纳米金信号探针/石墨烯修饰免疫传感器检测微囊藻毒素

张晶晶，康天放，刘锦华，丁 玎，宋海燕，杜晓丽

(1.北京工业大学 环境与能源工程学院，北京 100124；2.北京市劳动保护科学研究所，北京 100054)

纳米金信号探针/石墨烯修饰免疫传感器检测微囊藻毒素

张晶晶1，2*，康天放1*，刘锦华2，丁 玎2，宋海燕1，杜晓丽1

(1.北京工业大学 环境与能源工程学院，北京 100124；2.北京市劳动保护科学研究所，北京 100054)

纳米金信号探针；石墨烯；微囊藻毒素；免疫传感器

微囊藻毒素是一种环状七肽肝毒素，是淡水水体富营养化的次级代谢产物。微囊藻毒素-(亮氨酸-精氨酸)(Microcystin-(Leucine-Argineine),MCLR)是目前发现的100多种异构体中毒性最强、急性危害最大的一种[1]，世界卫生组织发布的《饮用水水质准则》中规定MCLR限值为1 μg/L，因此建立一种快速、高灵敏度的MCLR检测方法具有重要意义[2]。

电化学免疫传感器具有选择性高、响应快、灵敏度高等特点，在快速分析领域被广泛研究应用[3]。纳米材料的引入为免疫传感器发展提供了新的可能性，主要用于敏感分子的固定、提高电子传递速率、信号的检测和放大等[4]。纳米金(AuNPs)具有比表面积大、表面活性中心多、良好的导电性和生物相容性等优点[5]，在免疫传感器的构建过程中，主要通过电化学还原[6]或化学还原[7]等方式形成不同纳米微结构的修饰层，起到提高灵敏度或固定敏感分子的作用。相较于大多数通过酶标记物催化产生或放大检测信号[8]，纳米信号探针更易保持标记载体生物活性，提高检测稳定性。纳米金在生物标记分析中同样具有重要贡献,1971年Faulk等[9]首次将AuNPs引入到免疫分析中制成电子显微镜的金探针，近年来AuNPs被广泛应用于细胞、抗原、抗体和DNA的标记物[10-12]。石墨烯(Graphene sheet，GS)具有单原子厚度，以正六边形排列呈蜂窝状二维平面结构，理论比表面积达2 630 m2/g，室温下平面电子迁移率为1.5×104cm2/(V·s)，GS还具有优异的机械力学性能和良好生物相容性，具有固载生物活性分子和信号传递并放大的双重作用，成为构筑电化学生物传感器的理想材料[13-15]。

本文利用1-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化GS偶联BSA-MCLR，将其悬浊液修饰于玻碳电极表面，在电极表面滴加一定量的混合溶液，其中含有不同浓度的MCLR和一定量AuNPs标记的anti-MCLR(记为Ab-Au)，使溶液中MCLR与电极表面的BSA-MCLR竞争结合Ab-Au，通过电化学氧化将AuNPs溶于溶液中，再采用差分脉冲伏安法(DPV)进行阴极电位扫描，通过DPV峰电流对MCLR进行定量分析。

1 实验部分

1.1 仪 器

电化学实验在CHI660e电化学工作站(上海辰华仪器公司)上进行，三电极系统：玻碳电极(Φ=3 mm)为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂丝电极为辅助电极。2450型紫外-可见吸收光谱仪、SPM-9600型透射电子显微镜(日本岛津公司)；SU-8010型扫描电子显微镜(日本日立公司)；FE20型pH计(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2 试 剂

石墨粉(320目，光谱纯)购于国药化学试剂有限公司；氯金酸(HAuCl4·3H2O)购于北京百灵威科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA，分子量66.4 kDa)购于Sigma有限公司。anti-MCLR(分子量15 wDa)、MCLR、BSA-MCLR、微囊藻毒素-精氨酸-精氨酸(MCRR)和微囊藻毒素-络氨酸-精氨酸(MCYR)均购于北京伊普瑞思科技有限公司。水合肼、H2SO4、HCl、H2O2等试剂购于北京化学试剂公司，所有试剂均为分析纯及以上纯度。实验用水为超纯水(Milli-Q Advantage A10 超纯水系统，法国Millipore公司)。

1.3 石墨烯的制备

取一定量石墨放入80 ℃烘箱中干燥2 h后待用。将3.0 g K2S2O8、3.0 g P2O5、12 mL 98%浓硫酸置于三口烧瓶中，边搅拌边加热至80 ℃，然后向烧瓶中加入2.0 g烘干的石墨粉末，待反应物完全变为蓝色后停止加热，冷却至室温，用二次水稀释，过滤，直至滤液呈中性。

