存在于生物体中枢神经系统中的一种丝氨酸蛋白酶，能催化神经递质乙酰胆碱的水解，具有终止神经传导的作用[1-2]，且与阿尔茨海默病密切相关[3-4]。因此，建立一种准确、灵敏、简便、特异性检测AChE的方法在阿尔茨海默病的诊断和治疗方面具有重要意义。

近年来，用于AChE检测的方法主要有比色法[5-7]、化学发光法[8]、电化学法[9-11]和荧光法[12-14]。其中，荧光法因具有灵敏度高、响应时间快、实时检测酶活性的优点，引起广泛关注[15-24]。迄今为止，研究者基于有机染料[25]、量子点[26]、重金属纳米簇[27-28]等荧光材料已构建了一些检测AChE的荧光探针。但上述荧光材料均存在有机染料水溶性和光稳定性差、量子点的毒性、贵金属纳米簇稳定性低和成本高等缺点。因此，发展价格低、水溶性和光稳定性好可用于AChE荧光检测的材料仍然存在挑战。

图1 基于F-PDA对乙酰胆碱酶的检测示意图Fig.1 Schematic illustration of the F-PDA for AChE detection

聚多巴胺荧光纳米粒子(F-PDA)是在氧化应激或碱性(pH>7.5)条件下，多巴胺通过共价键、氢键、π-π等相互作用聚合而成的一种新型纳米材料[29]。F-PDA不仅具有显著的光学、电学和磁学特性，还具有良好的生物相容性和生物降解性，广泛应用于能源、水处理、分析检测等各个材料科学领域[30-31]。目前，基于聚多巴胺荧光纳米粒子的荧光响应分析已应用于碱性磷酸酶定量测定[32]。

本研究以多巴胺盐酸盐为原料，采用一步法合成了F-PDA,与MnO2纳米片复合时，其荧光猝灭；而当体系中存在AChE时加入硫代乙酰胆碱(ATCh)，AChE可以催化ATCh水解生成硫代胆碱(Thiocholine,TCh)，而将MnO2还原为Mn2+并引发MnO2纳米片的分解，导致F-PDA的荧光恢复，基于此，实现了对AChE的荧光检测(响应机理见图1)，方法操作简单、灵敏度高、成本低。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

多巴胺盐酸盐、氢氧化钠(NaOH)、37%盐酸(HCl)、磷酸二氢钠·二水(NaH2PO4·2H2O)、磷酸氢二钠·十二水(Na2HPO4·12H2O)、四水合氯化锰(MnCl2·4H2O)、四甲基氢氧化铵(TMA·OH)、双氧水(H2O2)、乙酰硫代胆碱碘化物(ATCh)购自阿拉丁化学试剂有限公司；乙酰胆碱酯酶、牛血清蛋白、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、青霉素酶、溶菌酶均购自康为世纪生物科技有限公司，其他试剂为市售分析纯，实验用水为超纯水。

F4600型荧光分光光度计、H-7650型透射电镜(日本日立公司)，紫外可见分光光度计(美国瓦里安公司)。

1.2 实验过程

1.2.1 F-PDA纳米粒子的合成根据文献方法[33]修改后合成F-PDA粒子：首先用超纯水配制浓度为20 mmol/L多巴胺盐酸盐溶液，再精密量取400 μL多巴胺盐酸盐溶液与320 μL 100 mmol/L氢氧化钠溶液加入7.08 mL 2 mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)中，随后在磁力搅拌器上于室温下搅拌1 h，最后加入200 μL 0.2 mol/L盐酸调节反应体系至酸性，降低反应的聚合速率，终止反应，得亮褐色聚多巴胺荧光纳米粒子(F-PDA)溶液。

1.2.2 MnO2纳米片的制备根据文献方法[34]制备MnO2纳米片：称取2.174 8 g四甲基氢氧化铵(TMA·OH)溶于18 mL超纯水中，再加入2 mL 30%(质量分数)H2O2中得到0.6 mol/L含3%(质量分数)H2O2的TMA·OH溶液。将10 mL 0.3 mol/L MnCl2溶液加入100 mL三口圆底烧瓶中，再将20 mL TMA·OH溶液(0.6 mol/L，含3% H2O2)迅速倒入三口圆底烧瓶中(该步骤需在15 s内完成)，可观察到2种无色溶液混合后迅速变成深棕色悬浮液，于室温下搅拌24 h，待反应结束后，以10 000 r/min离心10 min，再用乙醇洗涤7次(每次15 mL)，冷冻干燥后得固体MnO2纳米片。

