离子液体-分散液液微萃取/高效液相色谱法用于猪肾脏中3种四环素类抗生素的检测

张 英，丁健桦，向虹霖，刘鹏飞

(东华理工大学 化学生物与材料科学学院，江西 南昌 330013)

离子液体-分散液液微萃取/高效液相色谱法用于猪肾脏中3种四环素类抗生素的检测

张 英，丁健桦*，向虹霖，刘鹏飞

(东华理工大学 化学生物与材料科学学院，江西 南昌 330013)

建立了分散液液微萃取(DLLME)技术进行样品前处理，高效液相色谱(HPLC)法测定猪肾脏中土霉素(OTC)、四环素(TC)、金霉素(CTC)3种四环素类抗生素(TCs)残留量的方法。考察了分散剂种类、离子液体用量、分散剂用量、样品溶液pH值、萃取时间、盐效应等因素对萃取效率的影响。优化后的实验条件为：以丙酮为分散剂，离子液体([BMIM]PF6)用量为50 μL，分散剂用量为140 μL，样品溶液pH值为3.0，萃取时间为15 min，不添加盐。该方法在0.1～10.0 mg/L范围内线性关系良好(r2≥0.999 5)，土霉素、四环素和金霉素的相对标准偏差(RSD)为2.2%～3.1%，检出限(LOD)为54～93 μg/L，富集倍数为7.0～27.8，且样品的加标回收率达99.5%～101.1%。该法准确度和精密度均满足分析方法的要求，实现了对猪肾脏中土霉素、四环素、金霉素3种四环素类抗生素残留量的快速、绿色、灵敏和准确检测。

离子液体；分散液液微萃取；高效液相色谱；四环素类抗生素；猪肾脏

四环素类抗生素(TCs)是一类由放线菌产生的广谱抗生素，常用的有土霉素(OTC)、四环素(TC)、金霉素(CTC)及一些半合成衍生物如强力霉素等。TCs具有良好的抑菌性，能有效地治疗和预防疾病，还可作为生长促进剂被添加到饲料中，因此被广泛应用于畜牧养殖业[1-2]。但是抗生素使用不当或滥用，将导致动物体内抗生素残留量较高，其中大部分会随粪便、尿液等排泄物排出，如果将其排泄物作为有机肥施入农田,则会引发土壤、水体等一系列环境污染问题；同时，长期摄入含有抗生素的动物源性食品也将对人体健康造成危害[3]。目前抗生素滥用已成为人们关注的一个热点问题，而复杂体系中抗生素残留的灵敏、准确、可靠分析方法的研究和建立是抗生素滥用研究的前提和基础，显得非常迫切和重要。

高效液相色谱法(HPLC)是TCs残留量检测的一种常用分析方法，具有操作简便、快速、准确等特点，其重现性、稳定性、分离效果等均能满足产品的检验要求[4]。但由于大多数生物样品基质复杂，在HPLC测定前须进行样品前处理。传统的样品前处理技术(如液-液萃取等)存在有机溶液消耗大，易对环境造成二次污染，富集倍数低，难以满足痕量分析要求等不足[5]。分散液液微萃取(DLLME)则是一种新型的微萃取技术，具有操作简便、快速、成本低、富集效率高、有机溶剂用量少等优点[6-7]。传统DLLME使用的萃取剂多为高毒性的卤代烃，对环境存在一定的污染。而离子液体(IL)是一种新型的绿色溶剂，具有难挥发、高稳定、强极性和无污染等特性，代替常规有机溶剂作为萃取剂更为绿色环保，现已广泛应用于复杂样品的萃取分离分析[8-14]。IL-DLLME方法萃取过程耗时短，灵敏度高，易与其它检测仪器联用，是一种具有发展前途的环保型分离富集技术[15-18]。本文采用IL-DLLME技术结合HPLC法，建立了猪肾脏中OTC、TC、CTC 3种TCs的高效、灵敏的测定方法，为猪肾脏等动物组织中这3种TCs残留的检测提供了有效的参考。