采用改进的Hummers法[16]，向预氧化的石墨中加入46 mL浓硫酸和1 g NaNO3，搅拌混合均匀后，放入0 ℃冰浴中，缓慢加入6 g KMnO4，控制反应温度不超过10 ℃。去掉冰浴，悬浊液温度升至(35±3)℃，保持30 min。反应过程中，混合物逐渐变稠，最后变成糊状。30 min后，向烧瓶中缓缓加入92 mL水，烧瓶中剧烈冒泡，温度升至98 ℃，稀释的悬浊液呈褐色，在该温度下继续反应15 min后，再加入28 mL热水，进一步稀释。用3%的H2O2还原剩余KMnO4为无色可溶性正二价锰盐，此时溶液呈亮黄色。趁热过滤，并用过量的(250 mL左右) 1∶10的HCl溶液洗涤，过滤移除金属离子。用水充分洗涤至中性后，置于60 ℃烘箱中烘干，得到黄褐色氧化石墨。

将干燥后的氧化石墨分散于二次水中，在100 W功率下超声处理5 h，使氧化石墨片层剥落，得到棕色悬浊液。将悬浊液离心分离10 min，移去未剥离的氧化石墨，得到氧化石墨烯悬浊液。向氧化石墨烯悬浊液中加入100 μL水合肼，95 ℃水浴中搅拌反应5 h，溶液由黄褐色变为黑色。将样品用水充分淋洗过滤，烘箱干燥，得到黑色憎水的石墨烯。

1.4 金溶胶的制备

将8 mL 1%的柠檬酸三钠溶液迅速加入到0.01% 100 mL沸腾状态下的HAuCl4溶液中，搅拌15 min，混合溶液的颜色由浅黄变为酒红色。自然冷却至室温，即得纳米金溶胶，置于4 ℃冰箱黑暗条件下保存备用。

1.5 免疫传感器的制备

将2 mg GS高度分散于水中，向其中加入100 mmol/L EDC和100 mmol/L NHS，摇床中振荡反应2 h，然后将1 mL 60 μg/mL BSA-MCLR加入到上述混合溶液中，继续反应2 h。将混合溶液离心、超纯水清洗，得到共价连接MCLR的石墨烯片复合物(GS-MCLR)悬浊液，4 ℃下储存备用[17]。

将4 μL 20 μg/mL的anti-MCLR与20 μL的AuNPs胶体溶液混合，室温下反应30 min，AuNPs与anti-MCLR中的半胱氨酸残基通过Au-S键连接，将混合溶液于14 000 r/min条件下离心1 h，移去含有未与AuNPs偶联的抗体的上清液，所得沉淀为AuNPs标记的anti-MCLR，分散于10 μL水中，制成Ab-Au悬浊液，标记为Ab-Au[18]。

用粒径为0.5 μm的Al2O3悬浊液将玻碳电极抛光成镜面，用水冲洗后分别用乙醇和水超声清洗5 min，氮气吹干。在玻碳电极表面滴加10 μL GS-MCLR溶液，室温下晾干，得到免疫传感器GS-MCLR/GCE，4 ℃下储存备用。免疫传感器的制备过程如图1所示。

图1 免疫传感器制备示意图Fig.1 Fabrication process and the detection mechanisms of the immunosensor absence(a) and presence(b) of MCLR

1.6 测定方法

2 结果与讨论

2.1 纳米金的表征

图2A为AuNPs的紫外可见光吸收光谱，在519 nm处出现特征吸收峰，根据文献[20]的方法计算AuNPs粒径约为19 nm。透射电镜图(图2B)显示，AuNPs形状呈球形，均匀分散，粒径分布为16～20 nm。

2.2 石墨烯的表征

采用扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)对所制备的石墨烯进行了表征。从图3可以看出，石墨烯呈无序、褶皱的薄纱片层结构，部分薄片层堆叠，呈多层结构。这种结构稳定，可极大地增加电极的比表面积。

2.3 电极在修饰过程中的电化学行为

采用循环伏安法考察了不同修饰电极在含1.0 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-的0.1 mol/L KCl溶液中的电化学行为，扫描电位范围为-0.6～0.3 V，扫描速率为100 mV/s。如图4所示，[Fe(CN)6]3-/4-在裸玻碳电极表面的循环伏安图有1对峰形较好的氧化还原峰，氧化峰电位约为-0.18 V，还原峰电位约为-0.25 V(图4a)；当电极表面修饰10 μL 2 mg/mL石墨烯溶液后，氧化还原峰电流明显增大(图4b)，表明石墨烯具有良好的导电性，能够显著提高探针分子在电极上的电子传输，此外，该循环伏安图也呈现出较大的充电电流；当在玻碳电极表面修饰MCLR-GS后，该修饰层对电子转移起到阻碍作用，原因在于制备MCLR-GS修饰剂时所采用的微囊藻毒素是偶联了牛血清白蛋白的MCLR(BSA-MCLR)，由于BSA的导电性差，使得MCLR-GS/GCE的峰电流明显小于GS/GCE，但比裸玻碳电极略大(图4c)。电极表面修饰4 μL 20 μg/mL anti-MCLR(Ab)之后，峰电流下降(图4d)，Ab增大了探针离子通过膜的阻力；当在电极表面修饰了含有AuNPs的修饰剂Ab-Au/MCLR-GS之后，[Fe(CN)6]3-/4-在电极上的氧化还原峰电流略增大(图4e)，说明AuNPs显著增大了电极表面修饰层的导电性，AuNPs可以通过与抗体发生化学吸附作用较好地保持抗体的生理活性。

