基于拟糖蛋白的电化学阻抗生物传感器用于糖与蛋白质相互作用的研究

邹 蕊，黄晓妍

(1.宁夏师范学院 化学化工学院，宁夏 固原 756000；2.固原市原州区黄铎堡学校，宁夏 固原 756000)

基于拟糖蛋白的电化学阻抗生物传感器用于糖与蛋白质相互作用的研究

邹 蕊1*，黄晓妍2

(1.宁夏师范学院 化学化工学院，宁夏 固原 756000；2.固原市原州区黄铎堡学校，宁夏 固原 756000)

以D-甘露糖和伴刀豆球蛋白(ConA)的相互作用为研究对象，利用美拉德反应将D-甘露糖共价结合到负载蛋白牛血清蛋白(BSA)的表面形成拟糖蛋白，然后将拟糖蛋白固定到玻碳电极表面，以拟糖蛋白表面的D-甘露糖为分子识别物质，构建了检测伴刀豆球蛋白(ConA)的电化学阻抗传感器。拟糖蛋白制备过程简单，D-甘露糖负载量大，在空间中提供多个结合位点，因此能与ConA形成多价复合物，提高了传感器的灵敏度。该传感器的响应值与ConA浓度的对数在5.0×10-11～5.0×10-9mol/L之间呈良好的线性关系，检出限为1.7×10-11mol/L，D-甘露糖和ConA之间的结合常数为2.6×106L/mol。该方法简单，可适用于不同糖和蛋白质相互作用的研究，为构建高灵敏度的电化学阻抗传感器提供了新思路。

电化学阻抗传感器；糖与蛋白相互作用；拟糖蛋白；伴刀豆球蛋白

糖与蛋白质的相互作用在很多生命活动中发挥着非常重要的作用，如细胞黏附、细胞生长以及免疫反应等[1]。因此，从分子水平上研究糖和蛋白的相互作用可为了解生命活动的复杂过程提供理论依据，也能够为医疗诊断和治疗过程提供很大帮助[2-5]。然而糖结合蛋白(如凝集素)均是通过相对较弱的多价作用和糖形成复合物[6]，因此糖基数目更多、空间构象更立体以及结合位点更丰富的研究方法是糖组学的研究热点[7]。研究糖和蛋白相互作用的技术有表面等离子体共振(SPR)[8]、石英晶体微天平(QCM)[9]、糖荧光微阵列[4,6,10]、传统的酶联免疫法(ELISA)[11]和电化学传感器[7,12-13]。电化学阻抗(EIS)传感器通过传感器与分析物相互作用引起的电极表面电化学阻抗的改变来研究分析物[4-5,14]，无需标记，是一种研究界面生物过程非常有效的技术。

目前，研究糖与蛋白质相互作用的电化学传感器需要将糖固定在电极表面，对糖进行衍生化，在衍生化过程中需进行基团保护，而且衍生化之后的糖在电极表面的固定量较小[15-16]。美拉德反应[17-18]是一种蛋白质与还原性糖之间发生的非酶化学反应，还原性糖的羧基与蛋白质肽链末端氨基反应生成糖基化席夫碱和水，反应条件非常简单。蛋白质的终端氨基以及侧链上的赖氨酸和精氨酸[19-20]氨基均能够发生反应。在种类繁多的凝集素中，伴刀豆球蛋白ConA是一个研究较多，结构明晰的糖结合蛋白质[21-23]，能够特异性识别D-甘露糖，因此选用ConA为目标分子。本文通过美拉德反应制备了拟糖蛋白，并将其吸附在玻碳电极的表面，以电化学交流阻抗法为检测技术，构建了非标记、糖负载量大、灵敏度高的电化学交流阻抗传感器，用于测定糖结合蛋白伴刀豆球蛋白ConA与甘露糖的相互作用。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI660电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)。玻碳电极(直径2.0 mm)为工作电极，对电极为铂丝电极，参比电极为银/氯化银电极(Ag/AgCl Sat.KCl)。UV-2450紫外可见分光光度计(日本Shimadzu 公司)记录紫外可见吸收光谱图。ALPHA1-2型冷冻干燥机(德国Christ公司)。

伴刀豆球蛋白(Concanavalin A,Mw=104 000 Da,pI=4.5～5.5,蛋白含量约15%)及2-巯基乙醇(C2H6OS,Mw=180.16 )均购自Sigma公司，D-甘露糖(C6H12O6,Mw=180.16)购自国药试剂公司。牛血清白蛋白(Mw=66 430 Da,pI=4.7)购自科昊生物有限公司。邻苯二甲醛(简称OPA,C8H6O2,Mw=134.13)购于阿拉丁试剂(上海)有限公司，硼砂(Na2B4O7·10H2O,Mw=381.37)以及十二烷基硫酸钠(简称SDS，Mw=288.38)购于西安化学试剂厂。其他试剂均为分析纯。实验用水为超纯水(Milli-Q ultrapure，18.2 MΩ·cm)。

