胶体金修饰电极测定鱼样中组胺的方法研究

周婵媛，赵晓娟*，王春利，曾晓房，白卫东

(1.仲恺农业工程学院 轻工食品学院，广东 广州 510225；2.中华人民共和国江门海关，广东 江门 529000)

生物胺(Biogenic amines，BAs)是一种相对分子量较低的有机化合物，其化学结构中至少含有一个氮原子，主要由其前体氨基酸通过相应的氨基酸脱羧酶代谢[1]生成，广泛存在于食物[2-3]和饮料中[4-5]。生物胺通常被认为是鱼类及其产品或贝类中微生物衰变程度的关键性化合物[6-7]，而组胺(Histamine)是这类化合物中生物化学活性最强的化合物之一[8]，也是人体体液中重要的生物标志物[9-10]。通常人们无法从鱼的颜色和气味观察到组胺的存在，但是组胺会引起鲭鱼综合征：人体摄入过量的组胺可引起特定的不良生理和毒性作用，如对心脏、运动神经元、平滑肌和胃产生负面影响[11]，组胺通常被认为是食品生产、储存和运输过程中用于质量控制监测的生物标志物之一[12]。因此，有必要建立一种快速、灵敏地测定组胺的分析方法。

胶体金(AuCS)又称纳米金溶胶，是由氯金酸被还原成金后形成的颗粒悬浮液，其分散相粒子直径多在1～100 nm，且均匀、稳定、呈单一分散状悬浮在溶液中，形成一种纳米金胶体溶液，其颜色呈桔红色到紫红色[13]。纳米金具有大的比表面积、表面等离子体共振特性、小尺寸效应、催化特性、光学特性以及独特的生物亲和性等性能，在工业催化、生物医药、生物分析化学、食品安全快速检测等多个领域有着广泛的应用[14-16]。

本文采用胶体金修饰的玻碳电极(AuCS/GCE)，利用电流～时间曲线法(I～t法)建立了一种简便、灵敏地检测组胺的分析方法，优化了底液的pH值和组胺的电化学测试方法及条件，考察了修饰电极的电化学性能，并对带鱼和黄花鱼样品中的组胺含量进行测定，以评价该法在实际应用中的适用性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

KQ118超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Vortex Mixer V6漩涡混匀器(美国安胜科技有限公司)；HR/T20M台式高速冷冻离心机(湖南赫西仪器装备有限公司)；BSA124S分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；QSJ-A01F2切碎机(小熊电器股份有限公司)。采用玻碳电极测试组胺的实验均在CHI660E电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)上连接三电极系统模式下进行：玻碳电极为工作电极，Ag/AgCl(饱和KCl溶液)电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，文中所有电势均以饱和Ag/AgCl电极为参比。

组胺二磷酸盐、苯乙胺、精胺、腐胺二盐酸盐、酪胺盐酸盐、亚精胺磷酸盐六水合物、尸胺二盐酸盐、色胺和氯金酸(HAuCl4·3H2O)纯度均大约99.8%，购于Sigma-Aldrich公司；硼氢化钠(NaBH4)、乙酸(CH3COOH)购于天津市福晨化学试剂厂；壳聚糖(CS)购于国药集团化学试剂有限公司；高氯酸(HClO4)购于上海麦克林生化科技有限公司；正己烷(C6H14)购于天津市永大化学试剂有限公司。0.1 mol/L磷酸缓冲溶液(PBS，pH 7.0)由NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O储备液混合配制；带鱼和黄花鱼购于超市。所用试剂均为分析纯，实验用水为超纯水(18.2 MΩ·cm)，实验均在室温下进行。

1.2 玻碳电极的预处理

玻碳电极(GCE)依次在专用绒毛抛光垫上用1.0、0.3、0.05 μm的α-Al2O3粉抛光成镜面，用水洗净后，分别于50%硝酸溶液、无水乙醇和水中各超声1 min，再将电极置于0.5 mol/L硫酸溶液中，于-1.0～1.0 V电位范围内以50 mV/s的扫描速率进行循环伏安扫描直至得到稳定的响应曲线。最后将处理好的电极放置于室温下晾干备用。

