食品中维生素D与25-羟基维生素D检测技术及含量分布研究进展

李 兵，赵海燕，屠瑞莹，柳 静，孟 娟，刘泰然，杨永红，肖香兰，陈 东，周香玉，赵 榕

(北京市疾病预防控制中心 北京市预防医学研究中心，营养与食品卫生所，北京 100013)

维生素D是一类具有胆钙化甾醇生物活性物质的总称，其中麦角钙化甾醇(维生素D2)和胆钙化甾醇(维生素D3)是具有生物活性的两种形式，对保持人体钙磷平衡、维持骨骼和牙齿健康具有重要作用。维生素D在人体内首先转化为25-羟基维生素D，进而代谢为1,25-二羟基维生素D等活性物质。人体缺乏维生素D可导致佝偻病、软骨病等多种疾病[1]，目前维生素D缺乏已经成为世界普遍存在的公共卫生问题。人体获取维生素D有日光照射和膳食摄入2个途径，若能够接受充足的日光照射，人体自身形成的维生素D即可满足生理需要，无须额外补充[1]。而对于无法获得充足日光照射的人群，膳食摄入是其补充维生素D的重要途径。因此维生素D和25-羟基维生素D在食品中的含量分布十分重要，是开展饮食指导和摄入量评估的重要基础。

天然维生素D主要存在于动物性食品(鱼、肉、蛋、奶)和植物性食品(蘑菇、木耳、银耳)中[2]。25-羟基维生素D是维生素D的代谢产物，主要存在于动物性食品如鱼、肉、蛋、奶中，有研究表明其生物活性是维生素D的1.5～5.0倍[3-5]。由于维生素D和25-羟基维生素D在食品中的含量较低，且基质干扰严重，因此已有方法多采用皂化除去油脂等干扰物质后再使用半制备色谱或者固相萃取等前处理步骤进行净化后测定，测定方法主要有放射免疫法和色谱法等。本文综述了近年来食物中维生素D和25-羟基维生素D的检测方法，包括前处理方法和测定方法，以及含量分布研究的进展，以期为开展相关工作提供理论依据。

1 样品前处理

1.1 皂化方法

皂化是食品中维生素D和25-羟基维生素D检测的常用前处理方法，主要用以去除脂肪等干扰物质达到净化的目的，并使维生素D从一些结合物中游离出来进行测定[6]；该方法采用一定量乙醇和氢氧化钾的水或醇溶液在氮气的保护下避光进行皂化反应，皂化前需在样品中加入一定量抗氧化剂(如抗坏血酸、焦性没食子酸、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚等)以保护目标物不被氧化。皂化有热皂化和冷皂化2种，其中热皂化通常在50～100 ℃下反应15～120 min，有研究认为较高的温度会引起维生素损失和异构化[7]。而冷皂化(常温下皂化15～16 h)则可避免维生素D在皂化过程中的损失。

1.2 提取方法

样品皂化后，一般采用有机溶剂提取目标物，常用提取方法为液液萃取法，萃取溶剂通常为石油醚、正己烷、二氯甲烷、丁醇、异辛烷乙醚、异丙醚等单一溶剂或混合溶剂。液液萃取方法简单、易操作，但存在乳化、有机溶剂消耗量大、繁琐费时等问题。固相支撑液液萃取可减少这些问题的发生，该法通常以硅藻土为载体，可为皂化液和提取溶剂提供更大的接触表面积，从而提高提取效率，降低有机溶剂使用量。Strobel等[8]采用硅藻土固相支撑液液萃取提取了猪肉、牛肉、羊肉和鸡肉中的维生素D和25-羟基维生素D，显著缩短样品的前处理时间，减少了有机溶剂用量，但由于萃取柱批次间的差异，会导致结果有偏差，可采用同位素内标校正。

也有研究不皂化而直接使用溶剂提取样品中维生素D和25-羟基维生素D，如Höllera等[9]采用甲醇提取并测定了猪不同组织中的25-羟基维生素D3，方法的回收率为80.3%～105%，相对标准偏差(RSD)为1.0%～26%，检出限为1～5 ng/g；Jiao等[10]采用Fe3O4聚吡咯磁性纳米微粒直接从牛奶中提取富集维生素D2和D3，该方法仅需15 min和0.5 mL有机溶剂，维生素D2和D3的回收率为72%～90%，RSD为3.6%～9.9%，检出限分别为0.02 ng/mL和0.05 ng/mL，方法简单快速。

