分散固相萃取净化/液相色谱-串联质谱法同时测定蜂王浆中双甲脒、单甲脒及其代谢物

侯建波，谢 文，钱 艳，史颖珠，姚滨滨，汪 鹏，盛 涛

(1.浙江省检验检疫科学技术研究院，浙江 杭州 310016；2.浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心，浙江 杭州 310016；3.浙江立德产品技术有限公司，浙江 杭州 310016)

蜂王浆是蜂巢中培育幼虫的青年工蜂咽头腺的分泌物，也是蜜蜂生长和繁衍过程中的食物。研究发现，蜂王浆极具营养价值和免疫功能，其富含蛋白质、脂质、碳水化合物、维生素和矿物元素，具有辅助控制血管扩张，降低血糖、血脂、血压，护肝，提高免疫力以及抗衰老等功效[1-2]。随着蜂王浆的消费需求不断增长，对其质量的要求也越来越高，其中药物残留是衡量蜂王浆产品质量的重要指标。

双甲脒(Amitraz)，又称N,N-双(2,4-二甲苯亚氨基甲基)甲胺，属于一种常见的有机氮杀虫、杀螨剂，广泛用于蔬菜、茶叶、棉花等作物以防治害螨、蚜虫、棉铃虫等[3]。由于其可以有效防治狄瓦氏螨引起的蜂病且对蜜蜂低毒，因此广泛用于蜂巢除螨[4-5]。单甲脒(Semiamitraz)，又称N′-(2,4-二甲基苯基)-N-甲基亚胺甲酰胺(DMPF)，其既是双甲脒的代谢产物，也是杀螨剂，且对蜜蜂比较安全，可作为农药单独使用[6]。双甲脒和单甲脒可代谢分解形成2,4-二甲基苯基甲酰胺(DMF)和2,4-二甲基苯胺(DMA)。其中DMA是合成单甲脒和双甲脒的化工原料，其具有毒副作用和致突变性，对肝脏的损伤较大[7]。因此各国纷纷制定双甲脒在农产品及蜂产品中的最低限量，欧盟、日本和美国规定蜂产品中双甲脒的最低限量为0.2 mg/kg，并要求同时检测其代谢物[8-11]。

目前，蜂产品中双甲脒的测定通常是在酸、碱环境下高温水解生成最终代谢产物DMA，通过气相色谱法(GC)[12-17]和气相色谱-质谱法(GC-MS)[18-22]进行检测，再转化成双甲脒的含量。随着色谱分离手段的提高和质谱检测器的使用，研究人员采用气相色谱法[23-24]、气相色谱-质谱法[25]、高效液相色谱法(HPLC)[26-29]和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[30-34]对蜂产品中的双甲脒及其代谢物进行直接测定。然而同时测定双甲脒、DMPF及其代谢物DMF和DMA的相关研究较少[35-37]。本研究采用缓冲溶液、乙腈、氯化钠沉淀蜂王浆中的蛋白质和提取目标化合物，以N-丙基乙二胺(PSA)、C18和无水硫酸镁进行分散固相萃取净化(dSPE)，建立了同时检测蜂王浆中双甲脒、DMPF、DMF和DMA残留的液相色谱-串联质谱法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1260-6495型液相色谱-串联质谱仪(美国Agilent公司，配有电喷雾离子源)，台式离心机(美国Thermo公司)；Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司)；IKA MS3 Basic型涡旋器(德国IKA公司)。

双甲脒、DMPF、DMF和DMA标准品(纯度≥99%，Dr.Ehrenstorfer公司)，双甲脒-D6标准品(纯度≥98%，TRC公司)，DMA-D6标准品(纯度≥98%，C/D/N Isotopes公司)。用乙腈将各标准品溶解并定容得10 μg/mL的标准储备液，根据需要用乙腈将其稀释至所需浓度。

