加速溶剂萃取结合气相色谱-三重四极杆质谱测定枸杞中有机磷农药多残留

冯 春，石志红，吴兴强，胡雪艳，范春林*

(1.河北大学 化学与环境科学学院，河北 保定 071002；2.中国检验检疫科学研究院，北京 100176)

枸杞，又名枸杞子，果实橘红色，味道甜美，通常在夏末秋初收获后晒干，是茄科植物的一个属[1]。由于枸杞具有潜在的药理活性，已有报道多是对其多糖和类胡萝卜素2种主要成分进行研究[2]。多糖已被报道具有保护眼部神经及肝脏[3]、抗氧化和免疫调节的作用[4]；类胡萝卜素中玉米黄素占60%，玉米黄素具有保护视力、抗癌[5]等作用。枸杞中还含有锌、铁、铜、钙、硒和锗[6]等微量元素。因此枸杞既是一种中药材，也可作为保健品，并日益受到人们的青睐。枸杞主要生长在我国中部和中北部的宁夏、青海、山东等地[7]，其在种植过程中需施用嘧啶磷、毒死蜱、甲基毒死蜱[8-9]等有机磷类农药杀灭蚜虫、锈螨、木虱、实蝇等害虫。有机磷农药因具有药效高、选择性强等优点，在全世界范围内广泛使用[10]，但其可致畸、致癌、破坏神经系统而致人死亡，因此有必要对枸杞中有机磷农药残留进行监测。

目前，枸杞中有机磷农药残留的检测方法主要有气相色谱法[11-12]、气相色谱-质谱联用法[9,13]、高效液相色谱-质谱联用法[14-15]。其中，气相色谱法对该类农药的检测灵敏度较低，在日常农药残留检测中使用相对较少；高效液相色谱-质谱联用法应用面较广但其有机溶剂消耗量大；而气相色谱-质谱联用法具有定量准确、灵敏度高等优点，对枸杞等复杂基质检测具有一定优势。枸杞中有机磷农药残留提取多采用均质法[13,15]、分散固相萃取法[16]、基质固相萃取法(MSPD)[11]、超声提取法[9,11]，但实践中发现，由于枸杞含糖量极高，粘度大，采用上述方法提取时，极易造成粘均质刀头和样品结块等现象，从而降低提取效率。加速溶剂较其他提取方法具有自动化程度高、重现性好、提取效率高等优点，已用于枸杞中农药残留的提取[17]，但所报道的方法使用了大量的含氯提取溶剂，且检测灵敏度低。为此，本文建立了加速溶剂萃取结合固相萃取净化的新方法对枸杞样品进行前处理，采用气相色谱-三重四极杆串联质谱对20种有机磷农药进行测定，方法较已有文献具有溶剂消耗少且定量下限低等优点，已成功应用于实际枸杞样品中有机磷农药残留的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Dinoex ASE350加速溶剂萃取仪(美国Thermo Fisher公司)，Agilent 7890A-7000气相色谱-三重四极杆质谱仪(美国Agilent公司)，Rotavapor R-215旋转蒸发仪(Bucci公司)，N-EVAP112型氮吹浓缩仪(美国Organomation Associates公司)，PL602电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)，AH-30全自动均质仪(睿科仪器有限公司)，SR-2DS水平振荡器(日本Taitec公司)，KQ-600B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Cleanert TPH柱(美国Agilent公司)。

20种农药标准品(纯度≥95%)及内标环氧七氯(见表1)均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司;乙腈(CH3CN)、二氯甲烷(CH2Cl2)、正己烷(C6H14)(美国Honeywell公司)和甲苯(美国Fisher公司)均为色谱纯；无水硫酸钠(Na2SO4，分析纯);甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱-质谱条件色谱柱：DB-1701(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度：250 ℃；载气：高纯氦气(纯度99.999%)；流速:1.2 mL/min；进样方式：不分流进样；进样量：1 μL；溶剂延迟:6 min。扫描模式:多重反应监测(MRM)。升温程序：初始温度40 ℃保持1 min，以30 ℃/min升温至130 ℃，再以5 ℃/min升温至250 ℃，最后以10 ℃/min升温至300 ℃，保持7 min。离子源：EI源；离子源电压：70 eV；离子源温度：280 ℃；四极杆温度：150 ℃；传输线温度：280 ℃。

1.2.2 样品的制备称取400 g枸杞、400 g硅藻土置于-40 ℃冰箱中冷冻过夜，然后用中药材粉碎机混匀打碎，制备成混合物粉末试样，置于-20 ℃冰箱中冷藏，备用。

