基于扫描电化学显微镜技术研究细胞实时释放ROS

樊孝银，鲁理平，康天放

(北京工业大学 环境与能源工程学院,北京 100124)

活性氧物种(Reactive oxygen species,ROS)是需氧细胞在代谢过程中产生的一系列活性氧簇，包括：O2·-，HOO·，OH·，H2O2等[1-2]，在正常生理条件下，细胞内ROS的产生处于动态平衡状态[3]。然而，当动态平衡被打破时会造成氧化应激，导致大量ROS产生[4-5]，而且ROS的强氧化性可以引起细胞广泛的氧化损伤，从而导致细胞凋亡[6]。目前检测细胞ROS产生的方法有荧光测定法[7]、电子自旋共振法[8]、化学发光法[9]和流式细胞仪法[10]等。但这些方法均存在不能实时检测活细胞中ROS的不足，如广泛使用的试剂盒方法(荧光测定法)存在对细胞浸入的潜在伤害作用，以及部分方法操作复杂等缺点。因此发展生理条件下检测细胞膜中实时释放ROS的分析技术对于探究生命体系受外界影响的机制至关重要。

佛波酯又称为十四烷酰佛波醇乙酸酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)，是一种可通过激活蛋白激酶PKC和NOXs来影响众多细胞生理过程的化合物。PMA是佛波酯类化合物中活性较高的一种，具有诱导多种肿瘤细胞分化的作用，生物学研究表明PMA能够诱发ROS的产生并触发癌细胞的凋亡[11]。

扫描电化学显微镜(SECM)是由Bard等于1989年提出的利用超微电极扫描得到法拉第电流对微区进行形貌以及电化学成像的一种显微新技术[12-13]。SECM的关键要素是超微电极，具有显著的灵敏度，短的响应时间和高的空间分辨率。尽管SECM起源于电分析表面科学，但在生物学应用和生物体研究方面也日益受到了人们关注。SECM在细胞研究中显示出独特的优势：①可无需探针-样本的接触即实现活体细胞直接检测；②只对有电活性的物质产生响应，选择性好；③单个细胞的表面形貌和局部反应可在高空间分辨率下进行研究。因此SECM在细胞水平上的研究具有无损伤性的独特优势[14-15]，适合研究活细胞中ROS的释放。基于近年来SECM的发展及独特优势，其在单细胞分析上的应用也十分广泛[16-19]，利用不同的操作模式，可以分析细胞多个特征，尤其是SECM电流信号的变化能够反映细胞对外界刺激的变化，这为SECM在细胞水平上研究环境污染物的作用，以及环境毒理分析奠定了良好的基础，并对明确污染物产生的生物毒性机理提供了一定的依据。本研究利用ROS的稳定产物——H2O2具有电活性的特点，比较了PMA对肺癌细胞(A549)即时刺激前后ROS的变化，并通过SECM成像技术原位实时检测了PMA诱导A549细胞ROS的释放。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

扫描电化学显微镜CHI920D(SECM，上海辰华仪器有限公司)，倒置显微镜(日本奥林巴斯CKX41)，铂超微电极/探针(直径：10 μm)，铂丝对电极，Ag/AgCl参比电极(上海辰华仪器有限公司)；氯化六氨基合钌(Ru(NH3)6Cl3，美国Sigma公司)，1×PBS(上海生工生物科技有限公司)，过氧化氢(H2O2，30%)，十四烷酰佛波醇乙酸酯(PMA)，二甲基亚砜(DMSO)购于北京化学试剂有限公司；实验用水均为超纯水(1 018 Ω，美国Milli-Q超纯水系统)；A549细胞(北京工业大学生命科学与生物工程实验室);RPM 1640 培养基：4 ℃保存备用，使用时加入1% 2 mmol/L的谷氨酰胺和10%的胎牛血清;PBS缓冲液、胰酶(美国Invitrogen公司);Opti-MEMI减血清培养基(美国Gibco公司)。

