高效液相色谱-串联质谱法同时测定儿童彩泥类造型玩具中3种异噻唑啉酮类防腐剂

王 瑾，任洁芳，张东雷，周 敏，李祖光，张慧敏

(1.浙江省产品质量安全检测研究院，浙江 杭州 310018;2.浙江工业大学 化学工程学院，浙江 杭州 310014)

异噻唑啉酮类化合物是一种广谱、高效、非氧化性杀菌防腐剂，该化合物稳定性强、使用成本低，广泛应用于玩具、纺织品、造纸、皮革、涂料、化妆品等行业[1-5]，其中常见的有2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MI)、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMI)和1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)等。研究表明，该类物质是一类致敏剂，可能引起过敏或皮炎等反应，过量接触还可导致皮肤灼伤，其中以MI和CMI的致敏性和刺激性最强[6-7]。国内外对食品接触材料、化妆品、玩具等日用品中异噻唑啉酮类防腐剂的使用制定了严格的法规标准。欧盟玩具协调标准EN 71-9-2005[8]中明确限定了MI、CMI和BIT在玩具皮革、玩具中的液体、造型粘土及类似物等玩具材料中的限量分别为10、10、5 mg/kg，且MI和CMI的总限量为15 mg/kg。

目前，异噻唑啉酮类物质的检测方法主要有分光光度法[9]、气相色谱法[10]、气相色谱-质谱联用法[11-13]、液相色谱[14-15]和LC-MS/MS[16-18]等。欧盟玩具协调标准EN 71-10[19]和EN 71-11[20]分别详细说明了异噻唑啉酮类化合物的提取和测定方法，以去离子水萃取玩具材料中的目标物后，采用液相色谱-紫外检测进行测定，但该方法灵敏度低，方法定量下限即为限量要求，且易出现假阳性，无法满足检测需求。而LC-MS/MS因分析时间短、选择性好、灵敏度高，更适用于复杂体系中高沸点或热稳定性差等物质的测定，同时随着色谱技术的不断发展，仪器普及率也较高，样品预处理也相对简单。然而，应用HPLC-MS/MS测定彩泥类造型玩具中异噻唑啉酮类物质的检测未见报道。因此，本文建立了一套简单、快速、准确测定儿童彩泥类造型玩具中异噻唑啉酮类物质的HPLC-MS/MS分析方法，该方法可满足欧盟玩具标准的相关限量要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

QTRAP®5500三重四极杆串联质谱仪(美国AB公司)，LC-20ADXR高效液相色谱仪(日本岛津公司)，Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)，台式高速离心机(Sigma公司)，涡旋振荡器(IKA公司)，超声波清洁器(上海科导公司)，电子天平(梅特勒-托利多公司)。

标准品：MI(纯度97.01%)，CMI(纯度98.51%)，BIT(纯度99.58%)，均购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

甲醇(色谱纯，Merck 公司)，乙酸铵(色谱级，≥99.0%，Aladdin公司)，实验用水均符合GB/T 6682-2008[21]的实验室一级用水。

1.2 标准溶液的配制

标准储备液：分别准确称取10.0 mg(精确至0.1 mg)MI、CMI、BIT标准品于10 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，配制成1 000 mg/L单标储备液，于-18 ℃棕色玻璃瓶中保存。

混合标准中间液：分别准确移取1 000 mg/L单标储备液100 μL于10 mL容量瓶，甲醇稀释定容，得10 mg/L混合标准溶液，于4 ℃棕色玻璃瓶中保存；再将10 mg/L混合标准溶液用甲醇稀释至1 mg/L，得1 mg/L混合标准溶液，现配现用。

空白基质提取液：样品按照“1.3”条件进行前处理和仪器分析，确定样品为阴性样品，其提取液可作为空白基质提取液。

溶剂混合标准溶液的配制：准确吸取1 mg/L混合标准溶液，以甲醇-水(1∶1，体积比)稀释，配制成1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列混合标准工作溶液。

基质混合标准溶液的配制：准确吸取1 mg/L混合标准溶液，以空白基质提取液稀释，配制成1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列基质混合标准工作溶液。

1.3 样品前处理

准确称取0.50 g试样(精确至0.01 g)于50 mL聚丙烯离心管内，加入15.0 mL甲醇，超声提取30 min，8 000 r/min离心5 min，准确移取上清液1.0 mL，用水1∶1稀释，涡旋混匀后过0.22 μm有机滤膜，上机测定。

