光谱法与共焦荧光成像法研究罗丹明B与ct-DNA的相互作用

于博昊,缪文彬,吴 婷,康 燕,姚建磊,张 磊*

(1．华东理工大学 化学与分子工程学院，上海 200237；2．上海出入境检验检疫局，上海 200135)

光谱法与共焦荧光成像法研究罗丹明B与ct-DNA的相互作用

于博昊1,缪文彬2,吴 婷1,康 燕1,姚建磊1,张 磊1*

(1．华东理工大学 化学与分子工程学院，上海 200237；2．上海出入境检验检疫局，上海 200135)

采用吸收光谱、荧光光谱以及共焦荧光成像技术研究生理条件下罗丹明B(Rhodamine B，RB)与小牛胸腺DNA(ct-DNA)的相互作用以及相互作用模式。光谱研究结果显示，在450 ～650 nm的吸收光谱范围内，ct-DNA溶液对罗丹明B有减色作用；在560～660 nm荧光发射光谱范围内，ct-DNA对罗丹明B有荧光猝灭作用。同时，随着ct-DNA的加入，罗丹明B溶液的荧光偏振值发生变化，说明罗丹明B与ct-DNA能发生相互作用。在竞争性实验中，罗丹明B未能将亚甲基蓝(MB)从MB-ct-DNA复合体系中置换出来，说明罗丹明B与ct-DNA通过沟槽结合方式发生相互作用。共焦荧光成像结果显示，ct-DNA加入后，罗丹明B的荧光猝灭十分明显。利用罗丹明B和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对HeLa细胞染色后进行共焦荧光成像，结果进一步证实罗丹明B与ct-DNA是通过沟槽结合作用将细胞核染成红色。

罗丹明B(RB)；小牛胸腺DNA(ct-DNA)；沟槽结合；光谱法；共焦荧光成像

DNA作为生物的基本遗传物质，是一种十分重要的生物大分子，是遗传信息的载体和基因表达的物质基础[1-4]。DNA分子的识别模式研究是当今国际科学前沿领域的研究热点，尤其在抗癌新药的设计和研制上具有重大意义和广阔前景。目前，许多抗癌药物在细胞内均以DNA为作用靶点[5-9]，通过与癌细胞的DNA发生相互作用破坏其双螺旋结构，影响基因调控与表达功能，抑制DNA的复制、转录，最终导致癌细胞凋亡。近年来，国内外许多科学家均在研究DNA分子的识别模式，以期找到识别DNA分子的新型化合物。小分子化合物与DNA的相互作用主要有嵌插结合和沟槽结合。沟槽结合仅仅导致DNA结构的微小变化，但DNA依然保持“B”型结构。嵌插结合是配体平面的一部分插入到DNA临近的碱基对中，从而导致DNA结构发生巨大变化，使得DNA链变长，变硬，并发生双链解旋[10]。探索常用的小分子荧光化合物与DNA相互作用模式，对于靶向抗癌药物的设计具有潜在的指导意义。罗丹明B是一种常用的以氧蒽酮为母体的碱性染料显色剂，有较深的颜色，常被用作荧光探针。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

紫外-可见-近红外分光光度计(美国Perkin Elmer，Lambda 950)，荧光/磷光/发光分光光度计(美国 PerkinElmer，PE LS55)，激光扫描共聚焦荧光显微镜(日本 Nikon，A1R)；亚甲基蓝(MB)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)和罗丹明B(RB)均购于国药集团化学试剂有限公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司)；小牛胸腺DNA(ct-DNA，Sigma公司)溶液用pH 7.4 的Tris-HCl缓冲液(含0.5 mol·L-1NaCl)溶解，通过260 nm处的紫外吸收确定其浓度，ct-DNA在260 nm处的吸光系数为6 600 mol/L，于4 ℃保存；罗丹明B用超纯水配成0.21 mmol/L储备液备用；所用试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1吸收光谱法将0.21 mmol/L罗丹明B储备液稀释成10.60 μmol/L，取适量该稀释液，依次加入不同体积的0.23 mmol/L ct-DNA，将混合溶液体系搅拌均匀，室温放置5～10 min，在450～650 nm范围内测试含不同ct-DNA浓度混合溶液的吸收光谱。