1.2.3 标准溶液的配制分别准确称取10 mg(精确至0.1 mg)20种农药标准品于10 mL容量瓶中，用甲醇(色谱纯)溶解并定容，得到1 g/L单标储备液。根据需要移取一定体积的20种有机磷农药的单标储备液，配制混合标准溶液，于4 ℃环境下避光保存，备用。

1.2.4 样品的提取与净化装好11 mL加速溶剂萃取池，底部加入垫片，装入0.5 g硅藻土，准确称取4 g(精确至0.01 g)制备好的试样加入萃取池，上层填满硅藻土，拧紧萃取池盖。以酸化乙腈(含1% HAc)-二氯甲烷(体积比4∶1)为提取溶剂，萃取温度为70 ℃、冲洗体积为40%、循环萃取3次，每次萃取5 min。提取液超声后，转入80 mL鸡心瓶中，用2.5 mL乙腈润洗收集瓶2次，合并全部收集液于40 ℃水浴旋转蒸发至约2 mL，待净化。Cleanert TPH固相萃取柱中加入约2 cm高无水硫酸钠和6 mL乙腈-甲苯(体积比3∶1)活化萃取柱，弃去流出液。下接50 mL鸡心瓶收集洗脱液，加入待净化样品，用2 mL乙腈-甲苯(3∶1)洗涤鸡心瓶3次，依次加入萃取柱，待液体接近硫酸钠面时，上接贮液器，加入25 mL乙腈-甲苯(3∶1)进行洗脱。收集流出液，于40 ℃水浴旋转蒸发至0.5 mL，加入40 μL环氧七氯内标溶液(用于校正回收率)，氮吹浓缩至干，用1 mL正己烷复溶，过0.22 μm滤膜，上机待测。

2 结果与讨论

2.1 质谱参数的优化

将20种农药稀释至2 mg/L，在m/z50～550范围内进行全扫描，根据谱图确定各农药的保留时间，以质荷比较大、丰度较高的特征离子作为前级离子，对其进行碎裂离子扫描，使碰撞电压在5～40 eV范围内每隔5 eV碰撞1次，每种碰撞能下选出丰度较高的2个特征产物离子作为碎裂离子，其中丰度较高的用于定量分析，另一个用于定性分析。20种农药的CAS、保留时间、离子信息、碰撞能量列于表1，总离子流色谱图见图1。

表1 20种农药及内标的CAS、保留时间、离子信息、碰撞能Table 1 CAS,retention times(RT),ion pairs information,collision energy(CE) for 20 pesticides and internal standard

图1 20种农药及内标的混标溶液(2 mg/L)总离子流色谱图Fig.1 TIC chromatogram of 20 pesticides and IS standard solution(2 mg/L) the peak numbers 1-21 are the same as those in Table 1,other numbers represent segmentation method of MRM(峰上所表示的数字与表1中的数字相同,其他数字表示MRM分段方法)

2.2 萃取方法的优化

2.2.1 萃取溶剂的选择萃取溶剂是影响目标物回收率的重要因素之一，因此实验考察了酸化乙腈(1% HAc)、乙腈-二氯甲烷(体积比4∶1、3∶2)、酸化乙腈(1% HAc)-二氯甲烷(体积比4∶1) 4种萃取溶剂对20种农药回收率的影响。结果显示，采用酸化乙腈提取时，20种农药回收率合格(在70%～120%范围内)的仅1个，占比5%；以乙腈-二氯甲烷(体积比4∶1)提取时，回收率合格的农药有13个，占比65%；调节乙腈-二氯甲烷的体积比为3∶2时发现，95%(19个)的农药回收率满足要求；而采用酸化乙腈(1% HAc)-甲烷(体积比4∶1)时20种农药的回收率均合格。这是因为枸杞中的糖和油脂使其基质粘性较大，仅采用乙腈提取时，基质在乙腈表面形成不可逆包覆等因素阻碍了乙腈与基质的有效接触而使部分农药回收率较低[18]。另外，实验还发现酸性溶剂有利于有机磷的提取，但二氯甲烷比例过高会导致共萃物增加，因此选择酸化乙腈(1% HAc)-二氯甲烷(体积比4∶1)作为提取剂。