1.3 胶体金修饰电极(AuCS/GCE)的制备

1.3.1AuCS的制备使用硼氢化钠为还原剂,CS为保护剂，参考文献[17]制备AuCS：首先称取一定量CS充分溶解于30 mL 1.0%乙酸溶液中配成2 mg/mL溶液；在磁力搅拌下加入15 mL 0.01 mol/L的氯金酸溶液，继续搅拌30 min后，再逐滴加入6 mL 0.1 mol/L的硼氢化钠溶液，继续搅拌至溶液呈透明的酒红色。制备过程中所用玻璃仪器均需在王水(HNO3-HCl，体积比1∶3)中洗净。

1.3.2AuCS/GCE的制备在预处理好的GCE表面滴加3 μL AuCS，确保AuCS完全覆盖电极表面，室温晾干后制得AuCS/GCE。

1.4 样品前处理

本实验参考文献[18]处理样品：精密称取2.0 g已粉碎带鱼或黄花鱼样品于50 mL离心管中，加入8 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液，涡旋振荡混匀1 min，以10 000 r/min离心10 min，重复提取一次，合并2次上清液于25 mL容量瓶中，用0.4 mol/L高氯酸溶液定容至刻度。准确移取10.00 mL样品提取液置于离心管中并加入10 mL正己烷，漩涡振荡5 min，弃去上层有机相，重复提取2次，合并提取液，待测。

加标回收样品的前处理：精确称量2.0 g已粉碎样品于50 mL离心管中，加入组胺配成不同浓度(0.1、0.26、0.5 mmol/L)的加标溶液，在优化条件下测定，平行实验3次。

1.5 检测方法

采用三电极电化学测试系统，以pH 12.0 PBS为支持电解质。在初始电位1.0 V条件下，于匀速搅拌的PBS中，利用I～t法扫描约300 s直至基线稳定，然后每隔50 s加入定量的组胺标准溶液或样品溶液。

2 结果与讨论

2.1 工作电极的选择

分别将金电极(GE)、铂电极(PE)和GCE置于1.0 mmol/L组胺的PBS溶液(pH 12.0)中，利用方波伏安法(SWV)在0.2～1.2 V电位范围内进行扫描。结果发现，与GE和PE相比，组胺在GCE上的氧化峰电流明显(图1)，说明组胺在GCE表面发生氧化反应时具有较高的响应灵敏度，所以选用GCE为测定组胺的工作电极。

2.2 底液pH值的选择

采用Tris-HCl(pH 6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)和PBS(pH 4.0、7.0、10.0、12.0)分别配制1.0 mmol/L组胺溶液，考察各浓度组胺溶液在GCE上的响应电流值。发现在不同pH值的Tris-HCl底液中组胺均未产生氧化峰。在pH值为4.0、7.0、10.0的PBS底液中(图2A)，1.0 mmol/L组胺未见明显的响应电流；而当PBS底液的pH值达12.0时，组胺出现明显的氧化峰，且峰形良好，这可能是由于组胺发生电子转移时伴随着质子的转移，从而使其电化学响应与底液的pH值具有依赖关系，随着底液pH值的升高，组胺的氧化峰电位负移至测试的电位范围内。进一步考察了不同浓度的组胺溶液(以pH 12.0 PBS为底液)在GCE上的电化学响应(图2B)，发现响应峰电流随组胺浓度的增加而增大。因此，实验选择pH 12.0的PBS作为测试底液。

2.3 电化学测试技术的选择

将GCE置于0、10.0、100、1 000 μmol/L组胺溶液(用pH 12.0 PBS溶液配制)中进行循环伏安法(CV)、SWV、差分脉冲伏安法(DPV)和I～t法扫描，结果见图3。由图3A、B和C可见，采用CV、SWV、DPV法测试10.0 μmol/L组胺时，其电流值响应小，灵敏度低，无法在实际中应用。而采用I～t法测试1.0 μmol/L组胺(图3D中出现第1个阶梯时的组胺浓度)时具有明显的响应，表明在测定组胺时，I～t法比其他3种测试方法具有更高的测试灵敏度，故选择I～t法对组胺进行后续测试。