1.2.3 AChE活性检测取750 μL二氧化锰纳米片溶液(512 μg/mL)和200 μL F-PDA纳米粒子添加至1 830 μL的PBS(pH 7.4，10 mmol/L)溶液中，并于37 ℃下孵育2 min。然后分别将120 μL ATCh溶液(50 mmol/L)和100 μL不同浓度(终浓度为0、5、10、25、100、250、500 mU/mL)的AChE与上述F-PDA-MnO2纳米复合溶液混合，在37 ℃下反应40 min，最后进行荧光测量。

2 结果与讨论

2.1 F-PDA与MnO2纳米片的表征

本氧化法制备的F-PDA分散性较好，由电子透射电镜图可见其平均粒径约18 nm(图2A)。F-PDA的紫外-可见吸收光谱图在约287 nm处有一个特征吸收峰(图2B)，其荧光激发和发射光谱在415 nm处有一个强荧光激发峰，在458 nm处发出强的荧光发射峰(图2C)，其荧光强度在激发波长为360～440 nm范围内呈先增大后降低的趋势(图2D)，最大发射波长依然为458 nm，表明F-PDA荧光纳米粒子不具有激发波长依赖性。由此可见，F-PDA荧光纳米粒子已成功制备。

MnO2纳米片是以MnCl2为原料，在TMA和H2O2下发生氧化反应获得，对其进行紫外-可见光谱表征，发现吸收光谱在300～600 nm范围出现宽的吸收峰，且在约400 nm处出现峰值，与F-PDA的发射峰有很好的重叠，是F-PDA理想的能量受体，为构建FRET体系提供了基础。为进一步确认MnO2纳米片的性质，对其进行了拉曼光谱测试(图3B)，发现在565.3、653.8 cm-1处有2个明显的峰，归因于Mn—O的拉伸振动，表明MnO2纳米片已成功制备。

设计了以F-PDA为荧光信号团、MnO2纳米片为猝灭剂的生物复合探针用于AChE检测(图4)。结果显示，在415 nm激发波长下，F-PDA在458 nm处有一强发射峰(曲线a)，当加入MnO2纳米片后，其荧光强度显著降低(曲线b)，这是由于F-PDA和MnO2纳米片之间发生了FRET效应。而在ATCh和AChE的作用下，猝灭的荧光被恢复(曲线c)，这是因为AChE能够催化ATCh水解产生了能诱导MnO2纳米片分解的硫代胆碱(TCh)，使体系荧光恢复[14]。由此可见，F-PDA@MnO2和F-PDA@MnO2-ATCh-AChE能使F-PDA荧光产生显著的猝灭和恢复，表明构建的F-PDA@MnO2荧光探针可用于AChE检测。

图4 F-PDA(a)、F-PDA@MnO2(b)和F-PDA@MnO2-ATCh-AChE(c)的荧光发射光谱图Fig.4 Fluorescence emission spectra of the F-PDA(a),F-PDA@MnO2(b) and F-PDA@MnO2-ATCh-AChE(c)

2.2 实验条件的优化

2.2.1 pH值对F-PDA荧光的影响实验考察了不同pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)对F-PDA荧光强度的影响，结果显示，F-PDA的荧光强度随pH值增大而增强，且在pH=7.0时达最大值，并在碱性条件下趋于稳定。综合考虑荧光强度和生理环境，选择pH 7.4为后续测试条件。

