基于油菜籽碳量子点荧光恢复测定盐酸米诺环素的研究

武文波，张越诚，马红燕，田 锐，刘晓莉

(延安大学 化学与化工学院，延安市分析技术与检测重点实验室，陕西 延安 716000)

碳量子点(CQDs)作为新型、绿色的纳米级荧光材料，具有发光特性稳定、水溶性良好以及成本低廉、合成简便等优点[1]，近年来引起了人们的广泛关注[2-3]。目前，合成CQDs所用碳源材料的选取及其发光性能表征与分析应用方面的研究日趋活跃[4-5]。CQDs在分析化学领域的应用大多集中在金属离子测定方面[6-7]，而以CQDs为荧光探针开展药物分析的工作较少。

盐酸米诺环素(Minocycline hydrochloride，MINO)属于广谱类抗生素，广泛用于临床，抗菌作用显著。目前，定量检测MINO的方法较少，有化学发光分析法[8]、高效液相色谱法[9]、浊度法[10]和分光光度法[11]等，这些方法存在线性范围窄、检出限高，甚至需要特殊合成的显色剂等不足，因而，开展MINO的简单、快速、灵敏的检测方法的研究显得尤为必要。

本文以天然油菜籽为碳源，只加入水，无需其他试剂，利用水热法一步合成了绿色荧光CQDs。实验发现，KMnO4可以有效地猝灭该CQDs的荧光；而当有MINO存在时，由于MINO与KMnO4的氧化还原作用，使KMnO4从CQDs的表面移除下来，CQDs的荧光恢复，且在一定浓度范围内，CQDs的荧光恢复值与MINO的浓度呈良好的线性关系。基于此，首次构建了检测MINO的“关-开”型荧光探针，该方法操作简单、响应快速灵敏。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

FLSP920型瞬态稳态荧光光谱仪(英国爱丁堡仪器有限公司)；Agilent-8453型紫外-可见分光光度计(美国安捷伦仪器有限公司)；F-4500型荧光分光光度计(日本日立仪器有限公司)；IR Prestige-21型傅立叶变换红外光谱仪(日本岛津仪器有限公司)。

BR缓冲溶液(pH 2.78)、KMnO4(5.0×10-4mol/L)。实验用水为超纯水，所用试剂均为分析纯。油菜籽(市售)。

1.2 实验方法

1.2.1 CQDs的合成取30.00 mL超纯水加入到25.00 g粉碎的油菜籽中，将其密封于50 mL有聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，180 ℃加热20 h，待高压反应釜冷却至室温后，得到深褐色的液体，即CQDs的粗产品。粗产品经滤纸过滤后用0.22 μm的微孔滤膜再次过滤，最后移至100 mL容量瓶中定容，稀释100倍即得CQDs工作液，备用。

1.2.2 MINO的检测向一系列10 mL比色管中依次加入2.00 mL CQDs溶液、2.00 mL pH 2.78的BR缓冲溶液、1.00 mL 5.0×10-4mol/L的KMnO4溶液以及不同浓度的MINO溶液，用超纯水定容，摇匀，于室温下反应30 min后，测定λex/λem=331 nm/409 nm下的荧光强度IF和试剂空白的荧光强度IF0，计算体系荧光强度变化ΔIF(IF-IF0)与MINO浓度之间的关系，狭缝宽度均为5 nm。

2 结果与讨论

2.1 油菜籽CQDs的表征

2.1.1 CQDs的形貌表征实验对油菜籽CQDs进行了透射电镜表征，如图1所示，得到的CQDs呈单球状或类球状，平均粒径大小为9 nm左右。

图1 CQDs的透射电镜图(A)和粒径分布图(B)Fig.1 TEM image(A)and size distribution(B)of CQDs

图2 CQDs在不同激发波长下的发射光谱(A)、傅立叶变换红外光谱(B)和XRD图谱(C)Fig.2 Emission spectra of CQDs at different excitation wavelengths(A)，FTIR(B)and XRD spectrum(C) of CQDs

图3 不同体系的荧光光谱(λex=331 nm)Fig.3 Fluorescence spectra of different systems(λex=331 nm)

2.1.2 CQDs的光谱特性扫描油菜籽CQDs在不同激发波长下的荧光光谱，由图2A可知，该CQDs的激发波长λex影响发射峰的强度和位置，当激发波长从301 nm增加到361 nm时，发射波长从405 nm逐渐红移至427 nm；荧光信号强度先增大后减小，当激发波长为331 nm时发光强度达最大，此时的发射波长为409 nm。

CQDs的晶格形态可用XRD图谱来表征，由图2C可以看出，CQDs在2θ为22.52°处有一个衍射宽峰，该峰为无定形态碳的特征峰[12]，因此该CQDs的晶型为无定型碳。

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2.1.3 CQDs荧光量子产率在λex=313 nm激发波长下，硫酸介质中硫酸奎宁的荧光产率为55%，以硫酸奎宁为标准溶液，采用参比法[13]计算得CQDs的荧光量子产率为4.9%。

2.1.4 KMnO4对CQDs的猝灭作用与MINO对CQDs-KMnO4体系荧光的恢复室温下，扫描体系在激发波长331 nm下的荧光光谱，结果见图3。由图可知，在该激发波长下，MINO无荧光，MINO与KMnO4反应的产物也无荧光。KMnO4的加入对CQDs荧光有强烈的猝灭作用(曲线2)，将MINO加入CQDs-KMnO4体系后，CQDs荧光得到恢复(曲线3)。实验发现，随MINO加入量的增大，CQDs- KMnO4体系的荧光信号恢复值逐渐增强，因此，CQDs- KMnO4体系有望用于MINO的测定。

