磁性纳米分子印迹聚合物的制备及其对生物体内PQQ-DA痕量产物的研究

毛师师，周杏琴，钦晓峰，徐希杰，谢敏浩

(江苏省原子医学研究所，卫生部核医学重点实验室，江苏省分子核医学重点实验室，江苏 无锡 214063)

多巴胺(DA)是脑内重要的神经递质，在神经系统发挥重要的生理作用[1-2]。吡咯并喹呤醌(PQQ)是一种氧化还原酶辅基，主要分布于原核生物以及部分植物和哺乳动物中[3-4]。PQQ具有特殊的化学结构，能够与多种活性基团发生反应[5]，与DA反应生成PQQ-DA(反应式见图1)，研究脑内PQQ-DA含量对PQQ与多巴胺神经递质的作用机制具有重要意义。

脑内PQQ-DA含量属于痕量级，一般分析方法难以检测，而常规固相萃取吸附剂特异选择性不足，易将其他干扰物与目标物共同萃取下来[6]。目前尚未见PQQ-DA含量分析的相关报道。本文以磁性Fe3O4为内核，四甲氧基硅烷和3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷对磁性纳米粒子表面进行包裹和修饰，将可聚合双键引入Fe3O4@SiO2粒子表面，以乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，偶氮二异丁腈为引发剂聚合反应，形成可以进一步被多种有机官能团修饰的分子印迹聚合层[7-12]。以PQQ-DA为模板分子，采用分子印迹技术合成对其具有高选择性的分子印迹聚合物，洗去模板分子后，在硅胶表面的聚合物薄层中留下了大量可匹配的空穴。由于PQQ-DA上的酰氨基与微粒表面的功能大分子之间存在静电相互作用与吸附作用，因而可以优先吸附与洗脱，制备了对PQQ-DA具有高识别性、高选择性的磁性分子纳米印迹材料，采用扫描电镜和红外光谱对其进行了表征[14-17]，并联合超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS)测定脑内痕量PQQ-DA，对神经系统疾病的发生和机理研究具有重要指导意义。

图1 PQQ-DA的反应结构式Fig.1 Reaction structure formula of PQQ-DA

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Acquity UPLC(美国Waters公司)，配有SQ Detector 2质谱检测器及PDA检测器；EVO18扫描电镜(德国卡尔蔡司公司)；TENSOR 27红外光谱仪(德国 Bruker公司)；HH-2L型恒温水浴锅(郑州杜普仪器厂)；S220K型酸度计(瑞士Mettler Toledo公司)；BSA 224S-CW型电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)；T10匀浆机(德国IKA公司)；81-2型恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)；STS-8A脱色摇床(上海琪特分析仪器有限公司)；HS-3120超声波清洗器(天津市恒奥科技发展有限公司)；5417R冷冻高速离心机(德国Eppendor公司)。

PQQ由江苏省原子医学研究所合成室提供;甲醇(色谱纯，百灵威科技有限公司)；七水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)、甲基丙烯酸乙二醇酯、偶氮二异丁腈、乙二醇二甲基丙烯酸酯、K2HPO4、乙二胺四乙酸二钠、氨水、乙醇、甲酸、醋酸、高氯酸(PCA)、NaOH(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；3-(异丁烯酰氧)苯基三甲氧基硅烷、四甲氧基硅烷(Sigma公司)，氮气(无锡市辉荣贸易有限公司)，实验用水为去离子水。

1.2 实验动物及分组

20～30 g小鼠(由常州卡文斯公司提供)按照对照组、PQQ缺损模型组和PQQ组随机分为3组，每组6只。按照每天下午14∶00腹腔给药，注射量为10 mL/kg(1.0 mg/mL)，连续给药6周。实验小鼠喂养于室温为(20±2)℃的动物室中，自然光照射，换气扇通风，自由进食饮水，提前一周适应环境。

1.3 色谱-质谱条件

色谱柱为BEH C18柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；脱溶剂气温度：400 ℃；脱溶剂气流量：600 L/h；离子源温度：110 ℃；锥孔气流量：50 L/h；毛细管电压：3 000 V；锥孔电压：30 V；质谱采用电喷雾正离子模式ESI+，质量扫描范围为m/z0～1 000。流动相：A为水，B为甲醇；梯度洗脱程序：0～10 min,5%～70% B。

1.4 实验方法

1.4.1 Fe3O4磁性纳米粒子的制备配制100 mL 1.25 mmol/L FeSO4·7H2O溶液，在氮气保护下以800 r/min的速度机械搅拌，用6 mol/L NaOH溶液调至pH 10.0，1 h后磁性沉淀物分离，用磁铁吸附黑色Fe3O4纳米粒子，倒去上层液体，用二次蒸馏水及乙醇分别洗涤3次，再分散悬浮于乙醇溶液中,得到5.0 mg/mL的纳米Fe3O4悬浮液。