伴刀豆球蛋白的活化[22]：伴刀豆球蛋白使用前在100 mmol/L的PBS缓冲溶液(内含0.1 mmol/L的Ca2+，Mn2+)中活化6 h。

OPA试剂[17]：将25 mL 0.1 mol/L硼砂，2.5 mL 20%的SDS，100 μL的2-巯基乙醇，40 mg邻苯二甲醛(先溶于1 mL甲醇中)混合，加入超纯水定容至50 mL。OPA试剂需现用现配。

缓冲溶液： 100 mmol/L磷酸缓冲溶液PBS(140 mmol/L NaCl，3.0 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，pH 7.4)[24]，50 mmol/L碳酸缓冲溶液(6.6 mmol/L Na2CO3，490 mmol/L NaHCO3，pH 9.0)。

检测溶液：由1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]-1.0 mmol/L K4[Fe(CN)6]缓冲溶液配制而成。

1.2 拟糖蛋白的制备

按照Osuna报道方法进行[17]。取100 mg BSA和30 mg甘露糖加入到4.0 mL 50 mmol/L 的碳酸缓冲溶液(pH=9.0)中，溶液中BSA与甘露糖的摩尔比为1∶60。将混合液于-50 ℃下24 h冻干。然后放置在相对湿度为43%(湿度用饱和K2CO3溶液控制)，温度为50 ℃的微环境中20 h后，将产物溶解于5.0 mL水中，然后在超纯水中，以14 000 Da的半透膜透析24 h，将产物冻干。此时的产物为BSA与甘露糖反应产物拟糖蛋白。向拟糖蛋白BSA-Man中加入3.0 mL PBS配成储备液，拟糖蛋白质量浓度为33 mg/mL，用时稀释10倍。

1.3 ConA生物传感器的制备

传感器的构建原理如图1所示，首先通过美拉德反应将D-甘露糖共价结合到负载蛋白质-牛血清蛋白BSA上，形成一个拟糖蛋白。而负载在拟糖蛋白上的甘露糖能够选择性识别ConA，通过静电吸附将拟糖蛋白固定到玻碳电极的表面，制成ConA生物传感器。将生物传感器浸入ConA溶液中，生物传感器表面的电子转移阻抗增加，从而可以定量测定ConA。在构建传感器过程中，BSA既能将糖固定到电极表面，又能为糖/蛋白质的识别提供多价结合的平台。BSA上共有60个氨基(59个赖氨酸和1个N末端)，其中54个氨基都能够暴露在蛋白质的表面，最近的两个氨基之间的距离为(11±3)Å[25-26]，所以拟糖蛋白BSA-Man上能够负载大量的D-甘露糖，从而增强了电化学信号，提高了传感器的灵敏度。

图1 基于拟糖蛋白的电化学阻抗传感器组装原理图Fig.1 Schematic representation of the EIS sensor based on neoglycoproteins with fabrication and performance steps

传感器的构建步骤为：先将玻碳电极(直径2.0 mm)用0.03 μm Al2O3电极抛光粉研磨，再将玻碳电极插入1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]-1.0 mmol/L K4[Fe(CN)6]溶液中，在-0.20～0.60 V下循环伏安扫描至氧化峰电位与还原峰电位差值ΔEp约80 mV，表明电极表面已处理干净。在玻碳电极上滴加10 μL 33 mg/mL拟糖蛋白溶液，放置90 min，以PBS冲洗。将不同浓度的ConA滴涂在拟糖蛋白构建的电化学传感器上，室温下与ConA结合1 h后进行电化学交流阻抗法检测。

图2 传感器组装过程中不同电极在1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]-1.0 mmol/L K4[Fe(CN)6]中的复平面阻抗图Fig.2 Nyquist plots of impedance spectra obtained in 10 mmol/L PBS(pH 7.4) containing 1.0 mmol/L [K3Fe(CN)6]-1.0 mmol/L K4[Fe(CN)6] a.bare GCE，b.neoglycoprotein adsorb onto GCE，c.0.1 nmol/L ConA/neoglycoprotein/GCE， d.1.0 nmol/L ConA/neoglycoprotein/GCE after interaction for 1 h；point line：experimental data,solid line：fitted data;biased potential：0.226 V；frequency：from 0.01 Hz to 100 kHz；amplitude：5.0 mV；insert shows the equivalent circuit applied to fit the impedance spectroscopy