氯化钠(纯度≥99.5%)、PSA、C18和石墨化碳黑(GCB)粉末(上海安谱实验科技股份有限公司)；无水硫酸镁(MgSO4)粉末(纯度≥98.0%，西陇科学股份有限公司)；乙腈、甲醇和甲酸(色谱纯，德国Merck公司)；实验用水为Milli-Q高纯水(由Milli-Q超纯水器制备)；pH 4.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10、11的缓冲溶液(爱尔兰Reagecon公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 样品提取称取2 g蜂王浆样品(精确至0.01 g)于50 mL具塞离心管中，加入100 μL 400 ng/mL的同位素内标溶液和pH 9.0的缓冲溶液至10 mL，2 000 r/min涡旋混合1 min，静置5 min，加入10 mL乙腈和2 g 氯化钠，2 000 r/min涡旋混匀1 min，静置5 min，8 500 r/min离心5 min，移取上层乙腈相至另一50 mL具塞离心管，水相再加入10 mL乙腈，2 000 r/min涡旋混匀，静置5 min，8 500 r/min离心5 min，合并乙腈提取液，定容至20 mL，混匀待净化。

1.2.2 样品净化将1.0 mL提取液转移至含有25 mg PSA、10 mg C18和30 mg 无水MgSO4的15 mL具塞离心管中，2 000 r/min涡旋混匀30 s，8 500 r/min离心5 min，转移全部上清液，加水定容至2.0 mL，涡旋混匀，过0.22 μm滤膜后，待测定。

1.2.3 色谱条件色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：A为0.15%甲酸溶液，B为乙腈。梯度洗脱程序：0～8.0 min，40%～65%B；8.0～9.0 min，65%～95%B；9.0～14.0 min，95%B；14.0～15.0 min，95%～40%B；15.0～16.0 min，40%B，16.0～19.0 min，保持40%B进行系统平衡。流速变化程序：0～8.0 min，保持0.4 mL/min；8.0～9.0 min，0.4～0.7 mL/min；9.0～15.0 min，保持0.7 mL/min；15.0～16.0 min，0.7～0.4 mL/min；16.0～19.0 min，保持0.4 mL/min进行系统平衡。进样量为10 μL；柱温为25 ℃。

1.2.4 质谱条件离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描模式：正离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压：2 500 V；离子源温度：130 ℃；干燥气流量：16 L/min；鞘气温度：250 ℃，鞘气流量：11 L/min。其它质谱条件见表1。

表1 双甲脒、DMPF及其代谢物的质谱参数Table 1 MS parameters of amitraz,DMPF and their metabolites

* quantitative ion pair

2 结果与讨论

2.1 提取条件的选择

已有研究表明，酸性环境下双甲脒易发生分解[34,38]。考察了蜂王浆基质中加入不同pH值缓冲溶液(pH 4.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10、11)对目标物提取效果的影响。结果表明，蜂王浆提取溶液在pH 7.0～8.0下的提取效果最佳。其中双甲脒和DMPF易受到pH值的影响，在酸性环境下，双甲脒的回收率明显降低；当pH>8.0时DMPF的回收率开始下降，当pH>10时，其回收率小于60%。由于蜂王浆溶液偏弱酸性，实验最终选择加入pH 9.0的缓冲溶液，此时蜂王浆提取溶液pH为7.0～8.0，可达到最佳提取效果。

图1 不同用量PSA、C18和无水MgSO4对净化结果的影响(n=3)Fig.1 Effect of different dosage of PSA,C18 and MgSO4 on purification result(n=3)

分别采用乙腈和甲醇对蜂王浆基质进行沉淀蛋白、目标物提取和净化试验。结果表明：甲醇沉淀蛋白质的效果略好于乙腈，但乙腈的净化回收率比甲醇高10%左右，且回收率更稳定。结合流动相体系，最终选用乙腈作为蛋白沉淀剂和目标物提取剂，同时加入氯化钠有助于乙腈和水相分层，提高提取效率。

2.2 净化条件的选择

分别考察了PSA、C18、GCB和无水MgSO4对目标化合物的吸附情况，结果显示单独使用15、30、100 mg的GCB时对双甲脒的吸附均达到90%以上，导致双甲脒的回收率小于10%。而单独使用PSA、C18或无水MgSO4时4种目标化合物的回收率均大于75%。因此进一步考察了PSA、C18和无水MgSO4不同用量组合时的净化效果，结果表明随着吸附剂用量的增加，各目标物的回收率均降低，其中DMPF的回收率降低最明显(图1)。实验最终采用25 mg PSA+10 mg C18+30 mg无水MgSO4对蜂王浆提取液进行净化，此时4种目标化合物的回收率最大。

