碳量子点荧光探针的设计及其在农残检测中的应用进展

白秋月，杨春亮，叶剑芝，林丽云，陈吴海

(1.华中农业大学 食品科技学院，湖北 武汉 430070；2.中国热带农业科学院 农产品加工研究所，广东 湛江 524000)

农药残留是农药使用后残存于生物体、农副产品和环境中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称[1]。在农业生产中，农药是农作物增收增产的重要保障，但农药的施用量及分解量失衡会造成严重的农药残留问题[2]。大部分农药具有高毒性，残留在大气、土壤、水和农作物中会严重威胁人类健康及整个生态系统[3-4]，滥用农药[5]将直接或间接地威胁人类的健康。食品中的农药残留除了影响消费者健康外，还与进出口贸易、国家声誉，乃至社会安定密切相关。近年来，国内外因农药残留引发的食品安全问题接连不断，已成为当今各国政府和社会各界广为关注的焦点问题之一[6-7]。

残留农药的快速、准确定量检测是监控农产品质量的重要手段。缺乏快速、灵敏、高效的监测技术已成为制约我国农畜产品贸易和生产发展的重要因素。为了攻克这一难题，研制低毒无公害的新型农药，开发高灵敏度、高选择性的农残检测新技术，对农药使用量进行有效控制势在必行[8]。已报道的农残检测技术如色谱法、酶联免疫吸附法和电化学分析法等灵敏度高、准确性好，但通常较为耗时且需要复杂的前处理过程、昂贵的仪器设备和特定的操作技能，有时还需使用有毒溶剂[9-16]。如酶联免疫吸附法成本高、抗体合成程序耗时，且易受周围环境影响[17-18]；电化学分析法的电极修饰程序复杂，易受假阳性影响[19]。而基于碳量子点的荧光探针检测技术易操作，不需大型仪器设备，且碳量子点合成原料丰富、价格经济，在荧光探针的构建方面表现出巨大的潜力，故被科研工作者广泛关注并研究。本文简要论述了碳量子点的特性、合成原料及制备方法，重点对碳量子点的修饰策略及其构建的荧光探针在农残检测中的应用进行了详细且全面的综述。

1 碳量子点的合成

1.1 碳量子点的特性

碳量子点(CDs)一般是指至少在一维空间的尺寸小于 10 nm，能稳定发光的纳米碳点，是一种分散性良好、表面富官能团的碳纳米颗粒，是继石墨烯、碳纳米管以及富勒烯之后出现的一种以碳为骨架结构，以sp2杂化纳米晶碳或无定形碳为核心的新型碳纳米材料[20-23]。碳量子点具有独特的发光性质，其发光具有尺寸和激发波长依赖性，并且具有高的稳定性，无光漂白现象，能有效克服有机染料发光不稳定，易光漂白的缺点。荧光碳量子点除了具备量子点的上述优点外，还具有光稳定性高，无“光闪烁”现象，表面易于功能化修饰以及制备材料来源广泛等优势。此外，因为碳量子点不含重金属元素，所以其毒性很低，具有好的生物兼容性，不会引起重金属污染；克服了硫化镉等传统无机量子点高毒、不利于广泛应用的缺点[24]。以上的诸多优点，使碳量子点在食品安全分析领域表现出巨大的应用前景。到目前为止，碳量子点已经被成功应用于荧光传感检测[25-26]。

1.2 碳量子点的合成原料及制备方法

CDs的合成原料来源丰富，合成方法简单。用物理法或化学法(如激光销蚀法、弧放电法、电化学氧化法等)，以石墨、活性碳、碳纳米管和纳米金刚石作为碳源通过“自上而下”的方法剥离即可得到性能优越的CDs[27-28]；用化学法以碳水化合物如有机酸盐(柠檬酸盐、焦磷酸盐)或糖类(葡萄糖、壳聚糖、阿拉伯糖、醋酸纤维素)为碳源，通过“自下而上”的方法也可以制备满足各种用途的CDs[23,29-33]。目前CDs的合成方法包括水热法、微波法、溶剂热法、超声法，在这些合成方法中，水热法和微波法因可制备出粒径高度均匀的CDs，且设备简单、合成可控、效率高、适合大规模生产，故应用最广泛[34-35]。近年来的研究显示：相比于其它碳源，以天然产物为前体合成的CDs显示出良好的发光稳定性、低毒性、良好的生物相容性和高溶解性，且成本低，合成路径绿色环保[36]。