1.4 电化学测量方法

检测溶液为1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]-1.0 mmol/L K4[Fe(CN)6]。电化学交流阻抗测定时的偏电位为0.226 V，频率范围0.01 Hz ～100 kHz，振幅为5.0 mV。采用CHI660软件拟合等效电路。Ret,0为没有ConA时的阻抗值，Ret,i为浸入ConA之后的阻抗值。以电子传递电阻ΔRet为分析信号，对ConA进行定量测定。采用循环伏安法表征，电位扫描范围为-0.20～0.60 V，扫速为50 mV/s。电化学实验在室温下(25±1) ℃进行。

2 结果与讨论

2.1 生物传感器的表征

图2为传感器制备过程中电极的法拉第阻抗图，内插图电路中包括电子转移阻抗(Ret)、界面电容(C)、电解质溶液的电阻(Rs)以及Warburg阻抗 (Zw)。由图可见，实验所得的阻抗值与CHI660软件模拟的理论值之间非常一致。说明该等效电路能够提供一个可行的模型来描述电化学传感器的性能[24]。

裸玻碳电极的阻抗图接近于一条直线(曲线a)，阻抗值为0.47 kΩ，当拟糖蛋白吸附到玻碳电极表面2 h后，阻抗值增加到20 kΩ(曲线b)，表明拟糖蛋白吸附在电极表面。将制备好的生物传感器浸入0.1 nmol/L的ConA中，Ret从28 kΩ增加到43 kΩ(曲线d)，说明ConA与甘露糖之间的特异性相互作用使得ConA连接到传感器表面，引起阻抗值的进一步增大。ConA的浓度从0.1 nmol/L增加到1.0 nmol/L，Ret值从43 kΩ增加到63 kΩ(曲线e)。ConA的等电点为4.5～5.2，在pH 7.4的溶液中，ConA带负电，会排斥[Fe(CN)6]3-/4-，因此会引起阻抗值的增大。从实验现象中可以看出，本研究制作的生物传感器能够应用于ConA的检测。

2.2 拟糖蛋白的紫外可见吸收光谱法表征[17]

BSA与拟糖蛋白中自由氨基的数量可用邻苯二甲醛(OPA)法测定。蛋白质上的游离氨基能够与OPA试剂发生反应，生成物在340 nm处能够产生一个很强的吸收，因此，OPA试剂能用于蛋白质中游离氨基的测定。取100 μL 3.3 mg/mL的BSA或拟糖蛋白加入到1.0 mL的OPA试剂中，室温下混合2 min，然后在紫外可见光谱仪中测定340 nm处的吸光度。结果显示，拟糖蛋白与OPA反应2 min后，产物在340 nm处的吸光度下降，游离氨基量减少，说明BSA中的部分氨基与甘露糖发生了反应。

图3 阻抗变化值与拟糖蛋白(33 mg/mL)吸附时间的关系Fig. 3 Dependence of ΔRet on the adsorption time of the 33 mg/mL neoglycoprotein on the surface of electrode

2.3 吸附时间的选择

实验证明，电化学阻抗生物传感器能够对ConA产生响应，而电化学响应值与电极表面吸附的拟糖蛋白量之间有密切的关系，随着吸附时间的增加，电极表面吸附量增大直至达到饱和。因此，对33 mg/mL拟糖蛋白在电极表面的吸附时间进行了考察，以吸附时间与拟糖蛋白修饰电极阻抗值Ret,i和裸玻碳电极Ret,0的差值ΔRet作图(图3)。由图可见，拟糖蛋白吸附时间在30～90 min之间，阻抗值随吸附时间的增加不断增大，当结合时间大于90 min后，阻抗值变化趋于稳定，说明电极表面吸附的拟糖蛋白已达到饱和。因此，本实验选择拟糖蛋白的吸附时间为90 min。

2.4 传感器与ConA结合常数的计算

根据文献[14-15]报道，电极表面拟糖蛋白与ConA的相互作用可以按照Langmuir吸附模型进行分析。利用电化学阻抗技术，依据公式(1)和(2)计算传感器与ConA的结合常数。

C/ΔR’et=C/ΔR’et,max+1/(ΔR’et,max·Ka)

(1)

ΔR’et=(ΔRet,b-Ret,a)/Ret,a

(2)

