分散固相萃取结合UPLC-MS/MS测定柑桔中青霉素G及其代谢物残留

周 杰，赵 静，董 超，张耀海，赵其阳，焦必宁

(中国农业科学院/西南大学柑桔研究所，农业农村部柑桔产品质量安全风险评估实验室(重庆)，农业农村部柑桔及苗木质量监督检验测试中心，重庆 400712)

柑桔是世界第一大水果，我国的柑桔种植面积和产量均居世界第一，但柑桔黄龙病、溃疡病等检疫性病害严重威胁我国柑桔业的发展。研究表明，通过叶面喷施或树干注射青霉素G对防治柑桔黄龙病有效[1]。青霉素G属于β-内酰胺类抗生素，广泛应用于人和动物疾病治疗、畜牧养殖以及种植业。其在酸、碱、亲核试剂、氧化剂等条件下易发生开环反应，产生的代谢物主要为青霉二酸(Penillic acid)和去羧青霉噻唑酸(Penilloic acid)[2]。这些代谢物无抗菌活性，但3%～5%的青霉素过敏反应与其有关[3]，其中去羧青霉噻唑酸是造成过敏反应的主要原因[4]。我国农业部235号公告[5]和欧盟指令No.37/2010/EU[6]规定青霉素类药物在动物性食品中的最大残留限量为50 μg/kg，但对植物性食品未设相应限量。因此，建立柑桔中青霉素G及其代谢物残留的检测方法，对于研究青霉素在柑桔中的残留降解代谢规律，以及制定符合良好农业规范(GAP)的安全使用规程具有重要意义。

目前，食品中青霉素类药物残留的分析方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[7]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[8]、近红外光谱法(NIR)[9]、表面增强拉曼光谱法(SERS)[10]和酶联免疫吸附测定法(ELISA)[11]等，样品多为乳类、肉类、蛋类、水产品以及蜂蜜等动物性食品，而对植物性食品的检测鲜有报道[2,12-13]。Aldeek等[2,12]建立了固相萃取结合超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)分析柑桔中青霉素G、青霉二酸和去羧青霉噻唑酸的方法，青霉素G的回收率为90%～100%，青霉二酸和去羧青霉噻唑酸的回收率为50%～73%。随后利用该方法测定了柑桔果汁中的青霉素G及其代谢物，青霉素G的回收率接近100%，青霉二酸和去羧青霉噻唑酸的回收率为60%～75%[13]。但该方法操作繁琐，耗时费力，所用同位素内标的成本较高，且代谢产物的回收率偏低。

本研究采用分散固相萃取(DSPE)前处理技术，结合UPLC-MS/MS法，建立了柑桔中青霉素G、青霉二酸和去羧青霉噻唑酸的快速测定方法。该方法操作简单、快速准确、灵敏度高、重现性好，检测成本低，可作为植物源食品中青霉素G及其代谢物的常规检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Acquity UPLC-Quattro Premier XE超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Waters公司)，配有电喷雾离子源(ESI)和MassLynx 4.1工作站；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)；CL31/CL31R多用途离心机(美国Thermo Fisher公司)；KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；有机相针式滤器(0.22 μm，上海安谱科学仪器有限公司)；Oasis HLB柱(6 mL/500 mg，美国Waters公司)；ENVI C18柱(12 mL/2 000 mg，美国Supelco公司)。

甲醇、乙腈(色谱纯，德国CNW 公司)；甲酸(色谱纯，成都市科龙化工试剂厂)；N-丙基乙二胺(PSA，德国CNW公司)；超纯反相C18填料(加拿大SiliCycle公司)；实验用水为Milli-Q超纯水。标准品：青霉素G(97.2%，德国Dr.Ehrenstorfer公司)；青霉二酸(99.3%)、去羧青霉噻唑酸(95.0%，德国LGC GmbH公司)。

1.2 标准溶液的配制

以乙腈-水(1∶1，体积比)为溶剂分别配制500 mg/L青霉素G、1 000 mg/L青霉二酸和1 000 mg/L去羧青霉噻唑酸单标储备液，再分别移取适量单标储备液，以乙腈-水(1∶1)定容，配成质量浓度均为100 mg/L的3种目标物混合标准储备液，于棕色容量瓶内-50 ℃保存。测定时以乙腈-水(1∶1)逐级稀释至所需浓度，现用现配。

