聚合离子液体-多壁碳纳米管化学修饰电极同时测定多巴胺、抗坏血酸与尿酸

张 玲，矫淞霖，张 慧，迟晓平，张 谦，张洪波

(1.沈阳师范大学 化学化工学院，辽宁 沈阳 110034;2.辽宁大学 化学院,辽宁 沈阳 110036)

多巴胺(DA)、抗坏血酸(AA)、尿酸(UA)是人体新陈代谢中3种重要的生物小分子。人体缺乏多巴胺可导致精神分裂、帕金森病等；缺乏抗坏血酸可导致坏血病；尿酸代谢紊乱则会引起痛风。因此，能够对3种物质进行精确检测，对这些疾病的诊断具有重要意义[1-2]。

目前，毛细管电泳法[3]、液相色谱法[4]、液相色谱-串联质谱法[5]、荧光法[6]和电化学法[7]已广泛用于生物分子的检测。其中，电化学法因具有选择性高、灵敏度好、操作简单和成本较低等特点而受到研究者的关注。由于AA、DA、UA均为具有电化学活性的生物小分子，因此，采用电化学方法检测上述物质具有一定的优势。但AA、DA和UA通常共存于相同的生理环境中，3者的氧化峰电位十分接近，使用常规电极进行检测时，其电化学响应信号会互相干扰，致使检测的灵敏度低且选择性不高[1]。为了实现AA、DA和UA的同时检测，以聚合物[8]、纳米材料[9]、离子液体[1]等为修饰材料的修饰电极应运而生。

多壁碳纳米管自1991年被发现以来，由于其独特的几何结构、良好的机械强度、良好的导电能力和较强的催化性能，得到了广泛的应用[10]。但多壁碳纳米管因表面具有大π键，使得其在水和有机溶剂中的分散存在团聚、分散性差等问题[11]。且碳纳米管在单独使用时，易从电极表面脱落，导致电极寿命短。所以在使用时，通常要对其进行酸化或表面改性，从而达到增强碳纳米管反应活性和分散性的目的。共轭改性和非共轭改性是实现碳纳米管改性的常用手段。共轭改性会使碳纳米管的结构、性能均发生很大改变[12]；非共轭改性可在增加其他功能性的基础上，基本保持碳纳米管原有的结构与性能[13]，其通常利用碳纳米管中处于sp2杂化碳原子的离域π电子，与具有离域π电子的其他化合物(聚合物、表面活性剂或芳香化合物)之间通过π-π键结合来实现。

离子液体具有蒸汽压低、化学和热稳定性好、电化学窗口宽、离子导电率高等优势并具有一定的离子特性[14]。2003年，Fukushima等[15]研究表明，单壁碳纳米管与含咪唑基团的离子液体之间可形成很强的作用力，但其在应用过程中存在离子液体从电极表面脱落的问题[16]。聚合离子液体(PIL)作为一种新型材料，兼具离子液体和聚合物的特性，如离子特性、良好的成膜性、导电性、热稳定性等[17]。2011年本研究组合成了聚合离子液体功能化石墨烯，并以此复合物为基底，制备出稳定的GOD/poly(ViBuIm+Br-)-G/GCE修饰电极，实现了对葡萄糖的检测[18]。此外，Marcilla使用单壁碳纳米管与聚合离子液体为原料，制备出SWCNT/PIL复合物，并研究了该复合物在电致变色器件中的应用[17]。2009年Wu等[19]制备出PtRu/CNTs-PIL和Pt/CNTs-PIL复合物，并利用多壁碳纳米管和贵金属纳米粒子的催化特性，研究了上述复合物对甲醇的电催化氧化性能。目前尚无使用非共轭法制备聚合离子液体-多壁碳纳米管进行电极修饰并用于电化学检测AA、DA、UA的相关文献报道。

