超声提取/超高效液相色谱-串联质谱法测定土壤中乙酰甲胺磷与甲胺磷的研究

魏立菲，李 逸，张 荧

(珠江流域水环境监测中心，广东 广州 510611)

甲胺磷(Methamidophos)是一种毒性强、污染大的高效有机磷杀虫剂，我国自2008年1月起全面禁止甲胺磷的生产和使用。乙酰甲胺磷(Acephate)，学名O,S-二甲基-N-乙酰基-硫代磷酰胺，为甲胺磷的乙酰化产物，因具有高效、低毒、廉价等特点而作为甲胺磷的替代物之一在农业领域广泛使用。乙酰甲胺磷由甲胺磷乙酰化制得，其制剂中有少量甲胺磷存在，同时，乙酰甲胺磷的制剂产品稳定性差，在降解过程中能代谢出甲胺磷[1]。我国农业部于2002年6月5日发布的第199号公告中规定禁止甲胺磷在蔬菜上使用，然而近年来甲胺磷农药残留超标事件时有发生，这与乙酰甲胺磷的使用密切相关。为保障农产品质量安全和农业环境健康，有必要对土壤中乙酰甲胺磷和甲胺磷的残留量进行监控。

目前，检测乙酰甲胺磷和甲胺磷的常用方法有气相色谱法(GC)[2-7]和气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[8-9]。乙酰甲胺磷和甲胺磷极性强、热不稳定、易分解，易在GC进样口被衬管和色谱柱前端吸附及降解，对仪器系统洁净度要求较高，易出现进样不出峰、峰信号弱、峰形差的情况，而土壤样品基质复杂，易污染仪器，因此用GC或GC-MS分析土壤样品中乙酰甲胺磷和甲胺磷的难度较大。文献[10-12]使用高效液相色谱-紫外法(HPLC-UV)进行检测，但灵敏度不够，且紫外检测无法准确定性[13-14]。

本文采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱(UPLC-MS/MS)检测，对比了不同前处理方法，建立了土壤中乙酰甲胺磷和甲胺磷的超声提取/UPLC-MS/MS分析方法。该法简便高效、灵敏度高、回收率好、定性准确，可满足土壤中乙酰甲胺磷和甲胺磷残留的检测要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UPLC I-Class/Xevo TQ-S超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪(美国Waters公司)；MassLynx V4.1工作站；S120H超声波振荡器(德国Elma公司)；Soxtec 2050全自动索氏抽提系统(丹麦FOSS公司)。50 mL螺口尖底带盖离心管(聚丙烯材质)；聚醚砜滤膜(直径13 mm，孔径0.22 μm，津腾公司)；化学分析滤纸(双圈牌)。

标准物质：乙酰甲胺磷(GSB05-2322-2016)、甲胺磷(GSB05-2289-2016)的质量浓度均为100 mg/L(以丙酮为溶剂，农业部环境保护科研监测所)；甲醇、丙酮(色谱纯，Merck公司)；乙酸铵、甲酸(优级纯，Merck公司)；超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm，美国Millipore公司)。土壤样品：采自增城迟菜心菜地。

1.2 前处理方法

1.2.1样品采集与保存选取代表性的菜地，采集表层土壤，用镊子剔除植物和叶等有机残体，风干过20目筛，置于阴凉干燥处保存。

1.2.2超声提取称取10.0 g新鲜土壤样品于50 mL带盖离心管中，加适量无水硫酸钠混匀，加入20.0 mL甲醇，旋紧离心管盖。超声萃取30 min后静置30 min，取上清液过0.22 μm滤膜于2 mL样品瓶中，待分析。

1.2.3全自动索氏抽提称取10.0 g新鲜土壤样品于抽提纸筒中，加适量无水硫酸钠混匀，以脱脂棉覆盖样品，量取80 mL甲醇(或丙酮)至抽提杯中。将装有样品的抽提纸筒、抽提杯放入抽提装置。设定加热板温度160 ℃(丙酮用120 ℃)，浸没沸腾30 min，回流淋洗60 min后，抽提杯中剩余约5 mL溶剂，将残液全部转移至20 mL比色管中，加甲醇定容至刻度，摇匀后取溶液过0.22 μm滤膜于2 mL样品瓶中，待分析。

1.3 标准溶液的配制

准确移取100 mg/L的乙酰甲胺磷、甲胺磷溶液各0.1 mL于同一10 mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度，混匀，得1.00 mg/L的乙酰甲胺磷、甲胺磷混合中间溶液。再用甲醇将混合中间溶液稀释成质量浓度分别为0.002、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.0、15.0、20.0 μg/L的乙酰甲胺磷、甲胺磷混合标准工作溶液。

1.4 色谱条件

Waters超高效液相色谱柱(ACQUITY UPLC HSS T3，2.1 mm×100 mm×1.8 μm)；流动相：甲醇-10 mmol/L乙酸铵水溶液(体积比65∶35)；等度洗脱；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；运行时间：2 min；进样体积：1 μL。

1.5 质谱条件

采用多反应监测(MRM)模式检测，外标法定量。离子化方式为电喷雾正离子化(ESI+)，毛细管电压为1 kV，离子源温度为150 ℃，脱溶剂温度为500 ℃，脱溶剂气流量为650 L/h，锥孔气流量为150 L/h，雾化气压力为700 kPa，碰撞气流量为0.15 mL/min。乙酰甲胺磷和甲胺磷的其他质谱参数见表1。