2.2 MINO测定条件的优化

2.2.1 酸度、缓冲溶液种类及用量考察了不同pH值对测定体系荧光强度的影响，结果表明，pH 2.78时，CQDs的荧光恢复效率最大，且荧光强度稳定。考察了甘氨酸-盐酸、BR、邻苯二甲酸-盐酸、磷酸氢二钠-柠檬酸等不同种类缓冲溶液(pH 2.78)及其用量(0.5～3.0 mL)对体系荧光强度的影响，结果表明：使用2.00 mL pH 2.78的BR缓冲溶液时体系荧光恢复值ΔIF最大。

2.2.2 KMnO4用量的选择KMnO4的用量影响MINO检测的背景值和线性范围。实验发现，KMnO4用量小，CQDs猝灭效率低，检测的线性范围窄；但是若KMnO4用量过大，加入的MINO会首先与游离的KMnO4反应，影响荧光效率的恢复。综合考虑，选择加入KMnO4溶液1.00 mL。

2.2.3 CQDs的用量考察了CQDs用量的影响，实验表明：当CQDs的加入量为2.00 mL时，CQDs的荧光恢复效率ΔIF最大。

2.3 体系的稳定性

KMnO4对油菜籽CQDs荧光的猝灭是一个快速过程，猝灭效率在5 min内即达到最大，猝灭程度在24 h内基本保持不变。加入MINO后，MINO对CQDs-KMnO4体系的荧光恢复值ΔIF在反应0.5 h后趋于最大，且其荧光强度在4.0 h内基本不变。

2.4 干扰物质的影响

在选定的实验条件下，当MINO溶液浓度为5.0×10-6mol/L，相对误差在±5%范围内时，考察了MINO制剂相关辅料和常见物质[14]的干扰情况。结果表明，1 000倍的淀粉、蔗糖、果糖、葡萄糖、Mg2+，100倍的Ag+、Co2+、Ca2+、Zn2+、Ni2+、聚乙烯醇，50倍的Mn2+、羧甲基纤维素钠，20倍的Cu2+，5倍的Fe3+、Cr6+不干扰测定。

2.5 检出限及线性范围

在优化的实验条件下，MINO的浓度(c)在5.0×10-7～1.0×10-5mol/L范围内与荧光强度恢复值ΔIF呈良好线性关系，线性方程为ΔIF=2.91×107c(mol/L)-7.98，相关系数r为0.999 5。平行测定5.0×10-6mol/L的MINO溶液5次，其RSD为1.5%。根据IUPAC规定，以DL=3σ/k计算得到该方法的检出限为4.9×10-7mol/L。

2.6 样品测定

随机抽取同一批号的MINO胶囊10粒，称取适量(相当于0.049 4 g MINO)，加水搅拌，超声溶解10 min后转移至100 mL容量瓶中，定容，摇匀，静置10 min，过滤。准确移取适量上清液，按照实验方法进行测定，结果见表1。

表1 样品测定结果及回收率(n=5)Table 1 Determination results of MINO in samples and recovery of the method(n=5)

1.Kunming Pharmaceutical Group Co.,Ltd,product batch number:H10940017;2.Jiangsu Wyeth Pharmaceutical Co.,Ltd,product batch number:H10960011

2.7 机理初探

图4B为KMnO4-MINO体系的紫外-可见光谱图，在KMnO4体系中加入MINO，吸收光谱发生了变化，表明MINO可与KMnO4发生氧化还原反应。

图4 CQDs-KMnO4(A)和KMnO4-MINO(B)体系的紫外-可见吸收光谱Fig.4 UV-Vis absorption spectra of CQDs-KMnO4(A)and KMnO4-MINO(B)systems

其次，对CQDs和CQDs-KMnO4体系的荧光寿命进行了拟合。通过瞬态稳态荧光光谱仪分别进行测定，结果见表2。CQDs的加权平均寿命[16]为7.29 ns，CQDs-KMnO4的为6.61 ns，荧光寿命减小，也表明KMnO4与CQDs之间是动态猝灭，即KMnO4与激发态的CQDs进行了相互作用。

ωrepresents the relative weight;τrepresents the component lifetime;χ2represents the chi-square test

基于以上实验现象和结果，推测体系“关-开”机理如下：光激发CQDs，使CQDs在导带和价带之间产生电子空穴对。当KMnO4加入到CQDs溶液中时，KMnO4通过电子转移的方式[17]与CQDs表面的基团作用并结合于CQDs表面。因KMnO4具有强氧化性，易得电子，使得KMnO4最低空轨道LUMO的能量低于CQDs的导带能量，从而导致CQDs导带中的激发态电子不能有效回到价带，而是以非辐射的形式转移到KMnO4最低空轨道LUMO上，使得荧光信号“关”。当MINO加入到CQDs-KMnO4体系中时，由于MINO与KMnO4具有更强的作用力，强还原性的MINO与结合于CQDs表面的KMnO4发生反应，将KMnO4从CQDs表面移除，使CQDs的荧光得到恢复，荧光信号“开”，其可能机理如图5所示。

图5 CQDs的荧光“关-开”机理图Fig.5 Mechanism of CQDs quenching and fluorescence recover

3 结 论

采用一步水热法合成了强荧光油菜籽CQDs。基于KMnO4可使油菜籽CQDs荧光猝灭和MINO可使猝灭后CQDs荧光重新恢复的现象，建立了“关-开”型CQDs荧光探针检测MINO的新方法，该方法灵敏、快速，准确，拓展了CQDs在分析化学领域的应用范围，为药物荧光检测提供了新思路。