1.2.2荧光光谱法将0.21 mmol/L罗丹明B储备液稀释成0.085 μmol/L，取适量该稀释液，依次加入不同体积的0.23 mmol/L ct-DNA，将混合溶液体系搅拌均匀，室温放置5～10 min，以554 nm为激发波长，在560～660 nm范围内测试含不同ct-DNA浓度混合溶液的荧光光谱。

1.2.3荧光偏振光谱法利用软件采集荧光偏振值的功能，在进行“1.2.2”实验的同时，以最大吸收554 nm为激发波长，荧光发射峰576 nm为发射波长，积分时间1 s，自动采集含不同浓度ct-DNA的罗丹明B-ct-DNA溶液的荧光偏振值，绘制成曲线。

1.2.4竞争位点研究用超纯水将亚甲基蓝(MB)配成2.84 μmol/L的溶液，取适量该溶液，依次加入不同体积的0.23 mmol/L ct-DNA，将MB-ct-DNA混合溶液搅拌均匀，室温放置5～10 min，以660 nm为激发波长，在650～800 nm范围内测试含不同浓度ct-DNA混合溶液的荧光光谱。

依次将不同体积的罗丹明B加入到上述最终的MB-ct-DNA混合体系中，以660 nm为激发波长，在625～825 nm范围内测试含不同浓度罗丹明B混合溶液的荧光光谱。

1.2.5共焦荧光成像涂片成像：取0.085 μmol/L罗丹明B溶液2 μL涂片，然后用激光扫描共聚焦荧光显微镜进行扫描成像观察。然后取0.085 mmol/L ct-DNA溶液2 μL涂在该片上，再次进行扫描成像观察。

服装产业链中SCM、CRM、ERP、CAD等系统的应用较普遍。这些系统相对独立，在企业内部形成了大量的各自独立的数据库，可以称之为 “数据孤岛”。当下，企业信息化的重点是如何连通各业务部门所产生的 “数据孤岛”，提高信息传递效率，完善业务流程。

细胞成像：将宫颈癌细胞(HeLa)培养4 h，分别用DAPI和罗丹明B对细胞染色，进行细胞成像观察。

图1 ct-DNA浓度对罗丹明B吸收光谱的影响Fig.1 Absorption spectra of Rhodamine B in the presence of various concentration of ct-DNAcct-DNA(1-14)：0，2.28,4.51,6.70，8.85，10.95，13.02，15.05，17.04，20.91，24.64，30.00，36.72，44.52 μmol/L,respectively

图2 ct-DNA浓度对罗丹明B荧光光谱的影响Fig.2 Fluorescence spectra of Rhodamine B in the presence of various concentration of ct-DNAcct-DNA(1-11)：0，1.10，2.28，3.40，4.51,5.61，6.70，7.78，8.85，9.90，10.95 μmol/L,respectively

2 结果与讨论

2.1 ct-DNA与罗丹明B相互作用的吸收光谱

吸收光谱能简单而有效地检测出小分子化合物与DNA的结合情况。当小分子和DNA相互作用并形成新的复合物时，通常伴有吸收强度和吸收带位置的变化[11]。ct-DNA与罗丹明B相互作用的吸收光谱如图1所示。罗丹明B的浓度为10.60 μmol/L时，最大吸收峰位于554 nm，随着ct-DNA浓度的增加，吸光度从1.02降至0.58，吸收光谱表现出明显的减色现象，这表明罗丹明B与ct-DNA发生了相互作用，两者的结合方式可能为沟槽结合[12]。同时，最大吸收峰位置几乎不发生变化，这表示两者的结合形式为非嵌插作用[13]。