1.3 净化方法

由于食品基质十分复杂，且维生素D和25-羟基维生素D的含量较低，为了获得良好的分离度和灵敏度，测定前需采用固相萃取柱或者半制备色谱净化。硅胶固相萃取和正相半制备色谱是常用的净化方法，也有研究将两者联用对样品净化，以达到更好的净化效果。如Bilodeau等[11]先采用硅胶固相萃取柱净化，再分别使用配备有硅胶柱和氨基柱的正相半制备色谱再次净化，测定了肉、蛋、鱼等食品中的维生素D3和25-羟基维生素D3。张洁等[12]研究发现，对维生素D和25-羟基维生素D含量高的样品可只采用正相半制备色谱净化，而对于含量较低的复杂样品(如猪肉、禽肉等)需联合固相萃取和半制备色谱柱净化。Höllera等[9]采用甲醇提取、C18固相萃取柱净化测定猪脂肪和皮中的25-羟基维生素D3。李珉等[13]采用凝胶渗透色谱及液相色谱-串联质谱测定了油脂性食品中维生素A、D、E，样品经环己烷-乙酸乙酯(体积比5∶5)提取，采用凝胶渗透色谱净化去除油脂后上机测定，并将分析结果与皂化-液液萃取/液相色谱法进行对比，发现凝胶渗透色谱/液相色谱-串联质谱联用法在检出限、回收率和精密度方面优势明显，不但将单个样品的检测时间从190 min缩短至45 min，且显著减少了人工操作，自动化程度高。

2 仪器方法

食品中维生素D和25-羟基维生素D的测定方法有放射免疫法、液相色谱法、液相色谱-质谱法、二维液相色谱法、超临界流体色谱法、薄层色谱法等。其中液相色谱法和液相色谱-质谱法能够对维生素D2/D3、25-羟基维生素D2/D3进行有效分离并测定，具有高选择性的特点，成为食品中维生素D和25-羟基维生素D的主要测定方法。与液相色谱法相比，液相色谱-质谱法灵敏度更高，特异性更强，但检测成本较高，且对实验人员操作技能的要求更高。

由于食品中维生素D和25-羟基维生素D的前处理方法非常繁琐，因此采用内标法能够更精确的定量。维生素D2和维生素D3的化学结构非常相似，在进行液相色谱法测定时，可采用维生素D2和维生素D3、25-羟基维生素D2和D3互为内标的方法[14]。液相色谱-质谱测定时，常使用同位素内标，因为除了色谱分离以外，质谱检测器还可根据分子量信息将同位素内标和目标物提取分离。同位素内标与目标物具有相似的分子结构，色谱行为更为相似，可有效校正前处理造成的损失，因此能够获得更好的精密度和准确度[15-16]。

2.1 液相色谱法

液相色谱(主要包括正相高效液相色谱、反相高效液相色谱、二维液相色谱和超高效液相色谱)因其良好的分离能力被广泛用于食品中维生素D和25-羟基维生素D的分析。由于正相色谱需使用大量环境不友好的溶剂，因此现在多采用配备C18色谱柱的反相液相色谱对食品中维生素D进行测定[16]，随着色谱填料技术的不断发展，也有采用其他色谱柱分离维生素D的报道，如Pokkanta等[17]使用PFP色谱柱在30 min内分离了米糠、植物油中维生素D3等18种化合物。近年来，配备亚2 μm直径填料色谱柱的超高效液相色谱发展迅速，因其具有分离度高、分析速度快的特点，逐渐在食品中维生素D的检测方面发挥重要作用[18]。由于样品中维生素D的含量很低，且基质干扰严重，因此常规的检测方法先使用正相半制备色谱净化，收集馏分浓缩后再采用反相色谱分离测定，需两台色谱系统，操作繁琐费时。近年来发展起来的二维液相色谱，可以在线使用第一根色谱柱对目标物进行初步分离，再将目标物切割进入第二根色谱柱进一步分离，不仅实现了在线净化，还减少了前处理步骤，缩短了前处理时间、提高了分析效率。二维液相色谱仪器条件的选择需考虑色谱柱的差异性和流动相的兼容性。张艳海等[19]采用在线二维液相色谱法测定维生素AD制剂中维生素A和D的含量，分别选择C8柱和极性嵌合的C18柱作为一维和二维色谱柱，以乙腈-甲醇-水作为流动相进行梯度洗脱，得到维生素D的回收率为90.0%～98.9%,RSD为1.1%，定量下限为0.015 mg/L，方法的准确度和精密度良好，大大提高了实际样品的分析效率；林玉宙等[20]采用在线二维液相色谱测定了婴幼儿配方乳品和婴幼儿米粉中维生素A、D3、E的含量，该方法以超高效C18柱和聚合键合的C18键合相PHA柱分别作为一维和二维色谱柱，分别以甲醇-水和乙腈-异丙醇为一维和二维的流动相进行梯度洗脱，得维生素D3的回收率为90.1%～99.7%，RSD为0.97%，定量下限为0.005 3 mg/L。且该法与国标10769-2010方法检测结果相一致，可用于实际样品的测定。岑建斌等[21]采用正相二维液相色谱测定了婴幼儿乳粉中维生素A、D3、E的含量，采用NH2柱和Silica柱作为一维和二维色谱柱，均以异丙醇-环己烷(2∶98)和正己烷为流动相，方法的平均回收率为86.7%～90.6%，RSD为3.50%～3.83%，定量下限为0.07 mg/kg，此方法与国标方法GB5413.9测定的结果不存在显著性差异，可满足日常乳粉检测的定量需求。