图4 多负载电化学阻抗生物传感器对不同浓度ConA的复平面阻抗图Fig.4 Nyquist plots of impedance spectra obtained from different concentrations of ConA on the biosensorconcentration of ConA (a-h)：0，0.5，1.0，2.0，5.0 ，10，20，50(×10-10 mol/L)，respectively

式中，C为ConA的浓度，Ret,a和Ret,b分别为传感器结合ConA前、后的阻抗值，ΔR’et,max为ConA浓度最大时所计算的ΔR’et值，Ka为传感器与ConA的结合常数。结果显示，在一定的浓度范围内，C/ΔR’et(y)与C(x)呈线性关系，线性方程为y=0.266x+0.025(r2=0.993)。直线在纵轴的截距为1/(ΔR’et,max·Ka)，由此得出传感器与ConA的结合常数Ka为2.6×106L/mol。本研究所计算出的结合常数比文献报道的ConA与甘露糖单价结合模型所计算的结合常数大，而与多价结合模型的结合常数相似，这说明本实验所制备的电化学阻抗传感器与ConA是多价结合，结合常数增大[2,27-30]。

2.5 传感器的线性范围

在优化的实验条件下，利用多负载电化学阻抗传感器对不同浓度的ConA进行测定。图4为电化学阻抗生物传感器对不同浓度ConA的复平面阻抗图，传感器的响应值与ConA浓度的对数在5.0×10-11～5.0×10-9mol/L之间呈良好的线性关系(图4插图)，线性回归方程为ΔRet(Ω)=70.83 lgC(nmol/L)+772.23，r2=0.991 1，检出限(3sb/S)为1.7×10-11mol/L，比已报道的检出限低[31]。对1.0×10-9mol/L甘露糖分别进行5次平行测定，相对标准偏差(RSD)为3.3%，说明此传感器具有较好的重现性。

3 结 论

本研究以BSA为负载蛋白质，通过美拉德反应将D-甘露糖共价结合到BSA上，生成能够与ConA特异性结合的拟糖蛋白，然后将拟糖蛋白物理吸附到玻碳电极表面，制备了测定ConA与糖相互作用的电化学阻抗传感器。结果表明，拟糖蛋白所负载的大量甘露糖能够和ConA发生多价结合，增加传感器的灵敏度。美拉德反应条件温和，大部分还原性糖都能够发生，包括单糖、二糖和多糖。因此，本研究所提出的电化学阻抗生物传感器新方法可以用于其它糖与蛋白质相互作用的研究。

[1] Pihikova D,Kasak P,Tkac J.OpenChem.,2015,13(1)：636-655.

[2] Liang P H,Wang S K,Wong C H.J.Am.Chem.Soc.,2007,129(36)：11177-11184.

[3] Blomme B,Steenkiste C V,Callewaert N,Vlierberghe H V.JournalofHepatology,2009,50：592-603.

[4] Tanaka H,Chiba H,Inokoshi J,Kuno A,Sugai T,Takahashi A,Ito Y,Tsunoda M,Suzuki K,Takenaka A,Sekiguchi T,Umeyam H,Hirabayashi J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2009,106(37)：15633-15638.

[5] Comunale M A,Wang M J,Hafner J,Krakover J,Rodemich L,Kopenhaver B,Long R E,Junaidi O,DiBisceglie A M,Block T M,Mehta A S.J.ProteomeRes.,2009,8：595-602.

[6] Krishnamoorthy L,Mahal L K.ACSChemicalBiology,2009,4(9)：715-732.

[7] Bogomolova A,Komarova E,Reber K,Gerasimov T,Yavuz O,Bhatt S,Aldissi M.Anal.Chem.,2009,81(10)：3944-3949.

[8] Munoz F J,Perez J,Rumbero A,Santos J I,Canada F J,Andre S,Gabius H J,Barbero J J,Sinisterra J V,Hernaiz M J.BioconjugateChem.,2009,20：673-682.

[9] Pei Y X,Yu H,Pei Z C,Theurer M,Ammer C,Andre S,Gabius H J,Yan M D,Ramstrom O.Anal.Chem.,2007,79：6897-6902.

[10] Zhou X C,Turchi C,Wang D N.J.ProteomeRes.,2009,8(11)：5031-5040.

[11] Nakagawa T,Miyoshi E,Yakushijin T,Hiramatsu N,Igura T,Hayashi N,Taniguchi N,Kondo A.J.ProteomeRes.,2008,7(6)：2222-2233.

[12] Cheng W,Ding L,Ding S J,Yin Y B,Ju H X.Angew.Chem.Int.Ed.,2009,48：6465-6468.

[13] Ding L,Ji Q J,Qian R C,Cheng W,Ju H X.Anal.Chem.,2010,82：1292-1298.