2.2.2 萃取温度的考察实验考察了不同萃取温度(50、60、70、80 ℃)对20种有机磷农药回收率的影响。结果显示，当萃取温度升高时，20种农药的回收率均明显提高，在70 ℃时大部分农药回收率达到最高，继续升高温度，部分农药的回收率反而下降，其原因可能是温度过高导致基质效应增强，使得部分农药回收率减小，因此选择70 ℃为最佳萃取温度。

2.2.3 冲洗体积冲洗体积是影响加速溶剂萃取的条件之一，因此实验考察了冲洗体积(20%、30%、40%、50%)对回收率的影响。结果表明，当冲洗体积为40%时，全部农药的回收率最佳，均在70%～120%范围内。因此冲洗体积选择40%。

2.2.4 循环次数实验考察了循环次数为1、2、3次的萃取效率。结果显示，循环次数为3次时，20种农药的回收率达到最佳，为75%～100%。因此设置循环次数为3次。

2.2.5 萃取时间考察了萃取时间为1、3、5、7 min时20种农药的提取效率。结果显示，当萃取时间为1、3 min时，回收率合格的农药占比不足25%；萃取5 min时，回收率均合格；但萃取时间为7 min时，反而有3种药物的回收率不合格。究其原因，萃取时间过短时，部分药物被洗脱下来；萃取时间过长会导致基质效应增强，对药物的吸附作用增强，因此选择最佳萃取时间为5 min。

2.3 净化条件优化

2.3.1 固相萃取柱的选择实验考察了Cleanert TPH柱、C18柱、Carbon-NH2柱、PSA柱4种固相萃取柱的净化效果(图2)。结果显示，Cleanert TPH柱的萃取效率最高，与文献报道[19]一致，这源自于Cleanert TPH柱中填料可以去除提取物中的色素、酸性干扰物质、糖分以及酯溶性物质，并且不会干扰目标物的提取。因此选择Cleanert TPH柱作为萃取柱。

图2 固相萃取柱的选择Fig.2 Selection of solid phase extraction cartridge the pesticide numbers 1-20 are the same as those in Table 1

2.3.2 淋洗液的选择实验考察了正己烷-丙酮(体积比4∶6)和乙腈-甲苯(体积比3∶1)为淋洗液时对药物回收率的影响。结果发现，后者对药物洗脱更完全，因此确定淋洗液为乙腈-甲苯(体积比3∶1)。

2.4 基质效应

2.5 线性范围、检出限与定量下限

以枸杞空白样液配制1、2、5、10、20、50、100、200、500 μg/kg的20种农药标准溶液，在优化条件下测定，以各农药的定量离子对峰面积为纵坐标，对应浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，20种农药在一定的浓度范围内线性良好，相关系数(r2)为0.999 0～0.999 8；分别以3倍和10倍信噪比计算得20种农药的检出限(LOD)为0.2～5.0 μg/kg，定量下限(LOQ)为1.0～15.0 μg/kg(见表2)。该方法检出限较低，表明加速溶剂萃取效果较好，适用于枸杞基质中有机磷农药残留的检测。

2.6 加标回收率与精密度

向空白样品中添加一定浓度的20种农药标准溶液，使其含量分别为20、40、100 μg/kg，每个水平平行5个样品，在优化条件下测定，计算加标回收率与相对标准偏差(RSD)。结果表明，20种农药在3个加标水平下的平均回收率分别为70.0%～80.9%、70.8%～82.9%、70.1%～81.0%，RSD均不高于8.5%。表明该方法的准确度和精密度较高，可用于实际样品种农药残留的定量分析。

表2 枸杞中20种农药的回收率、相对标准偏差、线性范围、相关系数、检出限及定量限Table 2 Recovery,relative standard deviation,linear range,correlation coefficients(r2),limits of detections(LODs) and limits of quantitation(LOQs) of 20 pesticides in Chinese wolfberry

the number denoted was the same as that in Table 1(所表示的数字与表1中的数字相同)

2.7 实际样品检测

购买青海等地枸杞样品10例，在优化条件下采用本方法检测，结果发现其中2例样品分别检出毒死蜱和丁基嘧啶磷，含量分别为293.6、2.1 μg/kg。阳性样品的MRM图见图3。

图3 实际样品MRM图Fig.3 MRM chromatograms of 2 actual samples

3 结 论

本文通过优化加速溶剂萃取条件和SPE净化条件，建立了GC-MS/MS测定枸杞中20种有机磷农药残留的分析方法。该方法定量准确、检出限低，适用于枸杞中有机磷农药残留的检测。