2.2 ct-DNA对罗丹明B的荧光猝灭

荧光猝灭的研究可为考察罗丹明B与ct-DNA的相互作用模式提供重要的理论依据。由图2可以看出，室温条件下向罗丹明B中加入ct-DNA后，随着ct-DNA浓度的增加，荧光发射峰位于576 nm，几乎没有发生变化，而罗丹明B的荧光强度从432依次降低至287。这说明ct-DNA可使罗丹明B的固有荧光猝灭，两者能发生相互作用。

2.3 荧光偏振光谱

荧光偏振值可以反映荧光分子的转动情况，当荧光小分子结合到大分子上时，荧光分子的偏振值会发生改变，这种定量测试的方法不受溶液浓度或者环境条件的影响，可以快速、简单、方便地表征荧光分子与大分子相互反应作用的程度[14]。如果荧光小分子的偏振值升高，说明大分子限制了荧光小分子的自由转动，两者发生了相互作用。实验表明，在罗丹明B溶液中逐渐加入ct-DNA后，随着ct-DNA浓度的提高，罗丹明B-ct-DNA体系的偏振值由0.056逐渐升至0.062，表明罗丹明B结合到ct-DNA上，两者发生了相互作用。ct-DNA限制了罗丹明B的自由转动，使得罗丹明B的分子转动速度降低。

2.4罗丹明B与MB竞争ct-DNA结合位点的研究

亚甲基蓝(MB)是一种常见的DNA嵌插结合剂，故常用作荧光探针来研究化合物与双链DNA的结合机制[15]。如图3A所示，随着体系中ct-DNA浓度的升高，通过嵌插结合，MB自身荧光强度发生明显的变化，ct-DNA能够猝灭MB的荧光强度，荧光强度从371降至211，同时，MB的荧光发射峰发生明显蓝移，从695 nm蓝移至690 nm，这说明两者发生相互作用，生成了复合物。如果罗丹明B也能通过嵌插作用与ct-DNA结合，将会与MB共同竞争DNA上的结合位点，从而导致MB-ct-DNA复合体系的荧光强度显著下降[16]。由图3B看出，随着溶液中罗丹明B浓度的升高，MB-ct-DNA体系的荧光强度为602～605，未发生显著变化，荧光发射峰位置在687～688 nm之间，也未发生显著变化，这说明罗丹明B未能置换出MB，两者没有形成竞争机制，而是形成了罗丹明B-MB-ct-DNA新的三元体系。这进一步证明了罗丹明B与ct-DNA的结合方式不是嵌插结合，而是沟槽结合。

图3 ct-DNA浓度对MB荧光光谱的影响(A)以及罗丹明B溶液滴定MB-ct-DNA体系的荧光光谱(B)Fig.3 Fluorescene spectra of MB in the presence of various concentration of ct-NDA(A) and fluorescene spectra of MB-ct-DNA complexes in the presence of varying concentration of Rhodamine B(B)A.cct-DNA(1-9)：0，0.34，0.69，0.92，1.14，1.37，1.60，1.83，2.05 μmol/L,respectively；B.cRB(1-9)：0，0.25，0.45，0.65，0.84，1.03，1.21，1.39，1.57 μmol/L,respectively

2.5 共焦荧光成像

激光扫描共聚焦荧光显微镜由于具有观察细胞标记的效率高，对活细胞毒副作用小等特点而被广泛应用于细胞或者材料等的成像。

在设置相同参数扫描时，图4A中罗丹明B溶液的共焦荧光成像图呈现均匀的亮红色。加入ct-DNA后，由于配制ct-DNA溶液的Tris-HCl缓冲液中含有NaCl，激光扫描后该体系部分呈现结晶状态，图4B中图片亮度明显变暗，说明ct-DNA对罗丹明B有明显的荧光猝灭作用。