以天然产物为原料合成CDs时多采用水热法。Wang研究组将木瓜粉作为天然碳源，采用水热法制备的水溶性CDs和乙醇可溶性CDs，均表现出良好的生物相容性，其量子产率(QY)分别达18.98%和18.39%，可作为荧光探针检测Fe3+，检测限分别为0.48 μmol·L-1和0.29 μmol·L-1[37]。Somasundaram等将香蕉植物假茎的汁液与乙醇混合，制备得到高荧光强度的CDs，其QY高达48%，并对Fe3+具有高选择性，检测限低至6.4 nmol·L-1[38]。Shen等以红薯为碳源，通过水热处理合成了无毒、分散性好、QY达8.64%的CDs，并成功应用于活细胞中Fe3+的检测[39]。以食用绿色植物西兰花为碳源，一步水热法合成CDs的方法简单、绿色、成本低，在构建高灵敏荧光探针检测Ag+时，检测限为0.5 mmol·L-1，有望作为免标记Ag+检测荧光探针用于环境水污染监测[40]。除用常见植物作为碳源合成CDs外，Zhang等以宁夏的太原煤为碳源，采用硝酸氧化辅助水热法合成发绿色荧光的CDs，并依据Fe3+可与CDs表面的酚羟基形成复合物的原理，设计基于CDs 的荧光探针检测Fe3+，检出限低至0.67 μmol·L-1[41]。Zhan等将3-氨丙基三甲氧基硅烷与戊二醛混合合成硅掺杂的CDs，其QY达13.60%，且基于Cu2+对硅掺杂CDs具有选择性荧光猝灭作用，建立了水样中Cu2+的分析检测方法，该法操作简单、选择性好、灵敏度高[42]。水热合成方法便捷、高效、绿色，显著提高了CDs的合成效率，因此可更方便地合成高性能的CDs用于构建功能化荧光探针。

相比于水热法，采用微波法以天然产物为原料合成CDs的报道相对较少。用微波法处理莲藕，可合成QY高达19.0%的氮掺杂碳点(N-CDs)。莲藕切碎混合超纯水搅拌，在微波炉(800 W)中加热6 min，然后将溶液离心，过滤并透析。合成的N-CDs可灵敏检测Hg2+，检测限低至18.7 nmol·L-1，该探针成功用于污水实际样品的监测[43]。Zhang等以草酸和尿素为混合碳源，微波法一步合成了氮掺杂的具有蓝色荧光的CDs，并发现相比于单独以草酸为碳源，用尿素进行氮掺杂得到的CDs可获得更高的QY，且该CDs具有良好的温敏荧光响应性质，有望作为温敏性光学纳米探针在细胞研究领域得到应用[44]。Wang等将天然无毒的羊毛清洗切成3～5 mm，与水混合后加入到微波消解罐中，200 ℃下加热1 h，然后离心15 min，通过一步微波辅助热解工艺制备了CDs。该合成方法简单，且不含其它添加剂，制备的高性能CDs可应用于构建荧光探针检测农残[45]。微波辅助合成法加热均匀、功率可调、反应时间短，因而极大地提高了CDs的合成效率。