2.2 液相色谱-质谱法

高效液相色谱-质谱法可通过色谱分离目标物，还可根据目标物的质荷比进行定性，具有灵敏度高、选择性好的优点，已成为维生素D和25-羟基维生素D的重要分析手段。张洁等[12]采用高效液相色谱-串联质谱法测定畜禽肉中的维生素D3和25-羟基维生素D3，方法的加标回收率为75.0%～97.1%，RSD为1.9%～5.6%，检出限均为0.60 μg/kg。并且比较了高效液相色谱和高效液相色谱-串联质谱法的测定结果，发现后者的灵敏度和特异性均优于前者，且线性和重现性均更好。Huang等[22]采用超高效液相色谱-串联质谱测定奶粉中维生素D2和D3，两者的加标回收率为100%～108%，RSD为3.7%～8.2%，定量下限为0.11、0.086 IU/mL。该研究还比较了超高效液相色谱-串联质谱和高效液相色谱-串联质谱的测定结果，发现前者能够将保留时间从20 min缩短至10 min，且可以更好地将干扰物与目标物分离，结果准确度更高。

研究表明，衍生可以提高维生素D的离子化效率，降低背景干扰，常用的衍生剂为4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)。Gomes等[23]采用液相色谱-串联质谱法测定了母乳、牛奶、羊奶、马奶中的维生素D2/D3、25-羟基维生素D2/D3、1,25-二羟基维生维D2/D3以及24,25-二羟基维生维D2/D3，方法的回收率为88.2%～105%，RSD为4.8%～14%。并对比了皂化和沉淀蛋白对萃取的影响，确认沉淀蛋白的效果更好。该研究还优化了使用PTAD进行柱前衍生的方法，发现对5种维生素D类似物，当PTAD与其物质的量之比为10 000∶1、反应1 h时产物的灵敏度均最佳。并通过对前端液相色谱条件进行优化，有效降低了基质效应，使25-羟基维生素D及其异构体得到了良好的分离。Gill等[24]采用超高效液相色谱-串联质谱和PTAD衍生的方法测定了牛奶和奶粉中的维生素D3，方法的回收率为94.7%～105%，RSD为1.4%～4.5%，该研究表明经PTAD衍生后的产物具有良好的灵敏度和选择性，有效减少了样品前处理时间和液相色谱分离时间。在多家实验室验证研究中[25]，9家实验室采用液相色谱-串联质谱和PTAD衍生法对婴儿奶粉和营养产品中维生素D2和D3进行了测定，重复性RSD为1.9%～5.8%，重现性RSD为6.4% ～ 13%，采用标准物质NIST 1849a进行准确度试验，P值为0.32，表明该方法具有良好的准确度和精密度。Nestola等[26]采用在线高效液相色谱-气相色谱-质谱法对食品中维生素D2和D3进行了测定，定量下限分别为128、157 pg，重复性RSD为1.0%～1.3%，与高效液相色谱/紫外检测器法和高效液相色谱-串联质谱法需使用半制备色谱和固相萃取净化相比，该方法简化了样品前处理步骤，是一种高通量检测方法。