2.4 电极修饰材料的选择

分别采用胶体金(AuCS)、粘土(Clay)和胶体金/粘土(AuCS/Clay)对GCE进行修饰，比较组胺在修饰电极上的响应电流值。结果发现，与GCE相比，在电极表面修饰粘土后，响应基线更加稳定平滑，但组胺的响应电流值未发生明显变化，且粘土修饰膜的稳定性较差，在淋洗和测定过程中易脱落。而AuCS中的壳聚糖具有良好的黏附性，可改善修饰电极的稳定性，使用AuCS和AuCS/Clay修饰电极时均能增加组胺的响应电流，且仅修饰AuCS的电极响应灵敏度增加更显著，因此，选用AuCS为GCE的修饰材料。实验进一步考察了AuCS/GE、AuCS/PE和AuCS/GCE 3种修饰电极在1.0 mmol/L组胺的PBS溶液(pH 12.0)中的氧化峰电流，利用SWV在0.2～1.2 V电压范围内进行扫描。结果发现，与AuCS/GE和AuCS/PE相比，组胺在AuCS/GCE上的氧化峰电流明显，且峰形较好，因此选用AuCS/GCE作为测定组胺的工作电极。

2.5 初始电位的选择

将AuCS/GCE放入1.0 mmol/L组胺溶液中，连接三电极系统，测得开路电位为0.55 V。采用SWV法测定，发现组胺在0.75 V附近有一个明显的氧化峰。根据开路电位和氧化峰电位，设置I～t法的初始电位分别为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 V，考察初始电位对不同浓度组胺在AuCS/GCE上电化学响应的影响。结果显示，初始电位为0.5、0.6、0.7、0.8、1.2 V时，组胺在AuCS/GCE表面均无明显的响应。当初始电位为0.9、1.0、1.1 V时，组胺在AuCS/GCE上产生了明显响应，且1.0 V时组胺的响应电流值最大，因此，实验选择I～t法测试组胺的初始电位为1.0 V。

2.6 性能测试

2.6.1重现性在相同条件下制备5支AuCS/GCE，分别测试浓度为4.0、7.9 μmol/L的组胺溶液，得其响应电流的相对标准偏差(RSD)分别为3.6%和4.8%，表明AuCS/GCE具有良好的重现性。

2.6.2干扰实验考察10倍于组胺浓度的腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、苯乙胺、色胺和酪胺对测定结果的影响，结果显示，腐胺、尸胺、苯乙胺、精胺、亚精胺不干扰组胺的测定，而色胺和酪胺产生了明显的电流响应。由于鱼样中色胺的含量极低[19-21]，在实际应用中基本不干扰测定。而酪胺虽干扰测定，但其在SWV上的氧化峰位于0.45 V左右，与组胺(0.75 V)的氧化峰间隔较远，采用本方法测定为阳性样品时可补充SWV实验进行区分。

图4 组胺的电流响应值与其浓度的关系曲线

2.7 组胺标准曲线的建立

在优化实验条件下，使用I～t法考察了不同浓度(0.1、0.35、0.59、0.98、5.8、9.7、14、28、64 μmol/L)组胺在AuCS/GCE上响应电流的变化(图4)，结果显示，随着组胺浓度的增加，I～t曲线呈阶梯式下降，其响应电流(-I,μA)与其浓度(c,μmol/L)在0.1～64 μmol/L范围内呈良好的线性关系，线性方程为：-I=0.053 12c-0.007 17(r=0.997，n=9)，以3倍信噪比(S/N=3)计算得到AuCS/GCE对组胺的检出限为0.033 μmol/L。

2.8 样品分析与回收率的测定

取带鱼和黄花鱼在优化条件下采用本方法检测，结果显示，带鱼中组胺的含量为86.2 mg/kg，在黄花鱼中的含量为49.2 mg/kg。对带鱼和黄花鱼样品分别进行0.1、0.26、0.5 mmol/L 3个浓度水平的加标回收实验，平行测定3次。结果显示，组胺在带鱼和黄花鱼样品中的回收率分别为94.4%～106%、91.8%～106%，相对标准偏差(RSD)分别为3.2%、2.5%，表明方法具有良好的可靠性和准确度，且实际样品测试时间小于6 min。

3 结 论

本文建立了一种快速检测食品中组胺的电化学分析方法，采用AuCS修饰GCE电极，制作简单、稳定性良好，与未修饰的GCE相比，组胺的电化学响应明显增强，可用于市售带鱼和黄花鱼中组胺含量的测定。