图4 GCE(a)、GS/GCE(b)、MCLR-GS/GCE(c)、Ab/MCLR-GS/GCE(d)和Ab-Au/MCLR-GS/GCE(e)在含1 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-的0.1 mol/L KCl溶液中的循环伏安图Fig.4 Cyclic voltammograms of GCE(a),GS/GCE(b),MCLR-GS/GCE(c),Ab/MCLR-GS/GCE(d),Ab-Au/MCLR-GS/GCE(e)in 0.1 mol/L KCl solution containing of 1 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-

图5 不同浓度MCLR免疫传感器的差分脉冲伏安图Fig.5 Differential pulse voltammograms of MCLR of different concentrationssupporting electrolyte solution:2 mol/L HCl;concentration of MCLR(a-f):0,0.100,1.00,10.0,25.0,50.0 μg/L；insert：calibration curve of determination MCLR

2.4 实验条件的优化

2.4.1底液中盐酸浓度的优化考察了底液中HCl浓度(1～3 mol/L)的影响。结果显示，峰电流信号随着HCl浓度增加而增大，在浓度超过2 mol/L后峰电流信号下降，本文采用2 mol/L为最佳HCl浓度。

2.4.2 BSA-MCLR浓度的优化随着BSA-MCLR浓度的增加越来越多的BSA-MCLR偶联在石墨烯表面，从而使检测的峰电流信号增强，当BSA-MCLR浓度超过60 μg/mL后，峰电流信号随着BSA-MCLR浓度增加变化不大，因此选用60 μg/mL BSA-MCLR为最佳浓度。

2.4.3 anti-MCLR浓度的优化AuNPs标记的anti-MCLR的用量对峰电流强度产生直接影响，实验结果表明，当anti-MCLR浓度在5～20 μg/mL范围时，峰电流信号随anti-MCLR浓度的增加而增强，当 anti-MCLR浓度超过20 μg/mL后，峰电流信号无明显变化，因此选择20 μg/mL anti-MCLR为最佳条件。

2.5 免疫传感器对MCLR的测定

在优化条件下，考察了MCLR-GS/GCE免疫传感器对不同浓度MCLR的电流响应。如图5所示，差分脉冲伏安峰电流(DPV)随MCLR浓度的增加而减小。ΔI与MCLR质量浓度在0.1～50 μg/L范围内呈良好的线性关系，回归方程为ΔI(μA)=0.471 5+0.155 2CMCLR(μg/L)，相关系数为0.991 6，检出限为0.05 μg/L(S/N=3)。

2.6 重现性、稳定性与选择性

免疫传感器MCLR-GS/GCE在4 ℃下保存30 d，对浓度为10 μg/L的MCLR进行测定，响应电流为最初的97.3%，说明免疫传感器具有较好的稳定性。相同实验条件下，以5支免疫电极检测1.00 μg/L MCLR，响应电流的相对标准偏差(RSD)为7.2%，表明制备的免疫传感器具有良好的重现性。

3 结 论

本文构建了纳米金信号探针/石墨烯修饰的MCLR电流型免疫传感器，并用于微囊藻毒素的检测。结果表明，该传感器操作简单，相较于酶标记材料，AuNPs粒径和质量小，巯基与AuNPs形成Au-S键，不易脱落，与电极间的电子传递速率更快，灵敏度高、检测效果良好，作为信号探针更加经济便捷。本研究建立的检测MCLR的新方法快速、可靠，对现场快速筛查和定量分析水体中MCLR具有重要意义。

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Determination of Microcystins Using a Graphene Modified Immunosensor Based on Au Nanoparticles Signal Probe

ZHANG Jing-jing1,2*,KANG Tian-fang1*,LIU Jin-hua2,DING Ding2,SONG Hai-yan1,DU Xiao-li1

(1.College of Environmental and Energy Engineering，Beijing University of Technology,Beijing 100124，China;2.Beijing Municipal Institute of Labour Protection,Beijing 100054，China)

AuNPs signal probe;graphene;microcystins;immunosensor

O657.1；TP212.2

:A

：1004-4957(2017)09-1075-06

2017-04-12；

：2017-05-31

国家重点研发计划项目(2016YFC0700604)资助

*

：张晶晶，博士，助理研究员，研究方向:快速检测技术与应用，Tel:15011596908,E-mail:zjjzhaxidele@163.com 康天放，博士，教授，研究方向：化学生物传感技术及化学污染物快速检测应用，Tel:010-67391659,E-mail:kangtf@bjut.edu.cn

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.09.003