2.3 超临界流体色谱法

超临界流体色谱采用二氧化碳和少量有机溶剂为流动相，具有绿色环保的特点，与高效液相色谱相比，可以在更短的时间内实现化合物的良好分离，是近年来快速发展的分析技术。由于二氧化碳属于非极性物质，因此超临界流体色谱非常适合分析疏水性化合物，且可添加不同极性的有机溶剂作为助溶剂，使流动相的极性十分灵活多样，能满足不同极性化合物的分离需要。超高效超临界流体色谱是基于超临界流体色谱的新型分离仪器，与亚2 μm粒径色谱柱联用可进一步提高其分离效率。本实验室采用超高效超临界流体色谱对保健食品中类胡萝卜素和动物肝脏中的维生素A异构体进行分离测定，获得了良好的分离效果[27-28]。Oberson等[29]采用超高效超临界流体色谱-串联质谱测定了食品中多种脂溶性维生素，以Acquity UPC21-AA(3.0 mm×100 mm,1.8 μm)为色谱柱，含有10 mmol/L甲酸铵的甲醇-水(98∶2)溶液为助溶剂，在柱温为45 ℃，背压1 856 psi条件下，于7 min内实现了视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酸酯、视黄醇、α-生育酚、α-生育酚醋酸酯、维生素D2、维生素D3、维生素K1、维生素K2的分离。所有脂溶性维生素的回收率为90.0%～110%，采用标准物质NIST 1849a进行准确度试验，测定结果与参考值没有统计学差异。Rathi等[30]以Acquity UPC2BEH Column(3.0 mm×100 mm,1.7 μm)为色谱柱，异丙醇为助溶剂，在柱温为50 ℃，背压1 800 psi条件下采用超高效超临界流体色谱对食用油中多种脂溶性维生素进行了测定，在8 min内实现了视黄醇、视黄醇乙酸酯、维生素D2、维生素D3、生育酚、维生素K1、维生素K2的分离。所有目标物的回收率为69.5%～98.6%，RSD为0.01%～1.8%，定量下限为0.05～3.59 μg/mL。Hamada等[31]采用超临界流体色谱-反相高效液相色谱-质谱测定了油和脂肪样品中的维生素D，样品经正己烷提取后直接进样分析，超临界流体色谱在线净化，反相高效液相色谱-质谱测定，回收率为84.3%～110%，RSD为5.8%～7.1%，方法显著减少了样品前处理时间，提高了分析效率。

2.4 放射免疫与薄层色谱法

Purchas等[4]采用Biosource公司的放射免疫分析试剂盒对牛羊肉中25-羟基维生素D3进行了测定。取1.5 g样品，切碎后以2.5 mL乙腈-水(10∶4)萃取3 h，离心后测定。结果发现生肉样品和烹饪后样品中25-羟基维生素D3的变异系数分别为8.5%(n=48)和7.7%(n=72)，检出限为0.6 ng/mL。Trineeva等[32]以梯度薄层色谱法测定了食品中维生素A、D2、E、β-胡萝卜素，维生素D2的检出限为7×10-9g，RSD为4.9%。结果表明薄层色谱具有简单易操作，低成本的特点，可用于植物样品、保健食品中多种维生素的测定。

近年来食品中维生素D的部分检测方法见表1。

表1 食品中维生素D的检测方法Table 1 Determination methods of vitamin D in foods

3 食品中维生素D与25-羟基维生素D含量分布研究进展

近年来欧洲、美国、韩国等国家和地区都建立了维生素D和25-羟基维生素D的食物成分表[2,38-39]。Yoo等[39]的研究表明韩国人维生素D主要膳食来源为鱼和贝类(71.34%)、蛋类(14.89%)。刘琰等参照《日本食品标准成分表》中维生素D的数据研究发现，银耳是中国北京、苏州等八地区学龄前儿童维生素D最重要的膳食来源(48.16%)，其次是奶类及奶制品(36.16%)和木耳(5.27%)。并指出我国学前儿童维生素D摄入水平不容乐观，建议适量增加维生素D的摄入，同时避免摄入过量[40]。