图4 罗丹明B溶液(A)和罗丹明B-ct-DNA溶液(B)的共焦荧光成像图Fig.4 Confocal imaging of Rhodamine B(A) and Rhodamine B-ct-DNA(B)

DAPI是一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，荧光显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞核。利用共焦荧光分别对DAPI和罗丹明B染色的HeLa细胞进行成像(如图5)。图5A、B、C、D分别为DAPI染细胞核、罗丹明B染细胞、细胞明场、叠加场的共焦荧光成像图。由图5B可以看出，罗丹明B可将细胞核、细胞质、细胞膜染上均匀的红色。因为DAPI与DNA具有很强的沟槽结合作用[17]，能将细胞核染上蓝色，由此可以看出罗丹明B与DNA通过沟槽结合作用能将细胞核染上红色。

图5 DAPI和罗丹明B染色的HeLa细胞共焦荧光成像图Fig.5 Confocal imaging of HeLa cell dyed by DAPI and Rhodamine BA:HeLa cell nuclear dyed by DAPI;B:HeLa cell dyed by RB;C:HeLa cell bright field image;D:HeLa cell merged image

3 结 论

本文采用光谱法和共焦荧光成像法研究了罗丹明B与ct-DNA的相互作用模式。吸收光谱、荧光光谱研究结果表明，ct-DNA对罗丹明B有减色和荧光猝灭作用；罗丹明B溶液的荧光偏振值发生变化，说明两者发生相互作用；吸收光谱的最大吸收峰位置没有发生位移，说明两者属于非嵌插结合；罗丹明B未能将MB从MB-ct-DNA体系中置换出来，说明罗丹明B与ct-DNA为沟槽结合。共焦荧光成像结果表明，罗丹明B与ct-DNA通过沟槽作用能将细胞核染成红色。本文为研究其他小分子荧光化合物与DNA的相互作用模式提供了快速、简单、直观的方法，同时对于设计、合成和筛选靶向DNA的化合物具有重要的指导和借鉴意义。

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Study on Interaction between Rhodamine B and Calf Thymus DNA by Spectroscopy and Confocal Imaging

YU Bo-hao1,MIU Wen-bin2,WU Ting1,KANG Yan1,YAO Jian-lei1,ZHANG Lei1*

(1.School of Chemistry & Molecular Engineering,East China University of Science and Technology，Shanghai 200237,China；2.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai 200135,China)

The interaction between Rhodamine B and calf thymus DNA(ct-DNA) at physiological conditions were studied by the techniques of absorption spectroscopy,fluorescence spectroscopy and confocal imaging.The results of spectroscopy experiments suggested that the hypochromicity of Rhodamine B could appear in the presence of ct-DNA from 450 nm to 650 nm in the absorption spectroscopy,and the fluorescence of Rhodamine B was quenched in the presence of ct-DNA from 560 nm to 660 nm in the fluorescence emission spectroscopy.At the same time，the fluorescence polarization of Rhodamine B varied with the addition of ct-DNA.It was indicated that Rhodamine B could interact with ct-DNA.In the competition experiments,Rhodamine B was unable to replace methylene blue(MB) from MB-ct-DNA complex.It was indicated that the interaction between Rhodamine B and ct-DNA took place by the mode of groove combination.The results of confocal imaging experiments showed that the fluorescence of Rhodamine B was quenched quite obviously after the addition of ct-DNA.HeLa cells were dyed with Rhodamine B and 4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI),then used for confocal imaging.It was further verified that the cell nucleus could be dyed red through the groove combination interaction between Rhodamine B and ct-DNA.

Rhodamine B；ct-DNA；groove combination；spectroscopy；confocal imaging

O433.4；O641.3

:A

：1004-4957(2017)09-1087-06

2017-03-13；

：2017-06-01

国家质检总局科技计划项目(2016IK227)

*

：张 磊，博士研究生，工程师，研究方向：光谱分析，Tel：021-64253225，E-mail：leizhang595@126.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.09.005