1.4.2 磁性Fe3O4包裹SiO2的制备取上述“1.4.1”制备的纳米Fe3O4悬浮液50 mL，加入5 mL氨水，5 mL二次蒸馏水，10 mL含1 mmol/L的四甲氧基硅烷，于60 ℃下以800 r/min搅拌10 h；然后加入200 μL 3-(异丁烯酰氧)苯基三甲氧基硅烷分散于50 mL 10%的醋酸水溶液中，继续搅拌5 h，用二次蒸馏水洗涤，得到磁性Fe3O4/SiO2纳米粒子。

1.4.3 PQQ-DA印迹磁性纳米粒子聚合物的制备精密称取0.46 g PQQ-DA加入30 mL含0.2 mol/L甲基丙烯酸乙二醇酯溶液，超声混合30 min，氮气保护下滴加5.0 g乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.02 g偶氮二异丁腈，再加入0.25 g 磁性Fe3O4/SiO2纳米粒子，超声30 min；将此混合液于60 ℃下反应24 h，得PQQ-DA印迹磁性纳米粒子。非印迹磁性纳米粒子的制备除了不加模板分子PQQ-DA外，其他步骤和印迹磁性纳米粒子相同。将以上制备的纳米粒子用乙醇-甲酸(体积比5∶1)混合液洗涤3次，再用二次蒸馏水洗涤3次，用外部磁场分离出磁性纳米粒子，真空干燥，分别得到磁性印迹聚合物及磁性非印迹聚合物。

1.4.4 脑组织处理小鼠各组冰上取脑，分别称重，加组织裂解液(脑组织重量/裂解液=1 g/1.5 mL)匀浆(组织裂解液含0.6 mol/L PCA和0.5 mmol/L EDTA-Na2)[13]，4 ℃下以14 000 r/min离心15 min，上清液取出再离心15 min，取出上清液，加入等体积蛋白PCA沉淀剂(含1.2 mol/L K2HPO4和2.0 mmol/L EDTA-Na2)，4 ℃冰浴放置10 min后，4 ℃下以14 000 r/min离心15 min，得含目标物的脑组织处理液，备用。

1.4.5 磁性纳米分子印迹处理取20 mg印迹磁性纳米粒子分散于250 mL脑组织处理液中。15 ℃振荡吸附1 h后，将磁铁置于烧杯底部吸住印迹磁性纳米粒子，弃去上清液；印迹磁性纳米粒子用去离子水洗涤后，重新分散在5 mL乙醇-甲酸(体积比6∶1)混合溶液中并超声10 min，将粒子用磁铁吸至烧杯底部，取上清液，氮气吹干，待用。

2 结果与讨论

2.1 扫描电镜实验

采用扫描电镜观察分子印迹聚合物的表面(图2)。扫描电子显微镜显示(图2A)，其颗粒大小分布均匀，大致呈圆形，粒径约10 nm，基本满足超顺磁性颗粒的要求；接枝PQQ-DA印迹层后的扫描电子显微镜图(图2B)显示，其粒径约130 nm，颗粒表面呈现粗糙多孔的特性，适合目标分子的释放与结合，孔隙粒径小于50 nm，适用于模板分子转移，可在很短的时间内达到萃取平衡。

图2 磁性纳米粒子的扫描电子显微镜图Fig.2 Scanning electron microscopes of magnetic nanoparticlesA.Fe3O4/SiO2;B.PQQ-DA-Fe3O4/SiO2

图3 红外光谱图Fig.3 Infrared spectroscopya.non imprinted magnetic nanoparticles(非印迹磁性纳米粒子);b.prior to elution of imprinted magnetic nanoparticles(印迹磁性纳米粒子洗脱前);c.after elution of imprinted magnetic nanoparticles(印迹磁性纳米粒子洗脱后)

2.2 红外光谱表征

采用红外光谱对分子印迹聚合物的化学结构进行表征(图3)。与非印迹磁性纳米粒子(曲线a)相比，印迹磁性纳米粒子洗脱前(曲线b)PQQ-DA结构中各特征峰明显增强，其中3 444 cm-1处为-OH伸缩振动峰，1 690 cm-1和1 650 cm-1处为酰胺特征峰，无机杂化涂层使2 935、2 855 cm-1处的酰胺基特征峰出现轻微位移。而当印迹磁性纳米粒子洗脱后(曲线c)，其与非印迹磁性纳米粒子(曲线a)的峰形和强度基本一致，表明PQQ-DA能够从印迹磁性纳米粒子吸附中较好地洗脱出来，留下可以进行分子识别的空穴。

图4 PQQ在磁性印迹聚合物和磁性非印迹聚合物上的吸附等温线Fig.4 Isothermal adsorption of PQQ on magnetic imprinted polymers and magnetic non imprinted polymers