3.1 动物性食品中维生素D和25-羟基维生素D分布研究进展

Liu等[43]考察了澳大利亚市场上红肉(羊肉、牛肉等)中维生素D3和25-羟基维生素D3的含量，以及纬度的影响。结果发现羊瘦肉中维生素D3和25-羟基维生素D3的含量分别为0.10 μg/100 g和0.20 μg/100 g；羊肉脂肪中分别为0.88 μg/100 g和<0.20 μg/100g；牛瘦肉中分别为0.12 μg/100 g和0.27 μg/100 g；牛肉脂肪中分别为0.76 μg/100 g和0.40 μg/100 g。纬度对于瘦牛肉中二者的含量几乎没有影响，但低纬度的牛肉脂肪中维生素D3的含量要比高纬度的牛肉高。

Guo等[44]测定了鸡蛋中维生素D3和25-羟基维生素D3的含量，结果发现散养和有机饲养的鸡蛋中维生素D3的含量均高于室内饲养，且25-羟基维生素D3的含量在有机鸡蛋中的含量最高，可能与其在饲养过程中受到更多阳光照射相关。研究结果表明鸡蛋中维生素D的含量约为2 μg/个,约为英国65岁以上居民膳食维生素D推荐摄入量的20%。Jakobsen等[45]测定了奶制品中的维生素D2/D3和25-羟基维生素D2/D3的含量。牛奶、奶油、黄油中维生素D3和25-羟基维生素D3的含量为4.6～196 ng/100 g和4.2～96 ng/100 g，牛奶和黄油中维生素D2分别为3.4、61 ng/100 g,25-羟基维生素D2分别为3.1、58 ng/100 g。Martini等[46]测定了食用驴奶中维生素D的含量，测得生驴奶中维生素D2和维生素D3的含量分别为1.68、0.60 μg/100 mL，经巴氏杀菌处理后二者的含量为1.38、0.30 μg/100 mL。研究表明驴奶中二者的含量高于其在牛奶和母乳中的含量，因此食用驴奶可增加维生素D摄入量。Gill等[47]比较了不同季节牛奶中维生素D3和25-羟基维生素D3的含量，发现维生素D3的含量范围为167～615 ng/L，而25-羟基维生素D3的含量变化不大，均小于50 ng/L。

3.2 植物中维生素D的含量分布研究进展

Hughes等[48]测定了13种澳大利亚食用植物和海藻中的维生素D2/D3、25-羟基维生素D2/D3，结果在5种样品中检出维生素D2，含量为0.03～0.67μg/100 g干重，1种样品中检出维生素D3，含量为0.01 μg/100 g干重。Kühn等[49]对可可豆及其制品中维生素D含量进行了测定，测得黑巧克力中维生素D2含量为1.90～5.48 μg/100 g，白巧克力中维生素D2含量为0.19～1.91 μg/100 g，巧克力坚果酱中维生素D2含量为0.15 μg/100 g。Nölle等[50]研究了光照和干燥方式对于蘑菇中维生素D2含量的影响。结果显示，不切和切片蘑菇经紫外光照射后维生素D2含量分别为45、406 μg/g干重。蘑菇经日晒干燥和太阳能干燥器干燥后维生素D2含量分别为36、39 μg/g干重。由此可见，经紫外光照射、日晒干燥、太阳能干燥器干燥后的蘑菇中均含有较高的维生素D2。

4 结论与展望

维生素D是维持人体健康的重要脂溶性维生素，食品是其摄入的重要来源之一，因此建立我国维生素D食品成分数据库对其摄入量研究具有重要意义，而准确可靠的检测方法是研究的前提和基础。由于食品中维生素D和25-羟基维生素D含量较低，且基质干扰较多，因此已有前处理方法多采用繁琐复杂的前处理步骤(如皂化、液液萃取、半制备液相色谱净化等)，存在有机溶剂用量大、耗时长、耗费人力物力的缺点，因此研究开发简单快速的前处理方法可以极大地提高样品的检测效率。由于维生素D2/D3、25-羟基维生素D2/D3在样品中的含量较低，并且其结构较为相似，因此开发具有高灵敏度、高特异性的检测方法是今后的研究方向。目前食物中维生素D的研究多关注肉类食物，对于植物中维生素D的研究较少。而我国是植物性食品的消费大国，研究植物中的维生素D含量对于提高我国居民的维生素D营养水平具有重要意义。