2.2.2 MnO2浓度对F-PDA荧光猝灭的影响探针中MnO2纳米片的浓度对F-PDA纳米颗粒的荧光强度有显著影响。在荧光共振能量转移(FRET)的基础上，F-PDA纳米颗粒在458 nm处的荧光强度随MnO2纳米片浓度的增加逐渐降低(图5A)，猝灭效率随之增加(图5B)。当MnO2纳米片质量浓度增至128 μg/mL时，猝灭效率上升缓慢，基本达到平衡。当MnO2纳米片质量浓度增至192 μg/mL，猝火效率可达84%。由于较低浓度的MnO2纳米片无法较高程度地猝灭F-PDA的荧光，而高浓度MnO2纳米片虽可完全猝灭F-PDA的荧光，但游离的MnO2纳米片优先与TCh反应导致敏感度偏低。因此，选择128 μg/mL MnO2纳米片为实验最佳浓度。

图6 不同体系下的紫外光谱图Fig.6 UV-Vis absorption spectra of different systems

图7 不同浓度乙酰胆碱酶对F-PDA@MnO2体系的荧光恢复光谱Fig.7 Fluorescence recovery spectra of different concentrations of AChE for F-PDA@MnO2 systemCAChE:0,5,10,25,50,100,250,500 mU/mL

2.2.3 底物ATCh浓度对F-PDA@MnO2荧光探针的影响

AChE可催化ATCh水解生成具有还原性的TCh，两者具有相关性，且化学计量比为1∶1。因此，实验根据文献方法合成了TCh[35]，研究底物ATCh浓度对探针的影响。结果显示，在添加1 mmol/L TCh后，可明显观察到F-PDA荧光的恢复，继续增大TCh浓度至2 mmol/L，F-PDA的荧光恢复达到最大值。因此，实验选择底物ATCh浓度为2 mmol/L。为了验证F-PDA荧光恢复机理，对不同体系的紫外-可见吸收光谱进行了扫描(图6)。由图可见，F-PDA和MnO2纳米片分别在287 nm(曲线a)和400 nm(曲线b)处有一特征吸收峰。当F-PDA与MnO2复合后，体系兼具两者的特征吸收峰(曲线c)。加入TCh后，MnO2的特征吸收峰消失(曲线d)，Mn2+的吸收光谱未显示出任何吸收峰(曲线e)，F-PDA@MnO2-TCh体系的吸收光谱非常接近F-PDA或F-PDA-Mn2+的吸收光谱(曲线f)，由此证明TCh能将MnO2纳米片还原为Mn2+。

2.3 复合物探针对AChE的检测

在最优实验条件下，采用F-PDA@MnO2复合物探针对AChE进行检测(图7)。结果显示，随着AChE浓度的增加，体系荧光强度逐渐增强，5.0 mU/mL AChE即可观察到明显的荧光恢复，100 mU/mL AChE可使F-PDA的荧光恢复90%以上，且在5.0～100 mU/mL范围内，体系荧光强度与AChE浓度呈良好的线性关系，线性方程为IF=5.554CAChE+326.769(r2=0.996)，由此计算得检出限(LOD,S/N=3)为0.14 mU/mL，表明探针可灵敏检测AChE。

在优化条件下，向PBS缓冲溶液中加入不同浓度(30、60、90 mU/mL)的AChE标准溶液进行回收率研究。结果显示，其加标回收率为89.5%～120%，相对标准偏差(RSD，n=3)为1.6%～2.5%(表1)。表明该方法可应用于缓冲溶液中AChE的检测。

2.4 探针的选择性

在F-PDA@MnO2检测体系中分别加入20 μg/mL过氧化物酶(HRP)、葡萄糖氧化酶(GOx)、青霉素酶(PCN)、溶菌酶(Lys)、牛血清蛋白(BSA)考察探针的选择性。结果显示所加物质对体系荧光强度几乎无影响，不干扰AChE的测定，说明该体系对AChE具有较好的选择性。

表1 乙酰胆碱酶的回收率Table 1 Recoveries of acetylcholinesterase

3 结 论

本研究以多巴胺为原料，通过氧化法合成了具有强烈荧光的水溶性聚多巴胺纳米粒子，基于MnO2纳米片复合的 F-PDA@MnO2构筑了增强型荧光探针用于AChE的高灵敏检测。结果显示，所制备的F-PDA@MnO2荧光探针具有灵敏度高、选择性好及检出限低等优点，可为拓展F-PDA纳米粒子在其他生物分子检测方面的应用提供数据参考。