QuEChERS方法结合超高效液相色谱-串联质谱法快速检测鸡肉组织中扎那米韦药物的残留量

任明兴,刘正才，唐寰宇，杨　方，林永辉，苏芝娇，董文洪

(1.绍兴出入境检验检疫局，浙江　绍兴　312000;2.福建出入境检验检疫局，福建　福州　350001)



QuEChERS方法结合超高效液相色谱-串联质谱法快速检测鸡肉组织中扎那米韦药物的残留量

任明兴1,刘正才2*，唐寰宇2，杨方2，林永辉2，苏芝娇2，董文洪1

(1.绍兴出入境检验检疫局，浙江绍兴312000;2.福建出入境检验检疫局，福建福州350001)

应用QuEChERS前处理技术，建立了鸡肉和鸡肝中扎那米韦残留量的超高效液相色谱-串联质谱快速测定方法。样品经0.2 mol/L盐酸溶液-甲醇(1∶9)超声提取，离心后分取上清液，应用QuEChERS净化。化合物采用NUCLEOSHELL®HILIC (3.0 mm×100 mm，2.7 μm)柱以5 mmol/L乙酸铵-0.2%甲酸溶液和乙腈为流动相梯度洗脱分离，电喷雾电离(ESI)正离子多反应监测模式(MRM)进行测定，标准曲线外标法定量。结果表明，扎那米韦在5～100 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数(r)大于0.990;方法的定量下限(S/N=10)为10 μg/kg。以鸡肉和鸡肝为基质，在10，20，100 μg/kg加标水平下的平均回收率为80.5%～88.7%，相对标准偏差(RSD，n=6)为7.3%～11.8%，已应用于实际鸡肉样品的检测。该方法灵敏度高、重复性好、操作简单、快捷，适用于鸡肉组织中扎那米韦残留量的分析测定。

QuEChERS方法;超高效液相色谱-串联质谱法;扎那米韦;残留量;鸡肉组织

扎那米韦(Zanamivir)是1999年由美国食品与药品管理局批准用于治疗A型和B型流感的药物，其作用机制可能在于抑制流感病毒的神经氨酸酶，从而改变流感病毒在感染宿主细胞内的聚集与释放[1];同时，扎那米韦也是一种有效的抗禽流感药物，但长期使用会在动物体内形成药物残留导致中毒，并诱发病毒产生变异等症状，甚至会造成死亡危害人类健康[2-3]，美国FDA规定禁止扎那米韦用于畜禽类疾病的防治[4]，我国农业部公告第560号公告也规定禁止其作为兽用药物。

目前，检测可食性动物组织内扎那米韦残留的方法有液相色谱法(HPLC)[5-7]、液相色谱-质谱法(HPLC-MS/MS)[8-10]、液相色谱-高分辨率质谱法(LC-HRTOF)[11]等。扎那米韦属于强极性化合物，在HPLC分离的常规色谱柱上无法保留，需借助离子对试剂或衍生剂来检测，且检出限无法满足要求;LC-HRTOF在高分辨率扫描模式下可锁定目标化合物的精确质量数，具有较高的准确度，但高分辨率质谱的运行和维护成本较高，操作难度大;HPLC-MS/MS技术在检测的灵敏度、准确性和重复性方面具有较明显的优势，具有操作简单、灵敏度高等优势，适用于可食性动物组织中扎那米韦残留的分析测定。上述报道的样品净化技术均为液-液萃取和固相萃取方法。QuEChERS方法是近年国际上最新发展起来的一种用于农产品检测的快速样品前处理技术[12]，其原理是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而实现除杂净化，方法操作简单，可高效、快速地提取净化样品，被广泛应用于农药残留、兽药残留、毒素等检测[13-15]。目前运用QuEChERS方法对扎那米韦的残留检测尚未见报道，本文采用该技术对鸡肉样品进行前处理，以酸性甲醇提取样品中残留的扎那米韦，用C18粉和PSA同时吸附蛋白质、脂肪和酸性杂质实现样品的净化，所得上清液浓缩后经HILIC亲水色谱柱进行分离分析，为强极性化合物扎那米韦的快速检测提供了一种新方法。

1　实验部分

1.1仪器、试剂与材料

ACQUITY UPLC超高效液相色谱-串联质谱仪，配电喷雾离子源(API5500，美国AB Sciex公司);高速冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司);涡旋混合器(上海医科大学仪器厂);Milli-Q纯水系统(Millipore公司)。