1 实验部分

高效液相色谱仪(安捷伦1260，美国安捷伦公司)；pH计(PHS-3C,仪电科学仪器公司)；超声波清洗器(KQ5200DB，昆山市超声仪器有限公司)；玻璃仪器气流烘干器(KQ-8，巩义市予华仪器有限责任公司)；离心机(X-K400，江苏新康医疗器械有限公司)；冰箱(海尔BCD-216SZ，海尔集团有限公司)。

盐酸土霉素(>96.5%)、盐酸四环素(>95.9%)、盐酸金霉素(>90.1%)标准品(中国食品药品检定研究院)；甲醇、乙腈(色谱级，国药集团化学试剂有限公司)；三氟乙酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；[BMIM]PF6(>99%，兰州物理研究所)；氢氧化钠、氯化钠、乙酸乙酯、乙醇、丙酮(分析纯，西陇化工股份有限公司)；实验用水为二次蒸馏水。

新鲜猪肾脏样品购于学校附近菜市场。

1.2 实验原理与操作步骤

1.2.1实验原理在样品溶液中加入萃取剂，再加入合适的分散剂使萃取剂在样品溶液中均匀分散，从而增大萃取剂与样品溶液的接触面积。因各待测组分在样品溶液和萃取剂中的分配系数不同，导致超声萃取和离心后最终形成三相体系，最后用微量进样针取其萃取相进样分析[19]。

1.2.2操作步骤向样品溶液中加入一定量的萃取剂([BMIM]PF6)与分散剂(丙酮)的混合溶液，摇匀，此时呈分散剂/萃取剂/样品溶液三相体系的浑浊溶液，超声萃取15 min，待体系达到平衡后放入离心机中离心5 min使其分层，此时待测组分被萃取到下层的沉积相中，最后吸取一定量的沉积相溶液经HPLC进样分析。

基于图像技术的破碎卵石指标相关性对比分析…………………………………… 张苏花，高占须，郭庆林（5-279）

1.3 溶液的配制

标准溶液：分别称取OTC、TC、CTC各 5 mg，用水溶解并转移至10 mL棕色容量瓶中，定容，即得质量浓度各为500 mg/L的标准储备液。实验中所需的标准溶液均由该储备液适当稀释后配制。

三氟乙酸溶液：准确移取三氟乙酸0.765 mL，用水定容至100 mL容量瓶中，得到浓度为0.1 mol/L的三氟乙酸溶液。

氢氧化钠溶液：准确称取氢氧化钠固体0.4 g于烧杯中，用水溶解并定容至100 mL容量瓶中，得到浓度为0.1 mol/L的氢氧化钠溶液。

样品溶液：取新鲜猪肾脏样品，经绞肉机绞碎后准确称取5.000 0 g于50 mL烧杯中，依次加入2.5 mL浓度为0.1 mol/L的三氟乙酸溶液与12.5 mL乙腈，搅拌均匀后超声提取15 min，待过滤后用水定容至100 mL，置于冰箱备用。

1.4 色谱条件

色谱柱为C18柱(Ameritech,Dim.250 mm×4.6 mm)；柱温为25 ℃；紫外检测波长为350 nm。流动相：A为乙腈，B为甲醇，C为0.02%三氟乙酸；流速为1.5 mL/min；梯度洗脱：0～5 min,85%～70%A，5%～10%B；5～22 min，70%～60%A，10%B。

2 结果与讨论

2.1 萃取条件的优化

取质量浓度为10.0 mg/L的TCs混合标准溶液，按照“1.2.2”萃取操作步骤和“1.4”色谱条件,分别考察了分散剂种类和用量、离子液体用量、样品溶液pH值、萃取时间和盐效应等因素对TCs萃取效率的影响。

2.1.1分散剂种类及用量的优化考察了甲醇、乙醇、乙腈、丙酮4种分散剂对萃取效率的影响，结果表明，以丙酮为分散剂时，离子液体的萃取效果最好，因此本文选择丙酮为最佳分散剂。