2 碳点荧光探针的设计及其在农残检测中的应用

随着CDs合成方法及表面功能化修饰技术的不断发展，其荧光量子产率、荧光寿命、水溶性及生物兼容性等性能也极大地提高，并广泛用于荧光检测[26]。目前已有许多研究基于碳点的复合材料设计荧光探针，如掺杂碳点荧光探针、分子印迹聚合物包埋碳点荧光探针及酶抑制型碳点荧光探针等，且已成功用于农残检测。Larki等研究发现在杀螟硫磷存在下，CDs的荧光能明显增强，并据此设计了基于CDs的荧光探针检测杀螟硫磷[46]。Gao基于对硫磷可显著增强CDs的荧光强度，设计了荧光增强型探针检测对硫磷[47]。相反，Chang等基于对氧磷可猝灭CDs的荧光，设计了荧光猝灭型探针检测蔬菜上的对氧磷[48]。

2.1 以掺杂碳点设计荧光探针用于农药检测

Li等以离子液体巯基乙酸N-甲基乙醇铵为前体合成S、N共掺杂的CDs，通过双酶级联催化反应引起该CDs的荧光猝灭，并以此构建用于高灵敏检测农药(西维因)的荧光探针，检测限低至5 μg·L-1[58]。在该方法中，掺杂不仅增强了CDs荧光寿命，QY也由掺杂前的7%提高至12.5%，因此极大地提高了该荧光探针的检测效率；另外，CDs掺杂后还可以提高检测目标的选择性，如用S、N掺杂CDs设计荧光探针能显著增强农药的选择性。Zou等以L-半胱氨酸为C、N、S源，一步水热法合成了N,S-CDs，并基于氟啶胺与N,S-CDs之间发生内滤效应猝灭N,S-CDs荧光的机理构建了该目标物的高灵敏检测探针。该荧光探针可以成功用于土壤和苹果等复杂实际样品中氟啶胺的检测[59]。元素掺杂的策略在改善CDs光学性能的同时还可以进一步改变其表面官能团，使其更容易功能化或有利于检测目标的特异性识别。另外，目前报道的大多掺杂策略都是基于非金属元素的掺杂，金属元素掺杂也能大大改善CDs的光学性能，因此金属元素掺杂的CDs构建的高效荧光探针的研究也正受到越来越多研究者的关注。

2.2 分子印迹聚合物包埋碳点的荧光探针用于农药检测

分子印迹聚合物(MIPs)是通过分子印迹技术合成对特定模板分子具有特异性识别能力和选择性吸附的聚合物,通常称为塑料抗体或仿生抗体[9]。MIPs作为受体或识别元件能通过特定设计的空腔对目标分析物进行识别[60]。通过MIPs包埋CDs设计荧光探针同时整合了MIPs的高选择性作为目标物的识别部件和CDs的发光性能作为信号输出基团，基于此可构建对特定目标分子识别并引起荧光传感信号变化的一种功能复合物材料探针[61]。这些材料价格低，机械和化学稳定性高，且可重复使用，因此受到科研工作者的广泛关注。

Ensafi等以橙汁为碳源通过水热法制得CDs，以盐酸异丙嗪(PrHy)为模板分子，环己烷为功能单体，通过反相微乳液法合成了碳点-分子印迹聚合物(CDs-MIPs)。CDs-MIPs的荧光强度与PrHy的浓度在2.0～250 μmol·L-1范围内呈良好的线性关系，检测限为0.5 μmol·L-1。将该法用于实际样品中PrHy的检测，回收率为96.4%～102%[62]。因此，当CDs和分子印迹技术的独特性质相结合时，荧光探针的选择性得到极大提高，其应用前景良好。另外，Liu及其团队以甘薯皮为碳源制备生物质CDs，在功能单体和交联剂的作用下通过溶胶-凝胶法合成聚合物，然后用乙醇和水洗去模板分子，得到CDs-MIPs。随着目标分子土霉素浓度的增加，CDs-MIPs的荧光强度逐渐降低。该荧光探针已成功用于蜂蜜中土霉素的检测，回收率为90.2%～97.3%，检出限为15.3 nmol·L-1[63]。同样，Liu采用溶胶-凝胶法设计了氨基修饰的CDs-MIPs，通过苯醚甲环唑农药分子特异性结合聚合物的空腔引起检测信号的变化，构建高特异性定量检测苯醚甲环唑的高效荧光探针，检出限低至0.93 μg·mL-1[64]。利用荧光共振能量转移(FRET)的机理，也可设计高灵敏度、高选择性、方法便捷的农残检测探针[65]。基于CDs和键合甲基红染料的MIPs之间能产生FRET，Li研究团队在氧化铟锡电极上制备MIPs，开发了一种新型分子印迹荧光探针来检测复杂样品中的乐果，该方法灵敏度高、选择性高、稳定性好，检出限低至0.018 nmol·L-1[25]。将CDs与量子点(QD)结合，Mohammad开发了一种双发射介孔结构分子印迹荧光探针比率检测烯唑醇 (DNZ)。在该探针设计中，二氧化硅纳米球包裹的蓝色荧光CDs作为内参信号，封装在介孔二氧化硅孔洞里绿色荧光的QD作为响应信号。DNZ选择性地猝灭QD的荧光，同时伴随着绿色到蓝色的颜色变化，根据荧光信号的蓝移和强度的变化，可以高灵敏检测DNZ[66]。该CDs/QD荧光探针结合了分子印迹技术的高选择性和比率测定的准确性，另外MIP的介孔结构有效地解决了常规MIP结合位点少、比表面积小的问题。将该荧光探针应用于水和土壤样品中DNZ的测定，获得满意的回收率。

