UHPLC-Quadrupole/Orbitrap MS同步检测十字花科植物中的游离氨基酸

沈 丽，王 超，陈 静，杨 雪

(北京物资学院 物流学院，北京 101149)

UHPLC-Quadrupole/Orbitrap MS同步检测十字花科植物中的游离氨基酸

沈 丽*，王 超，陈 静，杨 雪

(北京物资学院 物流学院，北京 101149)

采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱联用技术(UHPLC-Quadrupole/Orbitrap MS)结合柱前衍生法建立了可同时测定28种游离氨基酸的分析方法，并对十字花科植物中的游离氨基酸进行检测和分析。样品用超纯水提取后，经6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(AQC)衍生，采用Waters BEH C18柱作为色谱柱，以pH 5.0乙酸铵缓冲溶液和80%乙腈水溶液作为流动相进行梯度洗脱。质谱检测器采用电喷雾离子源，在正离子模式下进行检测。实验结果表明，十字花科植物中含有25种以上游离氨基酸，其中包括人体必需的8种氨基酸。25种氨基酸在线性范围内相关性良好，平均加标回收率为80.5%～104.4%，相对标准偏差为0.6%～4.4%。不同氨基酸检测灵敏度不同，定量下限为0.01～1.45 μmol/L。该方法杂质干扰小，分析速度快，灵敏度高，适用于植物样品中游离氨基酸的同步检测。

超高效液相色谱；高分辨质谱；游离氨基酸；十字花科植物

氨基酸是生物体内构成蛋白质分子的基本单位，与生物的生命活动有着密切关系[1]。为适应人体新陈代谢的需要，人们必须从食物中摄取所需氨基酸。植物作为人类重要的食物来源，是人类获取氨基酸的主要途径之一[2]。同时，氨基酸还是蛋白质的分解产物，植物根系吸收、同化的氮素主要以氨基酸和酰胺的形式进行运输，测定植物体内氨基酸的含量有助于研究植物在不同条件下及不同生长发育时期氮代谢变化、植物对氮素的吸收、运输、同化等[3]。氨基酸在植物体内以游离态存在[4]，因此，测定植物体内游离氨基酸的含量具有重要意义。

早期主要采用氨基酸分析仪对游离氨基酸进行检测[5]，但由于氨基酸分析仪具有结构复杂、价格昂贵、测定时间长和灵敏度较低等缺点，分析工作者开发了一系列新方法来测定植物样品中的游离氨基酸，包括气相色谱法[6-7]、液相色谱法[8]、毛细管电泳法[9-10]、气相色谱-串联质谱法[11]以及高效液相色谱-串联质谱法[12-13]等。其中，反相高效液相色谱法因具有操作程序简单、运行时间短、灵敏度较高等特点，广泛应用于植物样品中游离氨基酸的检测。由于氨基酸极性较强，缺少可产生紫外吸收或荧光信号的基团，应用液相色谱法进行检测时需对氨基酸进行柱前衍生[14]。常用的衍生试剂有邻苯二甲醛(OPA)、9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)、2，4-二硝基氟苯(DNFB)、异硫氰酸苯酯(PITC)、丹磺酰氯、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯(AQC)等[15]。已报道的柱前衍生结合反相高效液相色谱法最多能实现22种游离氨基酸的同步检测，检出限在mg/L量级。由于氨基酸是一类化学性质相似的生物活性物质，检测方法的灵敏度对分析的准确性起非常重要的作用。因此，建立能同步检测更多种游离氨基酸、灵敏度更高、准确性更好、快速高效的氨基酸分析方法非常必要。

本文建立了一种柱前衍生/超高效液相色谱-高分辨质谱联用快速检测植物中游离氨基酸的方法，能同时检测多达28种氨基酸。所采用的衍生剂为AQC。AQC能同时与一级、二级氨基酸反应，且衍生时间较短，产物稳定性强，有较高的灵敏度，检出限低[15]，非常适合作为氨基酸检测的衍生剂。本文以十字花科最简单的植物——拟南芥作为代表，对上述方法应用于植物样品检测的条件进行优化，实现了油菜、香菜、生菜、油麦菜等十字花科植物中游离氨基酸的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters ACQUITY超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Thermo Scientific Q-Exactive超高分辨质谱仪(美国Thermo Scientific公司)；KQ5200DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；5418 高速离心机(德国Eppendorf 公司)；FreeZone冻干机(美国Labconco公司)；Vortex Genius 3涡旋混合器(德国IKA公司)；Milli-Q超纯水器(默克化工技术上海有限公司)。

WATERS AccQ-Fluor试剂盒(衍生剂粉2A、硼酸缓冲液、稀释液2B,Waters公司)；氨基酸标准混合溶液(Sigma-Aldrich公司)；乙酸铵(分析纯)、乙醇(色谱纯)、乙酸(色谱纯)和乙腈(色谱纯)均购自国药集团北京试剂公司。