表1 乙酰甲胺磷和甲胺磷的MRM分析参数Table 1 MRM analytical parameters of acephate and methamidophos

*quantitative ion

图1 加标土壤(40.0 μg/kg)提取液中乙酰甲胺磷和甲胺磷的选择离子流图及TIC谱图

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

比较了Waters超高效液相色谱柱HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)和BEHC18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)对目标物的分离效果，发现两种色谱柱均无法分离甲胺磷和乙酰甲胺磷,但由于2种化合物有各自的MRM特征离子对，能提取出独立的选择离子流图，因此保留时间重叠并不影响对2种化合物的定性和定量。在相同的流动相条件下，HSS T3色谱柱对极性大的乙酰甲胺磷和甲胺磷有更强的保留，且峰形更好。同时考察了甲醇-水、甲醇-10 mmol/L乙酸铵水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相等度洗脱的分离效果，结果显示以甲醇-10 mmol/L乙酸铵水溶液(65∶35)为流动相时的峰形和灵敏度最佳。综上所述，本实验选择HSS T3色谱柱，以甲醇-10 mmol/L乙酸铵水溶液(65∶35)为流动相等度洗脱，所得选择离子流图及TIC图见图1。

2.2 前处理方法的选择

比较了超声提取(提取液过滤纸)、超声提取(提取液不过滤纸)、全自动索氏抽提(以甲醇为溶剂160 ℃下提取)和全自动索氏抽提(以丙酮为溶剂120 ℃下提取)4种提取条件对土壤中乙酰甲胺磷和甲胺磷回收率的影响(表2)。结果显示，对于全自动索氏抽提法，由于乙酰甲胺磷和甲胺磷有一定挥发性，且均为热不稳定化合物，在较高温度下提取易损失，因此提取温度越高，回收率越低。而超声提取法在室温下进行，避免了因加热导致的损失，因此回收率明显优于全自动索氏抽提法。由于滤纸会吸附少量的乙酰甲胺磷和甲胺磷，导致超声后提取液用滤纸过滤的回收率偏低。还比较了不同超声时间(10、20、30、60 min)对测试结果的影响，结果显示回收率无明显差异。实验最终选择土壤样品经超声提取30 min后静置30 min，直接(不过滤纸)取上清液过滤膜进行检测，该前处理方法简单快捷，回收率也更满意。

表2 不同提取条件下乙酰甲胺磷和甲胺磷的回收率Table 2 Recoveries of acephate and methamidophos under different extraction conditions

2.3 基质效应

在土壤等复杂样品中，基质效应往往对分析物的检测产生显著干扰[12]。本实验在多份空白土壤中加入甲醇，按照“1.2.2”方法处理土壤样品后，用所得提取液配成质量浓度分别为0.2、2、20 μg/L的乙酰甲胺磷和甲胺磷混合溶液进行分析(响应峰面积A)，同时以甲醇配制上述3种质量浓度的对照液进行分析(响应峰面积A′)，以2种方法所得峰面积的比值(A/A′)表示基质效应。结果显示，3种质量浓度样品的峰面积非常接近，A/A′≈1，说明本方法基质效应影响小，无需净化可直接进样。

2.4 线性关系、检出限与定量下限

按“1.3”配制标准系列工作溶液，按照本法进行测定，以乙酰甲胺磷或甲胺磷的峰面积(Y)对其质量浓度(X，μg/L)进行线性回归。结果表明，乙酰甲胺磷和甲胺磷的线性范围均为0.002～20.0 μg/L，线性方程分别为Y=44 991.5X+3 529.96和Y=118 393X+43.38，相关系数(r2)分别为0.999 9、0.999 5。

空白土壤中添加0.012 μg/kg的乙酰甲胺磷、甲胺磷标准溶液，按照本方法平行测定7份，计算标准偏差(S)。按照MDL=t(n-1,0.99)×S确定方法检出限，当n=7、置信度为99%时，t=3.143；以4倍方法检出限作为定量下限[15]。得到土壤中乙酰甲胺磷和甲胺磷的检出限分别为0.004 9、0.003 4 μg/kg，定量下限分别为0.020、0.014 μg/kg。

2.5 方法回收率与相对标准偏差

对空白土壤样品进行0.400、4.00、40.00 μg/kg 3个浓度水平的加标实验，按“1.2.2”方法对样品进行处理，每个浓度平行测定6份，考察方法回收率和相对标准偏差(RSD)，结果见表3。由表3可知，乙酰甲胺磷、甲胺磷在低、中、高3个浓度水平下的加标回收率分别为83.0%～91.5%和88.0%～94.8%，RSD分别为2.3%～4.8%和1.8%～4.2%。

表3 空白土壤中乙酰甲胺磷和甲胺磷的加标回收率和相对标准偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of acephate and methamidophos from blank soil samples at different spiked levels(n=6)

2.6 实际样品测定

采用本方法测定了广东省增城市小楼镇迟菜心种植基地24个土壤样品的乙酰甲胺磷和甲胺磷含量，结果均未检出，表明该地区菜地土壤样品未受目标物污染。

3 结 论

本文建立了超声提取/UPLC-MS/MS检测土壤中乙酰甲胺磷和甲胺磷的方法，样品经超声提取、过滤膜后(无需浓缩)直接上机测试，简化了前处理流程，提高了测试效率，且避免了前处理过程繁琐导致的回收率损失。方法简便高效、回收率好、灵敏度高、定性准确，可用于大量实际土壤样品中乙酰甲胺磷和甲胺磷含量的检测。