1.3 样品前处理

准确称取均质的柑桔果皮、果肉及全果样品5 g(精确至0.01 g)于50 mL具塞离心管中，加入10 mL 80%乙腈，涡旋混匀30 s后，超声提取15 min，于4 ℃下以10 000 r/min离心5 min，将上清液倒入另一50 mL具塞离心管中。残渣中加入10 mL 80%乙腈，重复提取1次(果皮重复提取2次，最后1次加入9 mL提取剂)，合并提取液并用80%乙腈定容至25 mL(果皮定容至30 mL)。上述提取液经涡旋混匀后，取2 mL转移至装有50 mg C18的离心管中涡旋2 min，3 000 r/min离心5 min，上清液过0.22 μm有机滤膜后，待测定。

1.4 色谱-质谱条件

1.4.1 色谱条件Waters Acquity UPLC®HSS T3 色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)； 流动相：A为乙腈，B为0.1%甲酸溶液。梯度洗脱程序：0～6.0 min，5% ～60% A；6.0～8.0 min，60%～90% A；8.0～9.0 min，90%～5% A。流速0.25 mL/min；柱温35 ℃；样品室温度20 ℃；进样量5 μL。

1.4.2 质谱条件电喷雾离子源(ESI)；正离子扫描；毛细管电压3.5 kV；射频透镜电压0.1 V；离子源温度120 ℃；锥孔反吹气流量50 L/h；脱溶剂气温度380 ℃；脱溶剂气流量800 L/h；光电倍增器电压650 V；碰撞气体为氩气，碰撞气压0.18 Pa；多反应监测(MRM)模式检测。其它质谱参数见表1。

表1 青霉素G及其代谢物的质谱参数Table 1 MS/MS parameters for penicillin G and its metabolites

*quantitative ion

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 提取剂的选择用于青霉素类抗生素残留分析的提取剂多为乙腈、水、乙腈-水溶液、甲醇以及磷酸盐缓冲液等。由于甲醇含有羟基，会加速青霉素G降解为去羧青霉噻唑酸酯[8]，而磷酸盐缓冲液不易挥发，会污染离子源，降低质谱的检测性能。因此，实验比较了不同比例乙腈水溶液的提取效果。结果显示，纯乙腈提取的回收率可满足要求(>70%),但提取液颜色深，杂质较多;随着水的比例增加，提取液的颜色变浅，但青霉素G和去羧青霉噻唑酸的回收率逐渐降低；而用80%乙腈提取时，3种分析物的回收率均能达到75%，且色素提取相对较少。因此，本实验选择80%乙腈作为提取剂。

图1 不同净化方式对3种分析物提取率的影响Fig.1 Effects of clean-up method on recoveries of three analytes

2.1.2 提取剂体积的选择以加标水平为100 μg/kg的果皮为研究对象，考察了80%乙腈的体积(5、10、15 mL )对3种分析物提取效率的影响。结果表明，当提取剂体积为5 mL时，3种分析物的回收率均较低，而提取剂体积为10 mL和15 mL时，回收率均能达到70%以上。但提取剂体积越大，稀释倍数越高，方法的灵敏度会降低。综合考虑，选用提取剂体积为10 mL。

2.1.3 提取次数的选择考察了提取次数(1、2、3、4次)对分析物回收率的影响，结果表明，分析物的回收率随着提取次数的增加而增大。对于果肉和全果，提取2次的效果与提取3次和4次无显著差异;而果皮提取3次的效果与提取4次无显著差异。因此，采用果肉、全果提取2次，果皮提取3次。

图2 3种分析物混合标准溶液(100 μg/L)的总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatogram of three analytes mixed standard solution(100 μg/L)