1.2 细胞培养

(1)将A549细胞的冻存管从液氮罐中取出，迅速放入 37 ℃水浴中，期间需晃动冻存管使其充分融化，直至冻存管中的物质基本融化。

(2)在超净工作台，向 15 mL 离心管中加入 5 mL RPM 1640 培养基，将冻存管中的液体(1 mL)加入 15 mL 离心管中，800 r/min 离心 5 min，离心管底部可见白色沉淀。

(3)弃去上层液体，向离心管中加入 5 mL 1640 培养基，用移液器吹打混匀，转移至35 mm的细胞培养皿中，放入 37 ℃的 CO2(5%)培养箱中培养。

(4)细胞生长 24 h 后，更换细胞培养液1次。将培养好的细胞用于SECM实验。

1.3 SECM实验

将SECM与倒置显微镜结合，检测A549细胞释放ROS的示意图如图1所示。10 μm Pt超微电极电位设定为 -0.35 V，在含有Ru(NH3)6Cl3的1×PBS溶液中做逼近曲线确定探针与基底间的距离，通过倒置显微镜观察细胞，在恒高模式下对细胞进行SECM的二维成像，扫描速度为50 μm/s。设置探针电位为 -0.65 V，在不含Ru(NH3)6Cl3的1×PBS溶液中并保持氮气气氛条件下检测ROS，利用SECM检测细胞的反馈电流，并进行二维成像扫描。

图1 SECM检测细胞外ROS的示意图Fig.1 Schematic representation of SECM for detection of extracellular ROS parameter：in a nitrogen-purged 1×PBS solution,10 μm Pt ultramicroelectrode, potential: -0.65 V

图2 空白基底上的SECM逼近曲线(黑色)与SECM拟合逼近曲线(红色)Fig.2 SECM experimental approach curves on dish (black)compared to simulated approach curves(red) parameter：1×PBS solution containing 1 mmol/L Ru(NH3)6Cl3,10 μm Pt ultramicroelectrode,potential:-0.35 V

2 结果与讨论

2.1 细胞原位成像

细胞内的ROS通常由细胞内线粒体产生[6]，通过检测细胞外的ROS可反映细胞内ROS的释放，避免了探针对细胞造成的机械损伤。获取信号的探针与细胞之间的距离对于信号的灵敏采集至关重要。因此首先利用逼近曲线确定探针的空间位置，将盛有A549细胞的培养皿置于倒置显微镜载物台上，探针选择性的放置在无细胞的培养皿区域上方，并浸入含有1 mmol/L Ru(NH3)6Cl3的1×PBS溶液，施加 -0.35 V(vs.Ag/AgCl，Ru(NH3)6Cl3的还原电位)电位。探针尖端沿着垂直于水平方向逼近培养皿底部，在电极电流降低至I=0.75I∞时，停止逼近，获得探针的空间高度。如图2所示，所得结果显示电流响应为负反馈模式[12,20]。图中黑实线为实验得到的逼近曲线，红色虚线为模拟曲线，实验中探针电极的RG比为3。根据表格中参数以及公式(1)、(3)计算理论逼近曲线，式中，IT为探针尖端电流，IT,∞为探针离基底无穷远处时探针尖端的电流，a为UME探针尖端半径，d为探针-基底距离，do为从扫描第一点到基底表面的距离，dexp为探针距逼近起始点的距离。其中公式(3)的参数参照表1[21]。将实验所得的数据值绘制为I/I∞与L的函数并重叠理论逼近曲线，比较和分析差异。更改do值，直至找到实际曲线和拟合曲线间的良好拟合。如图2，结合实验与模拟曲线拟合结果[21]，计算出探针尖端与基底间的实际距离d约8 μm。将此位置确定为探针与基底表面之间的检测距离[21]。

IT→I=IT/IT,∞

(1)

dexp→L=d/a=(do-dexp)/a

(2)

I=1/[A+B/L+Cexp(D/L)]

(3)

表1 不同RG值下等式(3)(负反馈)的参数值Table 1 Parameter values for equation(3)(negative feedback)at different RG values