本文利用聚合离子液体单元中的咪唑基团和多壁碳纳米管间的强π-π作用，制备出聚(1-乙烯-3-乙基咪唑溴代盐)-多壁碳纳米管复合物(Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs)。通过简单的滴涂方法即可制备得到相应的修饰电极。通过研究DA、AA、UA在Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE上的电化学响应，可实现该电极对AA、DA和UA的同时测定，从而建立了聚合离子液体-多壁碳纳米管化学修饰电极同时测定多巴胺、抗坏血酸和尿酸的分析方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1-乙烯基咪唑、乙酸乙酯、1-溴乙烷、二甲基甲酰胺(DMF)、偶氮二异丁腈、氯仿(国药试剂公司)；AA、DA、UA(美国Sigma公司)；以上试剂均为分析纯。未酸化多壁碳纳米管由清华大学化工系反应工程实验室提供；实验用水均为二次蒸馏水，实验均在室温下进行。CHI620B型电化学工作站(上海振华仪器有限公司)，实验采用三电极体系：Pt电极作为辅助电极，饱和Ag/AgCl电极作为参比电极，化学修饰电极作为工作电极。

1.2 实验方法

1.2.1 Poly(ViEIm+Br-)/MWCNTs复合物的制备根据文献方法合成Poly(ViEtIm+Br-)[20]：将1-乙烯基咪唑和1-溴乙烷(摩尔比为1∶1.9)在80 ℃下，油浴回流48 h。得到的产物用乙酸乙酯重结晶，抽滤，真空干燥，最终得到淡黄色固体1-乙烯基-3-乙基咪唑盐。在氯仿溶液中，通过氮气保护，在70 ℃下，以偶氮二异丁腈(AIBN，0.04 g)为引发剂，引发1-乙烯基-3-乙基咪唑(2 g)盐的自由基聚合反应，8 h后，将浅黄色的产物用氯仿洗涤数次，真空干燥得到黄色固体Poly(ViEtIm+Br-)。

取3 mg Poly(ViEtIm+Br-)和3 mg MWCNTs放入研钵中研磨30 min后，用6 mL水将反应物转移至小烧杯中，超声分散5 min，得到黑色、均一的悬浊液。离心(3 000 r/min，3 min)除去未分散的MWCNTs。将上清液高速离心(12 000 r/min，30 min)，除去上清液，用水洗涤，此离心/洗涤过程重复3次以除去未复合的Poly(ViEtIm+Br-)。真空干燥后，即得到Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs复合物。

1.2.2 Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE的制备将4 mg Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs与2 mL水混合，超声30 min后，配制成2 mg/mL Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs分散液。取10 μL上述分散液分2次(每次5 μL)均匀涂覆于抛光后的玻碳电极(Φ=3 mm)表面，隔夜干燥后即得到Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE。

1.2.3 MWCNTs/GCE的制备将1 mg MWCNTs与1 mL二甲基甲酰胺(DMF)混合，制备出MWCNTs-DMF混合液。取10 μL该混合液滴涂于抛光后的玻碳电极(Φ=3 mm)表面，待其干燥即制得MWCNTs/GCE。

2 结果与讨论

2.1 Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs复合物的表征

采用FT-IR技术对不同材料的性质进行表征，图1为MWCNTs(a)、Poly(ViEtIm+Br-)(b)与Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs(c)的红外光谱对比图。从曲线a中可观察到MWCNTs的红外吸收曲线并无明显的吸收峰[21]。曲线b可观察到在2 800～3 300 cm-1和1 556 cm-1处出现吸收峰，其对应于Poly(ViEtIm+)结构[20]，在Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs复合物的红外谱图(曲线c)中同样可观察到上述吸收峰。实验结果表明，Poly(ViEtIm+Br-)与MWCNTs已成功复合，实现了MWCNTs的功能化。

图2为Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs的TEM图。如图所示，碳纳米管并未纠缠在一起或断裂成碎片，该检测进一步验证了聚合离子液体与碳纳米管之间的π-π相互作用可有效保持碳纳米管初始结构，且聚合离子液体的存在为碳纳米管引入了大量正电荷，使得碳纳米管之间的静电力相互排斥，具有分散性，可以与水形成稳定的分散体系。

2.2 Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE的稳定性研究

在PBS溶液中，对Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE进行循环伏安扫描，连续扫描50圈后，循环伏安曲线中的电流值并未发生显著变化，说明Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE的稳定性良好。