拟南芥植物来自于实验室温室内种植；油菜、油麦菜、香菜、生菜等蔬菜购自市场。

氨基酸储备液浓度为450 μmol/L，使用时逐级稀释，使之浓度为100、20、5、1、0.5 μmol/L。

1.2 实验方法

1.2.1超高效液相色谱条件色谱柱：Waters ACQUITY UHPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；柱温40 ℃；流动相:A为20 mmol/L乙酸铵溶液(pH 5.0)，B为80%乙腈水溶液；梯度洗脱程序:0.00～3.06 min，97%～93% A；3.06～3.86 min，93%～88% A；3.86～3.89 min，88%～85% A；3.89～8.06 min，85%～66%A；8.06～12 min，66%～30% A；12～15 min，30% A；进样量：2 μL；流速：0.3 mL/min。

1.2.2质谱条件离子化模式：电喷雾离子源，正离子模式；质谱扫描方式：一级全扫描(分辨率70 000)和靶标二级扫描(分辨率35 000)；电离电压：3.5 kV；毛细管温度320 ℃；雾化气温度350 ℃；鞘气流量30 L/min，辅助气流量10 L/min，反吹气流量5 L/min。

1.2.3样品前处理方法将植物样品用超纯水洗净，在液氮条件下保存。从液氮中取出的植物样品放入真空冷冻干燥机中，直至样品干燥完全(约1.5 d)。选取干燥后的植物，去除根部后，全植株剪碎，并在研钵中充分研磨均匀。称取20 mg样品于离心管中，加1 mL超纯水提取，常温超声30 min后，离心10 min(5 000 r/min)，取上清液备用。

1.2.4衍生程序采用AQC为柱前衍生剂。取10 μL样品提取液置于衍生瓶中，加入70 μL硼酸盐缓冲液(Buffer 1)，混匀后加入20 μL衍生剂。室温放置1 min，置于55 ℃烘箱中，衍生10 min。取出冷却至室温后，装瓶上机待测。

2 结果与讨论

2.1 质谱与色谱条件的优化

为获得更高的选择性和灵敏度，对质谱条件包括离子模式、碎裂电压、离子源温度、鞘气流量及碰撞能量等参数进行了优化。结果显示，正离子模式下，各氨基酸的分子离子均为[M+H]+。正离子模式下各氨基酸的特征碎片离子如表1所示。

表1 28种待测氨基酸的保留时间、质谱参数、线性范围、相关系数及定量下限Table 1 Retention times,mass spectrometric parameters,linear ranges,correlation coefficients and quantitation limits of 28 amino acids

图1 28种氨基酸混合标准溶液的总离子流色谱图Fig.1 TIC chromatogram of amino acids mixed standard solution

为获得更好的分离效果，对色谱柱、流动相组成以及进样体积等色谱参数进行了优化。比较了BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm) 和HILIC C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm) 2种色谱柱，发现采用BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm) 能够得到较好的保留时间和峰形。因此，选择BEH C18柱作为分离柱。对于流动相，主要对乙酸铵浓度和溶液pH值进行优化。实验结果表明，当乙酸铵浓度在10～50 mmol/L范围时，所有氨基酸的峰形和峰强度基本不变。当乙酸铵浓度低于10 mmol/L时，多数氨基酸的峰强度下降，而乙酸铵浓度过高会对仪器系统产生不利影响，降低色谱柱的使用寿命。另外，通过优化发现流动相为弱酸性时所得信号较好，因此将流动相A的pH值设为5.0，浓度在10～50 mmol/L范围内均可。本实验选择的乙酸铵浓度为20 mmol/L。对进样体积进行优化时发现，进样体积超过2 μL时，氨基酸的分离度变差。在优化条件下，28种氨基酸的总离子流图如图1所示。

2.2 样品前处理条件的优化

2.2.1样品干燥方法新鲜植物样品的含水量高，在检测之前需将样品进行干燥处理。本实验采用烘箱烘干和真空冷冻干燥两种方式对拟南芥样品进行处理，氨基酸测定含量为3个批次实验的平均值，结果如表2所示。通过实验比较发现，样品经冻干处理后，大多数氨基酸的含量比样品经烘干处理后测得含量高，且相对标准偏差(RSD)较小。因此，冷冻干燥法可以更大限度的保留植物体内氨基酸含量，本文选择真空冷冻干燥法对植物样品进行处理。

表2 干燥方法对拟南芥中氨基酸含量测定的影响(μmol/g干重)Table 2 Effects of drying methods on the determination of amino acids in arabidopsis(μmol/g dry weight)

2.2.2样品提取液与提取温度的选择植物样品成分复杂，可能含有对氨基酸检测产生干扰的成分，因此需选择合适的提取液使基质干扰最小。实验分别以1 mL乙醇和超纯水作为提取剂，在0、25、70 ℃条件下对10 mg拟南芥植物样品超声处理30 min后，采用本方法测定游离氨基酸含量。对比发现，以超纯水作为提取剂所测得的氨基酸含量较高，且不同超声温度下，氨基酸含量的测定值无明显差异，样品提取实验在室温下进行即可。此外,以5%磺基水杨酸溶液作为稀酸溶液的代表，对拟南芥植物中的氨基酸进行提取。结果表明，磺基水杨酸稀溶液和纯水对各氨基酸的提取效果整体相当，但纯水提取后所得溶液颜色更清亮，因此本实验选用纯水作为提取剂。

