Aerolysin蛋白纳米孔道直接检测单个DNA碱基修饰

路 瑶,胡正利,应佚伦,龙亿涛

(华东理工大学 化学与分子工程学院 结构可控先进功能材料及其制备教育部重点实验室，上海 200237)

根据不同待测物分子穿过纳米孔道时造成的离子流阻断时间和程度不同，纳米孔道单分子电化学技术可在单分子水平实时获取待测物分子的结构、电荷、尺寸等信息[1-3]。生物纳米孔道因其原子精度的稳定结构和超高空间限域分辨能力，近年来被广泛应用于核酸、多肽、蛋白等生物分子的检测研究[4-13]。Aerolysin 是一类来自嗜水气单胞菌属的β-成孔毒素，其水溶性单体在水溶液中能够自发地聚合成七聚体的形态，形成形似蘑菇的跨膜蛋白孔道[14]。相比于其他种类应用更为广泛的生物纳米孔道，如a-Hemolysin(a-HL)和Mycobacterium smegmatis porin A(MspA)，Aerolysin 纳米孔道具有更窄的孔径(约1 nm)[15]。此独特结构为单分子穿孔提供了更狭小的限域空间，提高了对单个碱基差异电流阻断信号的分析能力[16]。Aerolysin 的另一个特点是其孔道内具有带正电荷的氨基酸残基，可增强核酸分子与孔道内壁的静电相互作用，减慢核酸分子的穿孔速率，使得电流阻断时间增长，有利于获得单个核酸分子更为准确的细节信息[9,17-18]。这些独有的优势使得 Aerolysin 纳米孔道在生物分子的分析中具有良好的应用前景。本课题组前期研究中利用野生型Aerolysin生物膜蛋白，在无需对纳米孔道蛋白突变的情况下实现了单个核苷酸超灵敏分辨，且对单个单链DNA(ssDNA)单碱基长度差异的分辨率高达12%～17%[9]；该研究通过使用Aerolysin直接识别DNA寡聚体上的4种碱基，在此过程中无需固定DNA、组装适配体、酶处理等操作，具有低成本、无标记、直接检测、无酶作用的优势[19]。在此基础上，本文在ssDNA模板上设计引入线性侧链基团，在Aerolysin纳米孔道中实现了与其它两种未修饰ssDNA之间单个碱基差异的非标记直接识别，进一步提高了Aerolysin纳米孔道的单碱基测量能力。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

1,2-二植烷酰基磷脂(1,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，美国Avanti Polar Lipids公司)；乙二胺四乙酸(≥99%)、三羟甲基氨基甲烷(Tris,≥99%)均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化钾(≥99%)、癸烷(≥99%)均购于美国Sigma-Aldrich有限公司；实验用水为Milli-Q纯水仪(Millipore)制备的超纯水(电导率为18 MΩ·cm-1,25 ℃)；实验所用DNA分析物Poly(dA)4-alkynyl、Poly(dA)5和Poly(dA)4均购于上海生工生物工程股份有限公司；Aerolysin表达、纯化、组装与文献报道一致[20-21]。直径1.0 mm的电极银丝购于英国Alfa Aesar公司。

纳米孔检测微池购于美国Warner Instruments公司，由 cis 检测池和 trans 检测池构成。其中trans检测池上支撑磷脂膜的微孔直径为50 μm。纳米孔道实验检测装置包括：Axon Axopatch 200B电流放大器，AxonDigidata 1440A数模转换器，Clampex 10.7数据记录软件，ClampFit 10.7数据处理软件(美国Axon Instruments公司)。

1.2 实验方法

1.2.1溶液的配制使用水配制pH 8.0的电解质溶液，其中含有1 mol/L KCl、10 mmol/L Tris、1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)。使用水配制pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液，其中含有10 mmol/L Tris、1 mmol/L EDTA。Proaerolysin溶于Tris-HCl缓冲溶液并配制成浓度为10 μg/mL蛋白溶液，纳米通道实验前加入胰蛋白酶活化[22]；1,2-二植烷酰基磷脂溶于癸烷并配制成浓度为2 mg/mL磷脂溶液；DNA溶于Tris-HCl缓冲溶液并配制成浓度为100 μmol/L的溶液。

1.2.2磷脂双层膜的构建用磷脂刷蘸取少量磷脂溶液在纳米孔trans检测池50 μm微孔内外均匀涂抹磷脂溶液。通过提拉法形成磷脂双分子层膜，并通过膜电容及击穿电压监测其厚度及机械强度。本实验通过一对Ag/AgCl电极向磷脂双分子层膜两端施加驱动电压并指定cis端为虚拟地，cis与trans检测池中分别加入含1 mol/L KCl的10 mmol/L Tris-EDTA溶液(pH 8.0)。

1.2.3单个生物纳米孔道实验形成磷脂双层膜后，在cis端检测池中注入0.5 μL Aerolysin蛋白溶液。单个Aerolysin在磷脂双分子层膜上自组装形成一个稳定的纳米通道时,离子流将产生量子化阶跃即得到开孔电流信号。单个Aerolysin 纳米孔道在22 ℃、1 mol/L Tris-KCl电解质溶液、100 mV 电压条件下产生开孔电流约为48 pA。随后,将待测生物分子加入检测池中,在5 kHz滤波下以100 kHz采样频率进行信号记录。本实验3种分析物Poly(dA)4-alkynyl、Poly(dA)5和Poly(dA)4在cis端检测池体中浓度均为2 μmol/L。实验温度控制在(22±2) ℃。