2.3 不同化学修饰电极对AA、DA和UA的电催化性能研究

分别考察了DA、AA和UA在GCE和Poly(ViEtIm+Br-)/GCE、MWCNTs/GCE和Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE上的循环伏安曲线。结果显示，在GCE上，AA、DA和UA的氧化峰分别位于308、234、324 mV。AA-DA、DA-UA间氧化峰电位差分别为74 mV和90 mV(图3A)。3者峰位相近，峰位差很小，因此同时测定时3种组分会形成相互干扰，无法实现AA、DA和UA的同时测定。在Poly(ViEtIm+Br-)/GCE上也存在AA、DA、UA峰位差互相接近的相似结果(图3B)。然而，电极在经过MWCNTs修饰后(MWCNTs/GCE、Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE)，可发现AA和DA在MWCNTs/GCE(图3C)、Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE(图3D)上的氧化峰峰位均发生了明显负移。且UA在Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE上的氧化电位(348 mV)相对于MWCNTs/GCE(361 mV)表现出进一步负移。通过以上研究，可以发现MWCNTs对电极的修饰可有效降低AA、DA、UA在电极表面的氧化电位，体现了MWCNTs具有良好催化作用的特性[22]；同时，在pH 7.4的PBS溶液中，由于UA(pI=5.75)带有负电荷，MWCNTs在聚合离子液体功能化后具有良好的协同效应，即在碳纳米管保持导电性的基础上引入了大量正电荷，使得该复合物与AA、UA具有静电吸引作用，这种协同效应使AA和UA可以在电极表面充分接触，进而增强电极的电子传输性能。

图3 1 000 μmol/L DA、1 000 μmol/L AA和1 000 μmol/L UA溶液分别在GCE(A)和Poly(ViEtIm+Br-)/GCE(B)、MWCNTs/GCE(C)和Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE(D)上的循环伏安曲线Fig.3 CV curves of 1 000 μmol/L DA,1 000 μmol/L AA and 1 000 μmol/L UA solution at GCE(A),Poly(ViEtIm+Br-)/GCE(B),MWCNTs/GCE(C) and Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE(D),respectively 0.1 mol/L PBS，pH 7.4,scan rate:100 mV/s

图4 1 000 μmol/L AA、 DA和 UA混合溶液在GCE(a)、MWCNTs/GCE(b)和Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE(c)上的循环伏安曲线Fig.4 CV curves of mixed solution containing 1 000 μmol/L AA,DA and UA at GCE(a),MWCNTs/GCE(b)and Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE(c) scan rate:100 mV/s,pH 7.4 PBS buffer

在此基础上，进一步比较了AA、DA、UA在不同电极表面的循环伏安响应电流。对比图3A和图3B，可以发现DA、UA在Poly(ViEtIm+Br-)/GCE上的氧化峰电流较GCE均表现出降低的趋势，这说明聚合离子液体对DA、UA的电子转移具有“阻塞效应”[23]。而AA、DA、UA在MWCNTs/GCE(图3C)表面的氧化电流较GCE和Poly(ViEtIm+Br-)/GCE均有明显增强，此现象进一步说明MWCNTs对AA、DA、UA的催化作用。当Poly(ViEtIm+Br-)与MWNTs复合后，尽管Poly(ViEtIm+Br-)对DA、UA的电子转移具有阻塞效应，AA、DA和UA在Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE(图3D)上的氧化峰电流仍显著增加，电流的大小为MWCNTs/GCE的1.5～3.0倍。上述结果表明Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs复合物对AA、DA和UA的氧化具有协同效应，能够有效改善电极对AA、DA、UA的氧化催化性能并促进三者的在电极表面的电子转移[24]。