2.2.3样品与提取液比例优化分别称取拟南芥样品10、20、30 mg溶于1 mL提取液中，按照上文所述步骤进行分析检测，结果显示样品质量分别为10 mg和20 mg时，所测得的游离氨基酸含量比值约为1∶2，但当样品质量为30 mg时，所测得的游离氨基酸含量与10 mg样品所测得的游离氨基酸含量比值小于1∶3，说明1 mL提取液不能将30 mg样品中的氨基酸提取完全。因此最终选择将20 mg样品溶于1 mL提取液中。

2.3 方法评价

2.3.1标准曲线与定量下限(LOQ) 采用分辨率为70 000的高分辨质谱仪来识别氨基酸；每种母离子色谱图的提取窗口设置为3 ppm来减少干扰。以各浓度下化合物的定量离子峰面积对浓度作线性回归得标准曲线，以10倍信噪比时的浓度计算定量下限(LOQ)，结果如表1所示。每种化合物的峰面积对相应浓度呈良好的线性关系，相关系数(r2)不低于0.995，LOQ为0.01～1.45 μmol/L，能够满足检测要求。

2.3.2准确性与精密度方法的准确度通过拟南芥植物样品添加已知量标准品所得回收率来考察，精密度则由回收率的RSD来反映。分别向样品中添加低浓度和高浓度的含有谷氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、脯氨酸5种氨基酸的混合标准品，每批次每个浓度设3个平行。以上5种氨基酸在化学性质、极性等方面差异较大，在植物样品内的含量也相差较大，可以代表绝大部分氨基酸。如表3所示，3个加标浓度的回收率为80.5%～104.4%，RSD为0.6%～4.4%，证明该方法重现性较好。

表3 5种氨基酸的回收率和相对标准偏差(n=3)Table 3 Recoveries and relative standard deviations of 5 amino acids in spiked samples(n=3)

表4 实际样品中游离氨基酸分析结果(μmol/g干重)Table 4 Determination results of free amino acids in real samples(μmol/g dry weight)

*no detection

2.4 实际样品分析

将该方法应用于市售油菜、油麦菜、香菜、生菜等4种十字花科植物中游离氨基酸含量的检测。分别采用外标法和内标法(以正亮氨酸为内标物)进行定量分析，经比较发现，内标法与外标法所得结果差别不大，说明两种方法均可用于植物中游离氨基酸的定量检测。因外标法比内标法更加简便，选择外标法进行定量分析，结果如表4所示。由此可见，4种蔬菜中含有丰富的游离氨基酸，油菜的氨基酸含量最高，其次是香菜、生菜、油麦菜。4种蔬菜中全部含有色氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸8种人体必需氨基酸，其中以油菜含量最高。

3 结 论

利用超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术结合AQC柱前衍生法建立了植物中游离氨基酸的快速检测方法。本方法将现有柱前衍生/RPHPLC方法的分析指标扩展到28个。通过优化色谱、质谱条件以及样品前处理方法，使检测更加便捷与准确。通过对十字花科植物中游离氨基酸的检测，发现植物中含有超过25种游离氨基酸，包括8种人体必需氨基酸，进一步证实了十字花科植物的营养价值。

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Detection of Free Amino Acids in Cruciferous Vegetables by Ultrahigh Performance Liquid Chromatography-Quadrupole/Orbitrap High Resolution Mass Spectrometry

SHEN Li*,WANG Chao，CHEN Jing,YANG Xue

(Logistics School,Beijing Wuzi University,Beijing 101149,China)

A simultaneous method was developed for the analysis of 28 free amino acids using ultrahigh performance liquid chromatography-quadrupole/orbitrap high resolution mass spectrometry with pre-column derivatization,and was used to detect the free amino acids in cruciferous plants.The samples were extracted using ultra-pure water,and derivatized with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate(AQC) to enhance chromatographic retention.A Waters BEH C18column was used as stationary phase.Ammonium acetate solution(pH 5.0) and 80% acetonitrile in water were applied as mobile phases for gradient elution.MS detector with electrospray ion source worked in positive ion mode.The results showed that there were more than 25 kinds of free amino acids in cruciferous plants,including 8 essential amino acids.All calibration curves of the analytes exhibited good linearity.The average recoveries of this method ranged from 80.5% to 104.4% with the relative standard deviations of 0.6%-4.4%.The sensitivities of amino acids were different,and the quantitation limit was between 0.01 μmol/L and 1.45 μmol/L.With the advantages of little impurity interference,rapidness and high sensitivity,the method is suitable for the simultaneous detection of free amino acids in plant samples.

ultra-high performance liquid chromatography;high resolution mass spectrometry;free amino acids;cruciferous vegetables

O657.63；Q517

:A

：1004-4957(2017)09-1093-06

2017-04-13；

：2017-05-25

北京市科技新星计划资助项目(2013028)；中国商品学会规划项目(SPXH201601)

*

：沈 丽，博士，副教授，研究方向：商品检验与质量管理，Tel:010-89534018，E-mail:lishen97@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.09.006