图3 A549细胞的SECM成像图 Fig.3 SECM image of A549 cells parameter：1×PBS solution containing 1 mmol/L Ru(NH3)6Cl3,10 μm Pt ultramicroelectrode,potential: -0.35 V

其后通过显微镜观察，将探针水平定位至细胞区域上方，探针电位设置为-0.35 V，在含有1 mmol/L(Ru(NH3)6Cl3)的1×PBS溶液中，保持检测距离8 μm，通过SECM的恒高模式对细胞进行二维扫描成像。获得的SECM图像如图3所示，图中水平范围为80×80 μm，不同颜色表示所得到的电流大小不同。从上部的二维图像可明显看出扫描区域内有3个椭圆形的细胞(坐标X/Y：33～57/13～38)、(坐标X/Y：20～43/36～65)、(坐标X/Y：42～80/ 65～80)，依次呈绿色、黄色和红色，表示所测得的反馈电流逐步增大，结合下方的三维图像可知细胞的形貌接近橄榄球体。通过测定反馈电流大小得到细胞形貌的原理是因为亲水性物质Ru(NH3)6Cl3不能穿透疏水性细胞膜[22]，细胞表面为电化学惰性底物，细胞与探针顶端之间的极小空间阻碍了Ru(NH3)6Cl3向探针的扩散，且细胞具有一定的高度，导致电流降低。因此，在二维扫描期间IT的减少归因于探针与细胞距离的减小，也对应于细胞高度的增加。

图4 不同浓度H2O2的差分脉冲伏安曲线Fig.4 DPV curves of different concentration of H2O2cH2O2(a-c):0,2,4 mmol/L；detection system：1×PBS solution after deoxygenation

2.2 检测条件的优化

探针电位的准确设置对于ROS检测的灵敏度至关重要。为了优化本体系检测ROS探针的施加电位，利用差分脉冲伏安法(DPV)获得不同浓度H2O2的电化学响应，检测介质为通氮除氧处理的1×PBS溶液，且检测过程保证氮气氛围，所得结果如图4所示。图中可观察到，未加入H2O2时体系所测的DPV曲线无电化学响应(曲线a)；依次对含2 mmol/L和4 mmol/L H2O2的体系进行DPV扫描(曲线b、c)，可观察到在-0.65 V处有1个明显还原峰，且随着浓度增大，还原峰电流增强。通过与文献比对[22]，确定此峰为H2O2的还原峰。因此，最终确定SECM实验中探针电位设为-0.65 V。

在上述优化实验条件下，利用SECM探针收集模式检测了原态细胞中ROS的释放。探针电位设定为-0.65 V，探针位置在逼近处垂直下降4 μm。通过显微镜观察，确定探针位置处于细胞上方，检测体系为1×PBS 溶液(此时体系中无Ru(NH3)6Cl3)，扫描范围为80×80 μm，得到了细胞ROS释放的背景图像。如图5所示，可看出局部电流未出现显著变化，说明此时A549细胞的ROS释放处于平衡状态。

图5 无刺激状态下A549细胞的SECM成像图Fig.5 SECM image of A549 cells without stimulation parameter：in a nitrogen-purged 1×PBS solution,10 μm Pt ultramicroelectrode, potential: -0.65 V

2.3 A549细胞的ROS的实时检测

图6 0.25 μg/mL PMA处理A549细胞后，SECM对细胞的成像图Fig.6 SECM image of A549 cells after treatment of 0.25 μg/mL PMA parameter:in a nitrogen-purged 1×PBS solution at -0.65 V,image:80×80 μm

图7 0.25 μg/mL PMA处理A549细胞后，SECM对细胞的成像图Fig.7 SECM image of A549 cells after treatment of 0.25 μg/mL PMA parameter: in a nitrogen-purged 1×PBS solution at -0.65 V,image:100×100 μm

图8 探针位于A549细胞垂直上方I-t曲线Fig.8 I-t curve of ROS from the A549 cell parameter:in a nitrogen-purged 1×PBS solution contain 0.25 μg/ml PMA at -0.65 V;10 μm Pt ultramicroelectrode was moving down 4 μm from the approach site