图4对比了GCE、MWCNTs/GCE和Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE对1 000 μmol/L AA、 DA和 UA混合液的测定。曲线a表示AA、DA和UA混合样品在GCE上的循环伏安响应，其阳极显示出两个很宽的氧化峰，且电流响应微弱，根据峰位判断，AA和DA的氧化峰重叠，因此无法实现对3种物质的同时测定。曲线b表示混合液在MWCNTs/GCE上的循环伏安响应，在该循环伏安曲线阳极枝上，于45 mV、197 mV和338 mV处观察到3个独立的氧化峰，分别对应AA、DA和UA的电化学氧化。其中，DA-AA峰电位差为152 mV，DA-UA峰电位差为141 mV。由于AA、DA、UA在MWCNTs/GCE上分峰明显且峰差较大，因此MWCNTs/GCE有利于实现对AA、DA和UA 3者的同时测定。混合液在Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE上的循环伏安响应曲线显示，AA、DA和UA在该曲线的阳极枝上同样出现3个明显的氧化峰(曲线c)，相对于MWCNTs/GCE，AA、DA、UA在Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE表面的氧化电流明显增加，其对应的峰电位分别为-26 、189、346 mV，其中，AA-DA峰电位差为215 mV，DA-UA峰电位差为157 mV，表明其在Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE上的峰电位差更大。其原因可能是因为Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs复合物中由于聚合离子液体的存在，使得电极表面具有大量的正电荷，有利于AA、DA、UA在电极表面的选择性催化[19,25-26]；与此同时，由于聚合离子液体与碳纳米管之间的作用力为π-π吸附，纳米管的物理化学性质(如导电性、催化特性等性质)未被破坏，有利于促进AA、DA、UA在电极表面的催化氧化[27]。因此，Poly(ViEtIm+Br-)与MWCNTs的协同效应使Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE对AA、DA、UA具有更好的选择性响应和电催化增强性能[28]。

2.4 溶液pH值对AA、DA、UA氧化峰电流及其峰位差的影响

采用循环伏安法考察了不同pH值(5.7、6.0、6.5、7.0、7.4、8.0)溶液对AA、DA和UA在Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE上氧化峰电流及峰电位差的影响，结果如图5所示。其中，图5A为pH值对AA、DA和UA 3者氧化峰电流的影响。可以看到，AA、DA和UA均在pH 7.4时呈现最大的氧化峰电流。pH值对AA、DA和UA间氧化峰位差的影响研究显示，AA-DA的氧化峰位差在pH为5.7时具有最大值，随着pH值升高，峰电位差缓慢缩小，在pH 7.0时达到最小，pH 7.4时，峰位差再次呈现增大趋势，而后减小。AA-UA的氧化峰位差从pH 8.0到5.0区间内，随着pH值的减小，峰位差整体呈现逐渐增大的趋势。DA-UA的氧化峰位差随着pH值的变化，整体起伏并不明显，且在pH 7.0时具有最大的峰电位差。综合考虑pH值对峰电位差和峰电流的影响，pH值为7.4时，AA-DA和DA-UA的氧化峰电位差较大，对应的AA、DA、UA响应电流较高，且该pH值与人体生理pH环境相当，因此本实验选择pH 7.4为最佳检测条件。

图5 50 μmol/L DA、400 μmol/L AA和50 μmol/L UA在Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE上的氧化峰电流(A)及氧化峰电位差(B)与pH值的关系Fig.5 Effects of pH values on peak current(A)and peak potential(B) of 50 μmol/L DA,400 μmol/L AA and 50 μmol/L UA on Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE

2.5 Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE选择性检测AA、DA和UA的研究

为考察Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE选择性检测AA、DA和UA的可行性，本实验采用DPV技术，在3种组分共存时，改变其中1种组分浓度，固定其他2种组分浓度的条件下，分别考察了AA(图6)、DA(未列出)和UA(未列出)在Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE上随着浓度不同，氧化峰电流的变化情况。

图6 含有不同浓度AA的混合液(DA和UA浓度分别为40 μmol/L和 60 μmol/L)在Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE上的DPV图Fig.6 DPV curves of different concentrations of AA in mixture containing 40 μmol/L DA and 60 μmol/L UA at Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE AA concentrations:50,100,400,600,800,1 000,1 200,1 400,1 600,1 800,2 000,2 200,2 400,2600,2 800,3 000,3 200,3 400,3 600,3 800,4 000,4 200,4 600,4 800,5 000 μmol/L;scan rate:50 mV/s,0.1 mol/L PBS,pH 7.4；insert:calibration curve between AA concentration and current