1.2.4数据处理数据处理时,将阻断电流小于10 pA的事件视为噪音干扰,不做进一步分析。每一个阻断电流大于10 pA的事件均通过MOSAIC软件处理得到其阻断电流及阻断时间。进一步，利用Origin软件(OriginPro 9.1)获得单分子事件的阻断时间统计直方图及阻断电流统计直方图。

2 结果与讨论

Poly(dA)5是由5个腺嘌呤核苷酸组成的寡聚核苷酸，在以往Aerolysin生物纳米孔道单分子研究中发现其信号具有阻断电流分布窄、电流分辨率高的特点[9]。本研究以寡聚核苷酸Poly(dA)5为模板，如图1A所示，在其中间位点引入炔基衍生物线性侧链从而设计单碱基位点变异的寡聚核苷酸Poly(dA)4-alkynyl，引入炔基衍生物线性侧链后其相对分子质量相较Poly(dA)4增加251.1，相对分子质量增幅小于1个腺嘌呤核苷酸。进一步设计将结构差异1个腺嘌呤核苷酸的Poly(dA)4与Poly(dA)5、Poly(dA)4-alkynyl对照实验，以研究单个碱基修饰对纳米孔道特征阻断电流的影响。

根据文献报道[23]，ssDNA分子从 cis 端进入且穿过Aerolysin 纳米孔道所造成的过孔信号具有电流阻断呈现集中高斯分布、电流阻断时间长(>0.13 ms)的特征；而ssDNA碰撞Aerolysin纳米孔道cis端入口后最终返回cis 端溶液的单分子事件会产生尖刺状的离子流信号，此类信号产生的电流阻断时间短(<0.13 ms)且电流阻断程度分布范围较广。本研究对阻断时间大于0.13 ms的分子过孔信号进行分析，将单个阻断电流信号的电流值定义为I,Aerolysin 纳米孔道的开孔电流定义为I0,则单个ssDNA分子停留在Aerolysin孔道内造成的阻断电流程度为I/I0(Residual Current%)，I/I0值越小代表阻断程度越大；Duration代表分子穿孔造成电流阻断所持续的时间。如图1B所示，3种ssDNA分子在100 mV电压下穿过纳米孔道均产生特征的阻断电流信号。其各自阻断电流幅值恒定且与其他2种分子在阻断程度和阻断时间上有显著差异。以阻断时间为纵坐标,阻断程度为横坐标，统计绘制100 mV 电压下阻断电流的散点图(如图1C)。将阻断程度数据进行统计分析，3种分析物在100 mV下阻断程度直方图均符合高斯分布，Poly(dA)5和Poly(dA)4的I/I0值分别为0.45和0.52。因此，在ssDNA结构上多1个腺嘌呤核苷酸使得纳米孔阻断电流程度I/I0值减小了0.07，即阻断电流I增强了3 pA。而Poly(dA)4-alkynyl的阻断程度I/I0值为0.38，其相较于Poly(dA)5的I/I0值减小了0.07，阻断电流I增强了3 pA。因此，单个炔基侧链基团的引入对阻断电流程度的增强效果等同于增加1个腺嘌呤核苷酸。更重要的是，单个碱基修饰的Poly(dA)4-alkynyl分子的阻断电流高斯峰半峰宽较Poly(dA)5减小了44%。因此，单碱基修饰结构有效提升了纳米孔道对ssDNA分子的分辨能力(图2A～C)。

图1 ssDNA通过Aerolysin纳米孔道实验的原理图

如图2D～E所示，相较于Poly(dA)5和Poly(dA)4，Poly(dA)4-alkynyl分子中炔基侧链的引入延长了单个核酸分子的阻断时间，其阻断时间拟合高斯峰中心为41.0 ms，与未修饰线性侧链的Poly(dA)5(拟合高斯峰中心为6.2 ms)、Poly(dA)4(拟合高斯峰中心位于6.6 ms)相比，将单个ssDNA通过纳米孔的速度减缓约80%，使短链ssDNA在Aerolysin纳米孔道中的时间分辨提高近7倍。炔基侧链的引入使得寡聚腺嘌呤核苷酸上具有1个碱基位点的结构变异，其单碱基水平上的结构和电荷改变可以通过Aerolysin纳米孔道实现灵敏检测。

图3 Poly(dA)4-alkynyl在不同电压下的阻断电流程度直方图

3 结 论

本文利用单个Aerolysin纳米孔道在无需标记、无需扩增的条件下可直接分辨3种具有单个碱基差异的单链DNA。实验结果显示，具有单个炔基侧链基团修饰的单个ssDNA在限域空间内与Aerolysin纳米孔道的相互作用增强，电流阻断程度增大，阻断时间较未修饰ssDNA有效延长，且电流阻断高斯峰半峰宽显著减小。因此，单碱基侧链的引入增强了Aerolysin纳米孔道对单个核酸分子电流的分辨能力，有望推动Aerolysin纳米孔在DNA直接测序及表观修饰检测中的应用。