若按上述前处理过程，提取液中分析物浓度超出方法的线性范围时，则需用甲醇-水(1∶1，体积比)进行必要的稀释处理。

1.4 LC-MS/MS条件

液相色谱条件：色谱柱Kinetex®C18柱(100 mm×3 mm，2.6 μm)；柱温：35 ℃；进样量：2 μL；流速：300 μL/min；流动相：A为甲醇，B为水，梯度洗脱：0～2.0 min，20%A；2.0～4.0 min，20%～80%A；4.0～8.0 min，80%A；8.0～9.0 min，80%～20%A；9.0～10.0 min,20%A。

表1 MI、CMI、BIT的质谱采集参数Table 1 MS/MS acquisition parameters of MI，CMI and BIT

*quantitative ion pair

质谱条件：离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描模式：正离子模式；检测方式：多反应监测(MRM)；离子源温度：550 ℃；雾化气：0.38 MPa；辅助气：0.38 MPa；气帘气：0.24 MPa；喷雾电压：5 000 V，质谱采集参数见表1。

2 结果与讨论

2.1 质谱-色谱条件的优化

2.1.1 质谱条件的优化MI、CMI、BIT 3种化合物的结构中均含氮基团，易结合质子得到正离子，因此选择电喷雾电离正离子模式(ESI+)。分别配制50 μg/L的MI、CMI、BIT单标溶液，采用针泵进样模式，进行一级母离子扫描，获得准分子离子峰[M+H]+。选择3种化合物的母离子(MI：m/z115.9、CMI：m/z149.9、BIT：m/z152.0),对每个母离子分别进行二级碎片扫描，得到碎片的离子信息，选取2个响应较大的碎片作为子离子，建立MRM离子对，分别优化DP、CE电压值，3种化合物的质谱参数见表1。

图1 MI、CMI和BIT的总离子流色谱图Fig 1 Total ion chromatogram of MI，CMI and BIT

2.1.2 色谱条件的优化实验采用Kinetex®C18柱(100 mm×3 mm，2.6 μm)进行分离，以甲醇-水为流动相，考察了甲醇-水的两相比例及梯度洗脱程序，发现以甲醇-水(20∶80)、甲醇-水(30∶70)等度洗脱时，BIT的峰形差；当采取梯度洗脱程序时，3种异噻唑啉酮类物质在10 min内有较好的分离度和峰形。实验同时考察了相同梯度洗脱条件下，甲醇-水和甲醇-2 mmol/L乙酸铵水溶液的分离效果，结果表明，甲醇-2 mmol/L乙酸铵梯度洗脱时，3种化合物的峰形较好，可有效降低基线背景，但响应强度低；而以甲醇-水梯度洗脱时，3种化合物的峰形好、响应强度高。因此，最终选用甲醇-水作为流动相，在梯度洗脱程序下，10 min内可完成分析，MI、CMI、BIT的保留时间分别为1.91、4.86、5.59 min。图1为优化实验条件下，5.0 μg/L异噻唑啉酮类化合物混合标准溶液的总离子流色谱图。

2.2 样品前处理条件的优化

2.2.1 提取溶剂的优化选择超轻粘土、水晶泥阳性样品进行提取溶剂的优化，由于异噻唑啉酮类化合物易溶于水、甲醇等有机溶剂，因此本实验比较了水、甲醇、甲醇-水(1∶1，体积比)3种提取溶剂的提取效果。结果显示，甲醇的提取效率明显优于其他两种溶剂，因此选择甲醇作为最佳提取溶剂。

2.2.2 超声提取时间的选择以甲醇为提取溶剂，比较了不同超声提取时间(5、10、20、30、40 min)对3种化合物提取效率的影响。结果显示，随超声时间的延长，3种化合物的提取效率增大，超声30 min后，继续延长超声时间，3种化合物的提取效率基本不变，故选择最佳超声时间为30 min。