实验考察了分散剂丙酮的用量(60、80、100、120、140、160 μL)对萃取效率的影响。结果如图1A所示，随着分散剂用量在60～140 μL范围内逐渐增加，TCs的萃取效率总体呈增大趋势；当分散剂用量为140 μL时萃取效率最大，这是由于增加分散剂用量，能使萃取剂与样品溶液接触几率增加；而当分散剂用量大于140 μL时，TCs的萃取效率反而降低，可能是因为分散剂用量过多稀释了样品溶液，从而间接影响了萃取效率。因此本文选择最佳分散剂用量为140 μL。

图1 不同萃取条件对TCs萃取效率的影响Fig.1 The effect of different conditions on TCs extraction efficiencyA.volume of dispersant,B.volume of ionic liquid,C.pH value,D.extraction time

2.1.2离子液体([BMIM]PF6)用量的优化以丙酮为分散剂，考察离子液体用量(0、10、20、30、40、50、60、70 μL)对萃取效率的影响。结果如图1B所示，萃取效率随着离子液体用量的增加而增大，但当离子液体用量高于50 μL时，萃取效率逐渐下降。这可能是因为加入的离子液体体积不足(低于50 μL)导致样品中TCs萃取不完全；而加入离子液体过多(高于50 μL)则会较大地稀释萃取的TCs，降低萃取效率。所以本文选择离子液体用量为50 μL。

2.1.3样品pH值的优化TCs在酸性与碱性条件下很不稳定，因此pH值对萃取效率的影响具有决定性。用0.1 mol/L三氟乙酸和氢氧化钠溶液将样品溶液pH值调至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，以丙酮为分散剂，考察样品pH值对萃取效率的影响。结果如图1C所示，pH 3.0时，萃取效率最高，故本文选择最佳样品pH值为3.0。

2.1.4萃取时间的优化传质的速率决定了体系达到平衡的时间。以丙酮为分散剂，考察了萃取时间(5、10、15、20、25 min)对萃取效率的影响。结果如图1D所示，萃取时间为15 min时，萃取效率最高，继续延长萃取时间，萃取效率反而降低。这是因为在DLLME过程中萃取一定时间(如15 min)后，随着萃取时间的继续增加，分散剂丙酮的挥发量增大，导致[BMIM]PF6萃取剂损失加剧。因此本文选择最佳萃取时间为15 min。

2.1.5样品盐浓度的优化分别加入不同量的NaCl(0、5%、10%、15%、20%、25%)，考察样品盐浓度对萃取效率的影响。结果表明，萃取效率随着盐浓度的增加反而减小，可能是因为加入盐溶液后体系的离子强度增加，使得离子液体的溶解度增大，从而降低了萃取效率。因此本实验选择不加盐。

2.2 线性范围、精密度与检出限

移取适量3种TCs标准储备液，配制成质量浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的混合标准溶液，在优化条件下对不同浓度的混合标准溶液分别进行测定，以3种TCs的质量浓度(x，mg/L)对其峰面积(y)进行线性回归分析。对质量浓度为1.0 mg/L的TCs混合标准溶液，在优化的DLLME和HPLC条件下进行11次重复测定，经计算得3种TCs的相对标准偏差(RSD)；当信噪比(S/N)为3时，根据公式LOD=3cσ/S(c为标准品的浓度，σ为标准偏差，S为净响应信号强度平均值)计算得3种TCs的检出限(LOD)。其线性范围、精密度、检出限见表1。由表1可见，本法线性关系良好，RSD不高于3.1%，LOD为54～93 μg/L，具有灵敏度高、重现性好的特点，能够用于TCs的灵敏检测。

表1 3种TCs的线性方程、线性范围、精密度与检出限Table 1 Linear equations,linear ranges,RSDs and LODs of three TCs

2.3 富集倍数

富集倍数是指经IL-DLLME处理后待测物浓度与待测物原始浓度之比。取5 mg/L的TCs混合标准溶液，在优化色谱条件和萃取条件下，分别进行萃取前和萃取后的测定。结果表明，离子液体对TCs具有较好的富集作用，对OTC、TC和CTC的富集倍数分别为7.0、16.3、27.8倍。