2.1.4 净化方式的选择目前，测定动物性食品中青霉素类药物残留的常用净化方法为固相萃取法(SPE)，所用小柱主要是HLB柱和C18柱；其次为分散固相萃取法(DSPE)，所用吸附剂主要是C18和PSA。因此，以加标水平为100 μg/kg的果皮为研究对象，比较了SPE-HLB、SPE-C18、DSPE-C18、DSPE-PSA净化方式的效果(图1)。结果显示，经两种SPE柱净化后的样品中杂质较少，色谱图无明显干扰，但青霉素G的回收率均低于50%。这可能是由于青霉素G在洗脱至浓缩过程中发生降解，并且C18和HLB均为反相层析填料，目标化合物的极性越大则在柱上的保留能力越弱，因此对于极性较强的青霉素G回收率偏低，这与文献[14]研究结果相符。此外，SPE小柱成本较高，操作繁琐，不适用于处理大批量样品。而经DSPE净化后，3种分析物的回收率优于SPE，因此采用DSPE净化。采用PSA进行DSPE净化时青霉二酸的回收率低于60%，这可能与弱碱性的PSA会与酸性的青霉二酸发生作用有关；而采用C18进行DSPE净化得到的回收率较好，这是由于C18吸附剂的比表面积大、吸附能力强，可较好除去脂类、脂肪等非极性物质的干扰。因此选用C18进行DSPE净化。

2.1.5 净化剂用量的选择以加标水平为100 μg/kg的果皮为研究对象，分别考察了C18用量(0、25、50、75、100 mg)对3种分析物净化效果的影响。结果表明，随C18用量的增加，分析物的回收率整体呈先增加后降低的趋势。C18用量为25 mg时的回收率最好，但净化效果差于50 mg C18。其中C18用量对两种代谢物的影响相对较小，两者的回收率基本在80%以上；而对于青霉素G，当C18用量超过50 mg时，其回收率大幅下降，这可能是由于过量的净化剂会吸附青霉素G所致。因此，选择净化剂C18用量为50 mg。

2.2 仪器条件的优化

2.2.1 色谱条件的优化UPLC-MS/MS分析中多选择甲醇或乙腈作有机相，由于甲醇会使青霉素G降解，且乙腈-水体系的峰形优于甲醇-水体系[15]，故选择乙腈为有机相。由于青霉素G及其代谢物在水溶液中以离子状态存在，为增强分析物在色谱柱上的保留并提高离子化效率，在流动相中加入甲酸或乙酸等挥发性酸。实验考察了在水相中分别添加0.05%、0.1%、0.15%和0.2%甲酸对仪器灵敏度和分离度的影响。结果显示，甲酸体积分数对灵敏度的影响不大，但0.1%甲酸的效果略好，因此选择乙腈-0.1%甲酸为流动相。最优色谱条件下各分析物的总离子流色谱图见图2，3种目标分析物可在5 min内有效分离。

2.2.2 质谱条件的优化将100 μg/L的青霉素G及其代谢物标准溶液采用单针自动进样分析，在ESI+和ESI-离子化模式下进行全扫描，确定电离方式和准分子离子峰。结果显示，ESI+模式下可产生稳定的[M+H]+母离子，确定母离子并优化去簇电压后，再进行子离子扫描。母离子进入二级质谱，发生断裂或重排等碎裂反应，产生不同的离子碎片，选择响应最高的离子为定量离子，响应次高的离子为辅助定性离子，并优化其碰撞能量。最后，将母离子和子离子组成离子对，在MRM模式下优化毛细管电压、锥孔电压和碰撞能量等参数，使分析物的离子对强度达到最大。优化的质谱条件如“1.4.2”所示。

2.3 基质效应

基质效应(Matrix effects，ME)是指共流出物影响分析物的离子化效率，使其分析信号增强或减弱的现象。实验考察了青霉素G及其代谢物在溶剂、柑桔果肉、全果及果皮基质中的响应情况(加标水平为100 μg/kg)，计算基质效应(ME=基质匹配标准曲线的斜率-溶剂标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率)。由表2可知，除青霉二酸表现出轻微的基质增强效应外，其余两种分析物均表现出基质抑制效应。本研究采用基质匹配标准溶液校正基质效应的方法，确保实验结果的准确性。