[14] Qiu Y L,Liao R,Zhang X.Anal.Chem.,2008,80：990-996.

[15] Zhang Y,Luo S Z,Tang Y,Yu L,Hou K Y,Cheng J P,Zeng X Q,Wang P G.Anal.Chem.,2006,78： 2001-2008.

[16] Mislovicova D,Katrlik J,Paulovicova E,Gemiiner P,Tkac J.ColloidsandSurfacesB,2012,94：163-169.

[17] Osuna A I L,Clamont G R,Moreno L V.J.Agric.FoodChem.,2009,57(20)：9734-9739.

[18] Fayle S E,Gerrard J A.TheMaillardReaction.Cambridge：The Royal Society of Chemistry,2002.

[19] Sun Y,Hayakawa S,Ogawa M,Izumori K.J.Agric.FoodChem.,2005,53：10205-10212.

[20] Munch G,Schicktanz D,Behme A,Gerlach M,Riederer P,Palm D,Schinzel R.Nat.Biotechnol.,1999,17： 1006-1010.

[21] Zhang G J,Huang M J,Ang J J,Yao Q F,Ning Y.Anal.Chem.,2013,85：4392-4397.

[22] Oyelaran O,Li Q,Farnsworth D,Gildersleeve J C.J.ProteomeRes.,2009,8(1)：3529-3535.

[23] Zhang Y L,Li Q,Rodriguez L G,Gildersleeve J C.J.Am.Chem.Soc.,2010,132：9653-9662.

[24] Li X X,Shen L H,Zhang D D,Qi H L,Gao Q,Ma F,Zhang C X.Biosens.Bioelectron.,2008,23(11)： 1624-1630.

[25] He X M,Carter D C.Nature,1992,358(6383)：209-215.

[26] Sugio S,Kashima A,Mochizuki S,Noda M,Kobayashi K.ProteinEngineering,1999,12(6)：439-446.

[27] Bhattarai J K,Tan Y H,Pandey B,Fujikawa K,Demchenko A V,Stine K J.J.Electroanal.Chem.,2016,780：311-320.

[28] Ahn K S,Kim B K,Lee W Y.Electrochem.Commun.,2015,58：69-72.

[29] Mori T,Toyoda M,Ohtsuka T,Okahata Y.Anal.Biochem.,2009,395：211-216.

[30] Szunerrits S,Jonsson J N,Boukherroub R,Woisel P,Baumann J S,Siriwardena A.Anal.Chem.,2010,82：8203-8210.

[31] Huang C C,Chen C T,Shang Y C,Lin Z H,Chang H T.Anal.Chem.,2009,81：875-882.

Investigation on Protein-Carbohydrate Interaction with a Neoglycoprotein Based Electrochemical Impedance Spectroscopy Biosensor

ZOU Rui1*，HUANG Xiao-yan2

(1.College of Chemistry and Chemical Engineering,Ningxia Normal University,Guyuan 756000,China；2.Huang-Duo-Bu School of Yuanzhou District of Guyuan,Guyuan 756000,China)

The interaction betweenD-mannose and concanavalin(ConA) was always used as a model target for protein-carbohydrate interactions.A simple,sensitive electrochemical impedance spectroscopy(EIS) biosensor was herein reported for the detection of ConA based on neoglycoproteins.D-mannose was covalently attached to a carrier protein,bovine serum albumin(BSA) to generate multivalent neoglycoproteins by the Maillard reaction.The biosensor was designed by immobilizing the neoglycoproteins on the surface of glassy carbon electrode,whose structures were recognized by concanavalinA(ConA).Since the neoglycoconjugates were easily prepared,a large number ofD-mannoses could format multivalent complexs with ConA.The biosensor was highly sensitive.The increase of the electron transfer resistance of the biosensor was in logarithmically direct proportion to the concentration of ConA in the range of 5.0×10-11-5.0×10-9mol/L.The detection limit for ConA was 1.7×10-11mol/L,with an affinity constantKaof 2.6×106L/mol.The method developed in this study may be a promising approach,and could be extended to the design of an EIS biosensor for highly sensitive and rapid detection of other desired carbohydrate-protein interactions.

EIS biosensor;protein-carbohydrate interactions;neoglycoproteins;ConA

2017-05-31；

2017-07-24

宁夏师范学院重点项目(NX SFZD1602)；六盘山工程中心项目(HG16-06)

*

邹 蕊，硕士，讲师，研究方向：电分析化学，Tel：0954-2079640，E-mail：sfxyzr@126.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.11.013

O657

A

1004-4957(2017)11-1370-05