图2 猪肾脏样品中TCs萃取前后的色谱图Fig.2 Chromatograms of TCs in pig kidney sample before and after extractiona.before extraction；b.after extraction

2.4 实际样品分析

取1.5 mL的猪肾样品溶液3份，第1份直接进行HPLC分析，第2份采用优化的DLLME方法处理后再进行HPLC分析，第3份加入适量的3种TCs标准溶液后在优化的DLLME和HPLC条件下进行加标回收率实验。样品的分析结果见图2和表2。

从图2可以看出，TCs经DLLME萃取后富集效果明显，且可以消除一些杂质峰，具有一定的净化作用，有利于实际样品的分析检测。经计算，猪肾脏样品中OTC、TC和CTC的含量分别为3 440、1 004、1 003 μg/kg，与国家标准GB/T 5009.116-2003[20]方法对比，结果偏差小于5%。根据国内标准，TCs在动物源性食品中肾脏组织的最高残留限量为600 μg/kg[21]，因此，本实验所采集的猪肾样品中TCs含量严重超标。

表2 实际样品检测结果Table 2 The detection results of actual samples

从表2可知，本方法所测3种抗生素的RSD为1.7%～2.9%，加标回收率达99.5%～101.1%，满足猪肾脏中3种抗生素的测定需求。

3 结 论

本文建立了猪肾脏中OTC、TC、CTC残留量的IL-DLLME/HPLC测定方法。结果表明，DLLME这种新型的样品前处理技术集萃取、富集、净化于一体，不仅简化了操作步骤、降低了实验成本，而且以离子液体代替常规有机溶剂作为萃取剂，使整个实验过程更为绿色环保，是一种有发展前景的环保型分离富集技术。本法的相对标准偏差(RSD)不高于3.1%，检出限(LOD)为54～93 μg/L，且样品的加标回收率达99.5%～101.1%，具有灵敏度高、精密度好、准确可靠等优点，可为其他复杂样品中性质相似的组分测定提供新的方法。

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Determination of Three Tetracyclines in Pig Kidney by High Performance Liquid Chromatography with Ionic Liquid Dispersive Liquid-Liquid Microextraction

ZHANG Ying,DING Jian-hua*,XIANG Hong-lin,LIU Peng-fei

(College of Biology,Chemistry and Material Science,East China Institute of Technology,Nanchang 330013,China)

A method was established for the determination of three tetracycline antibiotics(TCs) residues such as oxytetracycline,tetracycline and chlortetracycline in pig kidney by high performance liquid chromatography(HPLC) coupled with dispersive liquid-liquid microextraction(DLLME).The influences of dispersant type,amount of ionic liquid,amount of dispersant,pH of sample solution,extraction time and effect of salts on extraction efficiency were investigated.The optimum experimental conditions were as follows:using acetone as the dispersant,a 50 μL ionic liquid([BMIM] PF6),a 140 μL dispersant,a pH 3.0 sample solution,a 15 min of extraction time and no salt.The results showed that this method provided a wide linearity in the range of 0.1-10.0 mg/L with correlation coefficients no less than 0.999 5.The relative standard deviations(RSDs) were 2.2%-3.1%for oxytetracycline,tetracycline and chlortetracycline.The detection limits(LOD) were in the range of 54-93 μg/L with the enrichment folds of 7.0-27.8,and the recoveries were 99.5%-101.1%.It was found that the accuracy and precision could meet the requirements for the rapid,green,sensitive and accurate detection of oxytetracycline,tetracycline and chlortetracycline residues in pig kidney.

ionic liquid(IL);dispersive liquid-liquid microextraction(DLLME);high performance liquid chromatography(HPLC);tetracycline antibiotics(TCs)；pig kidney

2017-06-26；

2017-07-12

国家自然科学基金(21265002)；江西省科级支撑计划项目(20151BBG70048)

*

丁健桦，博士，教授，研究方向：样品前处理技术和色谱分析，Tel:0791-83896550，E-mail:375520739@qq.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.11.010

O657.7

A

1004-4957(2017)11-1352-05