2.3 吸附实验

精密移取5 mL质量浓度分别为0.02、0.2、0.8、1.0、2.0、4.0 mg/mL的PQQ-DA溶液于锥形瓶中，再分别称取15 mg磁性印迹聚合物和磁性非印迹聚合物，分散于不同浓度的PQQ-DA溶液中，于15 ℃水浴恒温振荡10 h后用磁铁将粒子吸在底部，采用UPLC-MS测定上清液中PQQ-DA含量；以印迹磁性纳米粒子的吸附容量对PQQ-DA浓度作图，绘制等温吸附线(图4)。吸附容量(Q)为每单位质量(g)纳米粒子吸附目标分子的质量，由其在振荡吸附前后PQQ-DA的浓度差值计算得到：Q=(c0-ci)V/m。式中，c0为PQQ-DA初始质量浓度(mg/mL)，ci为振荡后上清液中PQQ-DA质量浓度(mg/mL)，V为溶液体积(mL)，m为粒子质量(mg)。由吸附等温线可见，低浓度时印迹粒子的吸附容量随PQQ-DA浓度的增大而增加，在2.0 mg/mL时基本达到饱和，计算得饱和吸附容量为113.8 mg/g，是相同条件下非印迹粒子的饱和吸附容量(50.2 mg/g)的2.3倍。

2.4 印迹磁性纳米粒子用量的影响

吸附剂用量对目标物的回收率具有重要影响，若粒子用量不够，则不能完全吸附目标物；若粒子用量过多，虽可确保目标物被充分吸附，但会影响洗脱从而降低提取效率。实验研究了不同磁性纳米分子印迹粒子用量(2.5、5、10、15、20、25 mg)对PQQ-DA回收率的影响。结果发现回收率随磁性纳米分子印迹粒子用量增加而增大，在10 mg时达到最大(93.5%)，此后，继续增加印迹磁性纳米粒子用量，回收率反而下降。因此，选择10 mg为印迹磁性纳米例子的最佳用量。

2.5 脱附时间的影响

脱附时间对回收率也有很大影响，为了获得最佳脱附时间，实验将吸附饱和的印迹磁性纳米粒子分散于2 mL乙醇-甲酸(体积比8∶2)溶液中，于摇床中振荡洗脱，考察不同振荡洗脱时间(5、10、15、20、30、40 min)的回收率。结果显示，回收率随着洗脱时间的延长而逐渐增大，在洗脱时间为20 min时达到最大(93.6%)，此后，洗脱达到平衡。因此，在实际样品分析时选择20 min为最佳洗脱时间。

图5 PQQ-DA的质谱图Fig.5 Mass spectrogram of PQQ-DA

2.6 方法学验证

2.6.1 线性范围与检出限精密称取一定量PQQ-DA，用二次蒸馏水配制成质量浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的标准溶液，分别取10 mg印迹磁性纳米粒子分散于250 mL上述标准溶液中，于15 ℃振荡吸附1 h后，以磁铁置于烧杯底部将印迹磁性纳米粒子吸住，弃除上清液；印迹磁性纳米粒子用去离子水洗涤后，重新分散在5 mL乙醇-甲酸(体积比6∶1)混合溶液中，再超声20 min，粒子用磁铁吸至烧杯底部，取上清液稀释，进UPLC-MS在优化条件下分析。以PQQ-DA质量浓度(x,mg/mL)为横坐标，对应峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线，得线性方程为y=1 205 519 606x+259 487(r2=0.996 6)，以3倍信噪比(S/N≥3)计算得其检出限(LOD)为0.2×10-11mg/mL。

2.6.2 精密度及回收率在优化条件下，对脑组织样品分别进行0.2、0.6、1.0 mg/mL水平的加标回收实验，每个加标水平平行测定6次，计算得加标回收率为88.7%～95.5%，相对标准偏差(RSD)为2.6%～3.2%。

2.7 实际样品测定

按照“1.4.4”方法处理小鼠脑组织，在优化条件下进样测定，经MS图谱确认466.25 M+为PQQ-DA分子离子峰(图5)。将其色谱峰积分面积代入标准曲线计算得PQQ-DA含量(c，mg/mL)，再根据c×V(进样体积)/m(脑组织重量)计算得到正常小鼠脑组织中PQQ-DA含量为(0.25±0.006)ng/mg，而PQQ缺损模型鼠中未检出PQQ-DA，连续注射PQQ (1.0 mg/mL) 6周后的小鼠脑组织中PQQ-DA含量为(1.09±0.012)ng/mg。

3 结 论

本文制备了PQQ-DA印迹磁性纳米粒子聚合物，并优化了实验条件，建立了UPLC-MS检测小鼠脑内痕量PQQ-DA的分析方法。该方法特异性强、选择性好，未来有望运用到疾病的诊断和治疗中。