纸芯片显色法用于L-半胱氨酸的快速测定

张 剑，谢婷婷，杨玉莹，刘春叶*，Frank A.GOMEZ，Wilson LEE，肖 倩

(1.西安医学院 药学院,陕西 西安 710021；2.加州州立大学 化学与生物化学系, 美国 洛杉矶 90001)

纸芯片是近年来备受关注的一种具有广阔应用前景的新型微流控分析器件，是基于纸质材料(如滤纸、色谱纸、硝化纤维膜等)制成的微流控芯片[1-2]，其不仅保留了传统微流控芯片的微型化、自动化和集成化的优点，还结合了纸质材料本身所具有的成本低廉、制作简便、可循环再生和生物相容性好等特性。目前，纸芯片已被广泛应用于医药卫生[3-5]、食品安全[6-8]、环境监测[9-11]等领域的实时现场检测，对贫困国家和偏远地区的个性化医疗和诊断的普及具有一定推动作用。

含巯基类化合物如半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hys)、谷胱甘肽(GSH)、胆碱等在生物体内扮演着重要的角色，如人体液中Cys的含量大幅波动会导致帕金森、老年痴呆、嗜睡、水肿等疾病。因此，实时准确、快速、高选择性地检测血样中巯基化合物的含量，对于生物化学研究及临床诊断具有十分重要的意义[12-13]。目前，含巯基化合物的常用仪器检测方法有高效液相色谱法(HPLC)[14]、紫外分光光度(UV)法[15-18]、荧光分光光度法[19]、电化学法[20]、原子吸收光谱法[21]、氨基酸分析仪[22]等，其中HPLC需对样品进行柱前或柱后衍生，且衍生步骤较为繁琐；电化学法虽不需衍生，但因Cys具有不可逆氧化性质，在检测过程中易导致电极老化，且重现性差。基于纸芯片的检测方法有比色法[19,23]、荧光法[24]、化学发光法[25]、表面增强拉曼法[26]、电化学检测[27]等，比色法因无需辅助检测设备，是目前纸芯片分析中最为直观方便、简单快速的检测方法。本研究以5,5'-二硫硝基苯甲酸(DTNB)作为显色剂，优化显色反应条件，建立了一种基于纸芯片的显色法用于L-Cys的快速测定，并将其用于实际血清样品的检测，以探究含巯基类化合物的现场快速测定方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ALC-210.4电子天平、PB-10 pH计(北京赛多利斯科技仪器有限公司)；UV-2102 PCS型紫外可见分光光度计(上海尤尼克仪器有限公司)；TDL-40B离心机(上海安亭科学仪器厂)；魅族MX4手机(800万像素，魅族科技有限公司)；1号定性滤纸(英国Whatman公司)。

L-半胱氨酸(L-Cys)、DTNB(纯度≥99.0%，北京索莱宝科技有限公司)；L-色氨酸(纯度≥99.0%，天津市科密欧化学试剂有限公司)；L-组氨酸(纯度≥99.0%，上海蓝季科技发展有限公司)；L-丙氨酸(98.5%，天津市博迪化工有限公司)；D-苯丙氨酸、DL-谷氨酸(98.0%，上海晶纯生化科技股份有限公司)；牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O(纯度≥99.0%，成都市科龙化工试剂厂)；碳酸氢钠(纯度≥99.0%，天津市永大化学试剂有限公司)；淀粉(分析纯，天津市风船化学试剂有限公司)；葡萄糖、氯化钾、氯化钠、氯化铵(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；硫酸钠、硫酸锌、无水氯化钙(天津市河东区红岩试剂厂)；实验用水为娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

1.2 实验方法

图1 检测L-半胱氨酸的纸芯片结构Fig.1 Paper chip structure for detecting L-Cys

图2 L-半胱氨酸的检测原理Fig.2 Detection principle of L-Cys

1.2.1 纸芯片的制作采用Inkscape 0.91软件设计纸芯片结构图案(见图1)，其中A为Cys样品加载区，B为流体通道，C为显色区域，D为显色剂DTNB加载区，灰色边缘是疏水围堰，周围为亲水区域。A、C、D区域直径分别为4、4、6 mm，B通道长7 mm，宽2 mm。设计显色区域C可较好地解决干燥过程中的颜色贴壁现象。将设计好的结构图案用Xerox Phaser 8400喷蜡打印机打印在Whatman 1号定性滤纸上，然后于176.7 ℃下热压2 min，使滤纸表面粘附的蜡加热融化后渗入滤纸内部，形成亲水与疏水相间的通道网络，取出后于室温下冷却。