2.4 线性范围及检出限

用空白柑桔样品加入标准溶液配制系列标准工作溶液，在优化条件下进行测定。由表2可知，在5～2 000 μg/L范围内，青霉素G及其代谢物的果肉、果皮和全果基质匹配标准溶液的峰面积(y)与对应质量浓度(x)间呈良好的线性关系，相关系数(r2)为0.998 1～0.999 7。以信噪比(S/N)≥3确定分析物的方法检出限(LOD)，以满足农残分析回收率要求的最低加标浓度为方法定量下限(LOQ)，结果显示，3种分析物的LOD为0.5～1 μg/kg，LOQ为5～10 μg/kg。以100 μg/L溶剂标准溶液在优化条件下进行测定，保留时间和峰面积的日内相对标准偏差(RSD)分别为0.11%～0.24%和2.7%～3.8%(n=3)；日间RSD分别为0.12%～0.21%和3.7%～6.9%(n=3)。本方法灵敏度高，线性范围宽，能够满足食品中青霉素G及其代谢物残留的分析要求。

表2 青霉素G及其代谢物的线性范围、相关系数(r2)、基质效应、方法检出限、定量下限和精密度Table 2 Linear ranges，correlation coefficients(r2)，matrix effects，limits of detection(LOD)，limits of quantitation(LOQ)and precisions for penicillin G and its metabolites

2.5 回收率与相对标准偏差

分别取全果、果皮和果肉的空白样品进行3个不同水平的加标回收实验，每个水平做6个平行，按本方法进行测定。由表3可知，3种分析物在柑桔果肉、果皮和全果中的平均回收率为76.7%～107%，RSD为1.3%～9.6%，回收率和精密度良好。

表3 不同基质中3种分析物的加标回收率和相对标准偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations(RSD) of three analytes in different matrix(n=6)

2.6 方法对比

对本方法与文献方法进行了对比。由表4可知，与文献[2]相比，本方法由于在前处理阶段未进行氮吹浓缩导致LOD较高(稀释了5～6倍)，但本方法对2种代谢物的回收率为83.6%～107%，而文献中仅为50%～73%。此外，文献中使用价格昂贵的同位素内标物进行定量，而本方法利用基质匹配标准曲线法定量，检测成本较低。同时，本方法的前处理更简单，适合于大批量样品处理。

表4 食品中青霉素G及其代谢物残留的检测方法对比Table 4 Comparison of detection methods for penicillin G and its metabolites in food

(续表4)

2.7 实际样品的检测

2017年7～10月在重庆北碚区进行青霉素G田间残留消解试验，喷施浓度为9 g/L，在喷药后45 d内分别对温州蜜柑和纽荷尔脐橙进行采样并测定3种分析物的浓度。结果表明，青霉素G在柑桔中的降解符合一级动力学方程，降解速率较快：在温州蜜柑中的降解方程为Ct1=1 147.44e-0.309t(r2=0.866 6)，半衰期T1/2=2.3 d；在纽荷尔脐橙上为Ct2=1 396.17e-0.259t(r2=0.944 9)，T1/2=2.7 d。由图3可知，青霉二酸在柑桔中快速降解，在10 d时含量降至10 μg/kg以下，而去羧青霉噻唑酸在柑桔中降解较为平缓，尤其在脐橙中的残留量呈现先降低后增加，随后波动变化的趋势，含量为200～400 μg/kg。研究表明[19]，青霉素G在柠檬基质中5 d内即降解完全，首先形成青霉二酸和少量的去羧青霉噻唑酸，随后青霉二酸会缓慢转化为青霉酸，最后青霉酸脱去CO2形成去羧青霉噻唑酸。因此，最终青霉素G的代谢物以去羧青霉噻唑酸为主，这与田间试验结果相符。

图3 青霉素G及其代谢物在温州蜜柑(A)与纽荷尔脐橙(B)上的动态变化Fig.3 Dynamic changes of penicillin G and its metabolites in Satsuma Mandarin(A)and Newhall Navel Orange(B)

3 结 论

本研究建立了柑桔中青霉素G及其两种代谢物青霉二酸和去羧青霉噻唑酸残留的DSPE/UPLC-MS/MS检测方法。该方法操作简单、快速准确、灵敏度高、重现性良好，检测成本低，并成功应用于田间残留试验的实际样品中青霉素G及其代谢物含量的检测。