如图6所示，固定DA和UA浓度分别为40、60 μmol/L，改变AA的浓度，可观察到AA的峰电流随着其浓度的增大而增长。以AA浓度为横坐标，其氧化峰电流为纵坐标作图，可以看到，在50～2 400 μmol/L范围内(IAA=0.026 80cAA-0.056 21，r2=0.992 5)和在2 600～5 000 μmol/L范围内(IAA=0.014 53cAA+28.42，r2=0.994 3)，AA的浓度与电流响应具有线性关系(图6插图)。同样，固定AA和UA浓度分别为400、60 μmol/L，改变DA浓度，考察DA峰电流的变化规律，结果显示，DA浓度在2～180 μmol/L范围内与其电流存在线性关系，其线性方程为IDA=0.389 5cDA-3.330(r2=0.996 8)。固定AA和DA浓度分别为400、40 μmol/L，改变UA浓度，结果显示，UA的峰电流同样随其浓度的增大而表现为线性增长，在4～50 μmol/L范围内，其线性方程为IUA=1.298cUA+9.831(r2=0.994 1)。经计算，得到AA、DA和UA检出限(S/N=3)分别为22.2、0.4、0.9 μmol/L。

通过文献对比，发现本实验中Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE对AA、DA、UA的检测性能优于空心氮掺杂碳纳米微球修饰电极(HNCMS/GC)[29]；与通过聚合离子液体单体自由基聚合而制备的聚合离子液体-碳纳米管修饰电极相比(PIL-MWCNT/GCE)[24]，Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE对AA的检测具有更宽的线性范围，对DA具有更低的检出限。

2.6 实际样品的测定与回收率

在优化条件下，使用Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE对维生素C注射剂中的AA和盐酸多巴胺注射剂中的DA含量进行分析。测定过程中，需将维生素C注射剂或盐酸多巴胺注射针剂用0.1 mol/L pH 7.4的PBS稀释至合适浓度，然后采用DPV法对溶液进行检测。为了验证该方法的有效性,采用标准加入法在样品中加入一定浓度的AA、DA标准溶液，然后分别测定AA、DA的含量，测定结果如表1所示。

由表1可知，在维生素C注射剂样品中，测得AA的回收率为98.9%～101%；在盐酸多巴胺注射剂样品中，测得DA的回收率为98.8%～101%，二者相对标准偏差(RSD)均小于3%。以上结果表明该方法具有较好的回收率，该电极在实际样品检测中的精确度和准确性较高。

表1 维生素C注射剂及盐酸多巴胺注射剂中AA、DA的测定Table 1 Determination of AA and DA in Vitamin C injection and dopamine hydrochloride injection

2.7 Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE的稳定性与重现性

以Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE为工作电极，在含有AA(600 μmol/L)、DA(50 μmol/L)及UA(30 μmol/L)的pH 7.4 PBS中进行循环伏安扫描，使用同一工作电极重复实验6次，计算其RSD分别为2.4%、1.2%和2.6%。电极干燥5d后，在相同条件下，AA、DA和UA的电流响应分别下降3.0%、2.5%和3.4%。由此可见，该电极的重现性和稳定性较好。

3 结 论

本文将聚合离子液体与多壁碳纳米管相结合，使用非共轭法成功制备出聚合离子液体-多壁碳纳米管复合物(Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs)。通过红外光谱及TEM技术进一步对该复合物的性质及结构进行表征。利用该复合物分散性良好，且聚合物成膜性良好的特点，通过简单滴涂的方式即可形成均匀稳定的电极修饰薄膜(Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE)。在此基础上，研究了AA、DA、UA在该电极表面的电化学行为，结果显示该电极对AA、DA、UA具有优异的电化学催化活性，3者分峰明显，可实现3种物质的同时测定。将Poly(ViEtIm+Br-)/MWCNTs/GCE用于维生素C注射剂中AA和盐酸多巴胺注射剂中DA的测定,检测效果良好。本方法进一步扩展了离子液体修饰化碳基材料在实际电化学分析中的应用。