2.3 方法学评价

2.3.1 基质效应基质效应是指样品中除目标物以外的组分对目标物测定值的影响，一般有基质增强效应和基质减弱效应。在色谱-质谱联用分析中，需对基质效应进行评价，并采取措施，保证结果的准确可靠。降低基质效应的常见方法有稀释样品溶液、增加净化步骤、优化色谱分离条件、采用同位素内标、配制基质匹配标准溶液等[22]。本实验考察了3种化合物在两类造型玩具(水晶泥、超轻粘土)中的基质效应。采用标准曲线斜率比较法，即使用相对响应值法研究不同样品对3种异噻唑啉酮类防腐剂的基质效应，根据公式Me=Am/Ac×100%进行量化评估，式中Me表示基质效应，Am表示基质匹配标准曲线斜率，Ac表示纯溶剂标准曲线斜率。当Me<100%时，为基质抑制效应；当Me大于100%时，为基质增强效应。当90%≤Me≤110%为弱基质效应，无需采取补偿措施。结果显示，对于水晶泥样品，MI的基质效应最明显；对于超轻粘土样品，MI、CMI的基质效应明显(见表2)。为了消除基质效应的影响，本研究采用基质匹配标准曲线进行定量分析。

针对异噻唑啉酮类防腐剂含量较高的样品，提取液上机浓度已超出标准曲线的线性范围，需对提取液进行必要的稀释处理。经实验研究发现，当提取液稀释10倍后进样时，基质效应影响较小，可不考虑基质效应的影响。

表2 基质匹配标准曲线与溶剂标准曲线的比较Table 2 Comparison of matrix-matched calibration and solvent calibration

*:no data

2.3.2 线性范围与检出限在优化条件下，按“1.2”配制MI、CMI、BIT的系列浓度基质混合标准溶液，经LC-MS/MS测定后，以定量离子峰面积(Y)为纵坐标，分析物质量浓度(X，μg/L)为横坐标，绘制标准曲线。MI、CMI、BIT在甲醇-水、水晶泥基质、超轻粘土基质中的线性方程、相关系数(r)、检出限(LOD,S/N=3)及定量下限(LOQ,S/N=10)列于表2。结果显示，MI、CMI、BIT均在1.0～100.0 μg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数均不小于0.999 0，MI、CMI和BIT的仪器定量下限分别为0.5、0.5、1.0 μg//L，方法检出限分别为10、10、20 μg/kg，方法定量下限分别为30、30、60 μg/kg。

2.3.3 回收率与相对标准偏差在水晶泥、超轻粘土阴性样品中分别添加0.06、0.6、2.0 mg/kg混合标准溶液，指画颜料阳性样品中分别添加4、8、10 mg/kg混合标准溶液，每个浓度水平加标5次，按优化方法进行加标回收率实验。考虑基质效应，其中水晶泥、超轻粘土阴性样品用基质匹配标准曲线校正，指画颜料阳性样品用甲醇-水配制的标准曲线校正，并计算回收率和相对标准偏差(RSD)，结果见表3。结果表明：MI、CMI、BIT的平均回收率为80.2%～109%，RSD不大于8%，方法的准确度及精密度均满足日常检测的需求。

表3 不同基质中 MI、CMI和BIT的回收率及相对标准偏差Table 3 Recoveries and RSDs of MI,CMI,BIT in different matrixes

*no detected

2.3.4 实际样品的检测取市售15种儿童彩泥类造型玩具，采用本方法测定样品中MI、CMI和BIT含量。结果显示，7批次产品中检出异噻唑啉酮类防腐剂(如表5)，检出样品包括水晶泥类、超轻粘土类和指画颜料类，其中有3批次超出了欧盟玩具指令中规定的限量要求。

表5 7种儿童彩泥类造型玩具中3种异噻唑啉酮类防腐剂的含量Table 5 Contents of three isothiazolinone preservatives in 7 samples of modeling toys

*no detected

3 结 论

本文建立了HPLC-MS/MS快速测定儿童彩泥类造型玩具中3种异噻唑啉酮类防腐剂的分析方法。该方法简单、灵敏，具有较高的准确性和重现性，方法的检出限和定量下限可满足欧盟玩具协调标准EN 71-9:2005+A1:2007中对3种防腐剂的限量要求。应用本方法对15批彩泥类造型玩具样品进行了检测，检出7批次阳性样品，其中3批次超出限量要求，说明该类玩具在生产过程中存在超量使用3种异噻唑啉酮类防腐剂的情况，存在安全风险，政府应加强监管。