SECM技术是直接捕捉电子的转移而获得电信号，所以利用SECM检测细胞中ROS的释放具有实时、灵敏的特点。在优化实验条件下，采用SECM技术考察了PMA刺激A549细胞时的实时氧化应激响应(ROS)，实验条件为：检测体系为通氮除氧的1×PBS溶液(不含有其它氧化还原物质)，检测过程保证氮气氛围，探针电压为-0.65 V，探针位置为逼近处垂直下降4 μm，即时加入的PMA浓度为0.25 μg/mL[23]。图6所示为对应的二维和三维成像图，可观察到在扫描区域内(坐标：X/Y：22～45/10～57)出现1个细胞的明显图像(此细胞标记为A细胞)。且在细胞的不同局部出现了电流负反馈和电流正反馈的不同现象。根据基底产生-探针收集模式[24]推测其电流变化(坐标X/Y：22～45 /10～22)的原因为：对于此检测体系中探针测得的电流(IT)主要来自细胞释放的ROS物质及痕量溶解氧。当加入0.25 μg/mL PMA刺激细胞后，观察到坐标(X/Y：22～45/10～22)处电流呈现负反馈，这是因为在探针顶端和细胞表面的狭小空间内，在无ROS产生的细胞局部，电流只来自于细胞呼吸消耗后剩余的痕量溶解氧，在此处探针检测的电流(IT)由于溶解氧的有限扩散而降低；同时在区域(坐标X/Y：22～45/22～57)电流产生正反馈的原因是由于细胞的另一局部因PMA的刺激产生了大量的ROS，且ROS电流的增加大于背景溶解氧的消耗，探针检测的电流(IT)随ROS的增加而增大，此时这一位置推测为线粒体亚细胞器[17]。

为了获取PMA刺激对A549细胞ROS释放的更多信息，采用在较大扫描范围(100×100 μm)对多个细胞释放ROS的过程进行实时检测。在扫描区域内出现3个完整的细胞图像(如图7)。对应图6的A细胞出现在坐标(X/Y：17～46/56～98)处，仍然显现出部分负反馈的另一部分正反馈的现象；位于坐标(X/Y：41～65/14～51)处的B细胞，显现出两部分的正反馈电流，但电流明显小于A细胞的正反馈电流值(IA=8.364×10-10A ;IB=7.276×10-10A)；位于坐标(X/Y：11～28/13～53)处的C细胞，也显现出两部分的正反馈电流，但电流明显大于A细胞的正反馈电流值(IA=8.364×10-10A ;IC=9.805×10-10A)。3个细胞均检测到不同释放量的ROS。由于细胞的异质性，在电位-0.65 V下，不同细胞个体测得的电流大小不同，说明不同细胞释放ROS的量也不同，其原因可能是细胞具有不同的状态或处于不同的生长周期所致。

为了进一步考察细胞ROS释放的实时动态过程，将探针电位设置为-0.65 V，探针位置恒定在距离C细胞上方，位置为逼近处垂直下降4 μm，考察了电流随时间的变化。结果如图8所示，从图中可以看出，在检测期间(320 s内)，电流随时间的变化呈波动状态，其波动范围平均在每30 s内电流变化4 pA，说明细胞释放ROS的过程为一个脉动过程，且具有一定的规律性，推测与一定的生命活动相关。

3 结 论

本研究发展了一种利用SECM技术检测细胞对外界刺激产生氧化应激反应的简便有效方法。以A549细胞外的H2O2作为测定目标物，在不添加任何标记物的情况下，利用SECM实现了无侵害性地对细胞形貌以及细胞对外界刺激后产生ROS的实时检测。利用SECM扫描成像的特点实时捕捉ROS的释放，得到由于细胞异质性的特点，不同个体细胞在相同刺激环境的条件下产生了不同的氧化应激响应，显示出SECM检测ROS具有灵敏、实时、清晰的独特优点。这一SECM检测平台的建立将在环境污染物等外界化学物对生命体系的健康影响研究中发挥更大的作用。

致谢:非常感谢南密西西比大学(美国)缪五建教授给予的切实帮助和有益讨论。