MIPs包埋CDs的荧光探针在极大提高检测目标特异性的同时，也使探针的可修饰性大大提高，从而有利于构建特定功能的高灵敏探针检测农残。但MIP传感器存在聚合物可能不规则，且模板分子可能永久性被捕获导致目标分子吸附性差的缺点。

2.3 酶抑制型碳点荧光探针用于农药检测

酶抑制型碳点荧光探针广泛用于农药的检测。农药作为抑制剂，可抑制酶的活性或作为重要的底物直接参与酶催化反应，间接影响荧光信号的强弱。酶的“Induced-Fit”关系使基于酶催化反应的农残检测方法具有较高灵敏度和良好的选择性。如乙酰胆碱酯酶(AChE)、丁酰胆碱酯酶、胰蛋白酶、有机磷水解酶及酪氨酸酶等酶的应用已经引起越来越多的关注[67]。AChE和丁酰胆碱酯酶在农残检测中的应用较广泛。在AChE抑制型荧光探针中，AChE可催化乙酰硫代胆碱生成含有化学反应性基团巯基的硫代胆碱(TCh)，该物质可与金属阳离子或荧光纳米材料发生特异性反应[68]。

3 总结与展望

碳点作为不含重金属的荧光纳米材料，其主要成分碳是构成生命体的元素之一，具有荧光强度高、水溶性好、耐光漂白、低毒性、生物相容性好等优点，在农残检测方面得到了越来越广泛的研究，具有极大的应用潜力。然而，对碳点的研究利用仍处于初级探索阶段，其结构组成、荧光机理尚不十分明确。在合成制备方面，原料的选择多样且方法灵活简便，但多数仍仅限于实验室合成，对其表面性能进行后续纯化处理通常比较繁琐和耗时，且影响荧光量子产率。在食品安全检测应用方面，碳点构建的荧光探针由于具有响应速度快、价格低廉、无需大型仪器设备的特点，在该领域有很大的应用潜力；但在实际样品分析时由于成分复杂，仍面临许多挑战；例如受共存干扰物的影响，检测目标的特异性不强，检测的灵敏度也有待提高；另外目前报道的大多数方法检测目标单一，多组分同时检测的报道非常少，需要进一步的研究探索。因此，合成产率高、稳定性好、性能更优越的碳点，通过寻找合适的原材料，并对合成方法进行优化，在降低成本的同时提高产率，是实现碳点大规模应用的关键。在构建碳点荧光探针方面，进行功能化及与其它方法(酶生物传感器、免疫分析、分子印迹聚合物、电化学传感器等)深度联合能进一步拓宽应用范围，构建灵敏度好、准确度高、特异性强的荧光探针，是碳点荧光探针的重要发展方向，这些方面的努力有望为食品安全监管提供有效的新技术和新方法。