2.3 液相色谱条件的选择

参考文献方法[35]，本实验选择C18色谱柱对目标化合物进行分离，以乙腈-0.15%甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱，并在9.0 min时将流速提升至0.7 mL/min，从而缩短双甲脒的保留时间。考虑到双甲脒的酸不稳定性，并结合前处理净化条件，最终采用乙腈-水(体积比1∶1)定容，对目标化合物的色谱峰形基本无影响。优化的色谱条件如“1.2.3”所示。

2.4 质谱条件的选择

在正离子模式下，采用直接进样方式对1.0 μg/mL待测化合物的单标准溶液进行母离子全扫描，确定分子离子峰，再以分子离子为母离子，对其子离子进行全扫描。按照欧盟EC/657指令，串联质谱法定量确证须满足4个识别点的要求(母离子1点，特征子离子1.5点/个)，本实验选择2个特征子离子进行测定，其中以信噪比高、峰形好、干扰小的离子对作为定量离子对，另一个离子对作为定性离子对。以MRM正离子模式优化各质谱参数，发现双甲脒和单甲脒易发生源内裂解，将离子源毛细管电压设为2 500 V，离子源温度和鞘气温度分别设为130 ℃和250 ℃，可以有效保证离子化效率并降低源内裂解。最佳质谱条件见表1。

图2 空白蜂王浆基质溶液加标(5 μg/kg)的提取离子流图Fig.2 The extracted ion chromatograms of spiked solution on royal jelly matrix(5 μg/kg)

2.5 基质效应

采用本方法分别测定混合溶剂标准溶液和空白基质加标溶液，通过计算离子抑制率来考察基质效应情况[39-40]。其中，离子抑制率(%)=(混合溶剂标准溶液中响应强度-空白基质加标溶液中响应强度)×100%/混合溶剂标准溶液中响应强度。结果显示，双甲脒和DMA的离子抑制率相对较大，分别为32.0%和24.4%，存在基质抑制效应。本实验最终采用空白基质加标溶液配制线性工作曲线，同时结合同位素内标法定量以降低基质效应。

2.6 方法线性关系与定量下限

采用本方法测定质量浓度为0、5、10、20、50、100 μg/kg的混合标准溶液，以目标物与同位素内标物的峰面积比值(Y)为纵坐标，以待测物的质量浓度(X，μg/kg)为横坐标绘制标准曲线。由表2可知，各化合物在0～100 μg/kg范围内呈良好线性关系，相关系数(r)大于0.996。以10倍信噪比(S/N=10)计算方法定量下限，双甲脒、DMPF、DMF和DMA的定量下限分别为0.10、0.25、5.0、2.5 μg/kg。空白蜂王浆样品加标5 μg/kg的提取离子流图见图2。

2.7 方法回收率与相对标准偏差

在空白蜂王浆中进行5、10、20 μg/kg 3个浓度水平的加标回收实验，每个浓度做6个平行样品。结果显示，4种目标物的回收率为77.0%～107%,相对标准偏差(RSD)为2.0%～11%。

表2 双甲脒、DMPF及其代谢物的线性关系、回收率及相对标准偏差(n=6)Table 2 Linear relationships，recoveries and relative standard deviations of amitraz,DMPF and their metabolites(n=6)

2.8 实际样品分析

应用本方法对市场采购的15批次不同品牌蜂王浆样品进行测定，其中1个样品检出双甲脒，含量为37.2 μg/kg，该结果与GB 23200.103-2016[17]的检测结果一致。

3 结 论

本文建立了分散固相萃取净化/液相色谱-串联质谱(dSPE/LC-MS/MS)测定蜂王浆中双甲脒、单甲脒及其代谢物残留量的方法。采用pH 9.0的缓冲溶液稀释蜂王浆样品，通过乙腈和氯化钠进行蛋白沉淀、盐析提取，N-丙基乙二胺、C18和无水硫酸镁进行分散固相萃取净化，LC-MS/MS法进行分离测定，同位素内标法进行定量分析。该方法前处理过程环境友好，简便快捷，检测成本低，定量下限满足目前国内外相关化合物最大残留限量的要求，可以实现对蜂王浆中双甲脒、DMPF及其代谢物残留情况的有效监控。