1.2.2 纸芯片检测原理用磷酸盐缓冲溶液配制DTNB，在中性或偏碱性条件下，DTNB与Cys的巯基发生交换反应，生成黄色的2-硝基-5-硫代苯甲酸阴离子(TNBA)(图2)，其颜色强度和L-Cys的含量成正比。将6.0 μL待测L-Cys样品滴加于A区域，再加入6.0 μL DTNB标准溶液至D区，2种溶液在毛细作用下相向移动至显色区C，相遇发生反应并显色，然后用手机拍照，记录实验数据。拍照时将纸芯片置于台灯下方，由于使用手机软件CS扫描全能王进行扫描，每次仅需拖动边框确定扫描区域，即可获得和扫描仪类似效果，故拍照距离对测定结果无影响。然后利用Photoshop CC软件对数据进行处理，在显色区C区选择5个相同大小的区域，分别读取RGB通道(即红、绿、蓝三叠加通道)的显示图像亮度的平均值，进行比色检测。

1.2.3 紫外分光光度法(UV)取0.5 mLL-Cys溶液加入0.5 mL 4.0 mg/mL DTNB标准溶液中，摇匀，室温反应10 min，于波长412 nm处测定其紫外吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 显色条件的优化

2.1.1 上样量的影响同等条件下，为增加显色强度，理论上应加载较多的反应试剂，但由于芯片尺寸限制，加载量不能过大。故本研究考察了上样量(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 μL)对显色效果的影响(图3)。由图3可见，当上样量为6.0 μL时，纸芯片测定区填充效果和显色强度均达到最佳状态，因此本实验选择6.0 μL为最佳上样量。

图3 上样量对显色强度的影响Fig.3 Effects of loading amount on color intensity

2.1.2 缓冲液pH值的影响DTNB在偏酸性溶液中较为稳定，反应产物在偏碱性条件下易离子化显色，因此需考察缓冲液pH值对测定结果的影响。固定其他实验条件，用20 mmol/L磷酸盐缓冲液配制DTNB显色液及L-Cys标准溶液，考察了不同pH值(6.0、7.0、7.4、8.0、9.0)对显色强度的影响。结果表明，当pH值为7.4时体系显色强度最大，故选择pH 7.4的PBS缓冲液来进行溶液的配制。

2.1.3 显色时间的影响由于化学反应进度与时间相关，且在反应过程中纸芯片上溶液的不断蒸发也会对显色强度产生一定影响，故需考察显色时间对分析结果的影响。固定其他实验条件，每隔1 min拍照，考察显色时间(1～10 min)对结果的影响(图4)。由图可见，检测区的显色强度在3～6 min时间内比较稳定，并在4 min时最大，之后随着显色时间延长逐渐减小。因此，最终确定较优显色时间为4 min。

图4 显色时间对显色强度的影响Fig.4 Effects of coloration time on color intensity

图5 半胱氨酸检测的选择性Fig.5 Selectivity of L-Cys detection

2.2 选择性考察

本实验采用L-色氨酸(L-Trp)、L-组氨酸(L-His)、L-丙氨酸(L-Ala)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、DL-谷氨酸(DL-Glu) 5种氨基酸对该方法的选择性进行考察(图5)，结果显示，在相同条件下，L-Cys的显色强度远高于其他氨基酸，表明该检测体系具有良好的选择性。

2.3 干扰实验

2.4 L-Cys标准曲线与检出限

在最优条件下，制备L-Cys工作曲线并计算检出限。结果表明，在0.01～0.1 mmol/L范围内，显色强度(y)与L-Cys浓度(x)之间呈良好的线性关系，线性方程为y=297.944 2x+106.607，r=0.999 8，计算得检出限(高于空白对照RGB值10)为0.001 mmol/L。

2.5 加标回收率及重复性考察

为了考察方法可靠性，取供试品溶液进行加标回收率实验(表1)，得方法的加标回收率为98.1%～102%。取0.14 mmol/LL-Cys标准溶液进行重复性实验。结果显示，日内相对标准偏差(RSD,n=5)为0.6%，日间RSD(n=5)为1.2%，表明本方法重复性好。

表1 加样回收实验Table 1 Plus sample recovery test

2.6 与UV结果的比较

取空白牛血清0.1 mL置于离心管中，加入0.2 mL乙腈，振摇，于10 000 r/min 转速下离心10 min，取上层清液，N2吹干，再用纯净水稀释至1 mL即得血清样品溶液。将该血清样品溶液分别采用UV方法(实验条件见“1.2.3”，借鉴了Ellman方法)和本研究建立的纸芯片法测定其中的L-Cys。结果显示，UV法未检出，而纸芯片法检出浓度为0.013 mmol/L。再向血清样品中加入不同量的L-Cys标准品，测得其加标回收率为99.1%～103%(表2)。结果显示，纸芯片方法与传统UV法偏差较小(-0.4%～-0.9%)，结果可靠，表明本研究建立的纸芯片法可应用于实际血清样品的检测。

表2 血清样本中L-Cys的测定Table 2 Detection of L-Cys in serum samples

3 结 论

本研究以Whatman 1号定性滤纸作为纸芯片制作材料，选用DTNB作为显色剂，成功构建了一种基于纸芯片快速检测L-Cys的新方法。通过手机拍照采用Photoshop软件分析显色强度，从而进行比色检测。该方法具有较好的选择性、重复性和抗干扰能力，采用手机记录结果，便于数据传输，可及时将结果传递给分析人员，有望用于实际生物样品中含巯基化合物的实时诊断。