乙腈、甲醇、甲酸(色谱纯，德国CNW公司);乙酸、三氯乙酸、盐酸、无水硫酸镁、无水硫酸钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司);扎那米韦标准品(纯度>98.0%，Sigma公司);N-丙基乙二胺键合固相吸附剂(PSA)和C18吸附剂(40 μm，美国Agilent公司)。实验用鸡肉样品购于超市。

准确称取适量扎那米韦标准品,用水溶解后以甲醇-水(1∶1)定容，配制成100 μg/mL的标准储备液，置于-4 ℃冰箱中保存;取适量标准储备液并用甲醇-水(1∶1)稀释成1 μg/mL标准中间液。根据需要用水逐级稀释成适当浓度的标准工作液。

1.2样品前处理

称取5.0 g样品于50.0 mL塑料离心管中，加入10 mL甲醇-0.2 mol/L盐酸溶液(9∶1)，振荡混匀2.0 min，超声10 min后以8 000 r/min离心5 min。取上层溶液5.0 mL至预先装有250 mg无水硫酸钠、150 mg PSA、200 mg C18粉吸附剂的离心管中，旋涡混合2 min，3 000 r/min离心2 min，移取2.5 mL上清液于另一5.0 mL空的离心管中，45 ℃下氮气吹干。加入1.0 mL 乙腈-0.1%甲酸溶液(1∶9)溶解残渣，过0.22 μm微孔滤膜后供超高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.3仪器条件

1.3.1色谱条件色谱柱：NUCLEOSHELL®HILIC (3.0 mm × 100 mm，2.7 μm)。流动相：A为5 mmol/L乙酸铵溶液-0.2 %甲酸;B为乙腈;梯度洗脱程序：0～1.5 min，10%A;1.5～3.0 min，10%～20%A;3.0～5.0 min，20%～40%A;5.0～6.0 min ，40%～10%A;6.0～10.0 min，10%A。流速0.4 mL/min;柱温30 ℃;进样量5 μL。

1.3.2质谱条件电离模式：电喷雾电离正离子模式(ESI+);检测方式：多反应监测(MRM);扎那米韦母离子m/z333.1;定量离子m/z60.1，碰撞能量35 eV;定性离子m/z121.1，碰撞能量47 eV。电喷雾电压(IS)：5 500 V;气帘气压力(CUR)：0.172 MPa(氮气);离子源温度(TEM)：500 ℃;雾化气压力0.379 MPa;辅助气压力0.379 MPa。

1.3.3超高效液相色谱-串联质谱测定将扎那米韦基质标准工作溶液在设定条件下分别进样，以定量离子峰面积(y)为纵坐标，扎那米韦浓度(x，ng/mL)为横坐标，绘制标准工作曲线。用该标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中扎那米韦的响应值应均在仪器测定的线性范围内。

2　结果与讨论

2.1色谱分离条件的优化

分别选用C18,C8和HILIC 3种类型色谱柱进行分离，结果发现C18柱对扎那米韦基本无保留;C8柱对扎那米韦的保留较弱，但基体抑制效应较强;键合醇羟基的HILIC柱也无保留，键合酰胺基的HILIC柱虽有较好的保留，但质谱仪器响应值较低;而采用季铵盐和磺酸混合键合硅胶的两性离子基团的HILIC柱可获得较好的分离效果，因此选其作为分离柱。选择乙腈为有机相，分别以5 mmol/L乙酸铵溶液、水、0.2%甲酸溶液、5 mmol/L乙酸铵-0.2%甲酸溶液等作为流动相的水相进行色谱分离实验，结果发现水相选用5 mmol/L乙酸铵溶液或水时，色谱峰形展宽，选用0.2%甲酸溶液时，对扎那米韦保留较弱，而选用5 mmol/L乙酸铵-0.2%甲酸溶液和乙腈作为流动相时，可获得较好分离效果。进一步考察了不同浓度甲酸(0.1%，0.2%，0.3%)、乙酸铵(2，5，10 mmol/L)以及不同流速对化合物分离效果的影响。结果显示以5 mmol/L乙酸铵-0.2%甲酸溶液和乙腈为流动相，流速0.4 mL/min时获得的峰形最好。

图1　扎那米韦标准品的二级离子碎片扫描 质谱图以及可能的裂解方式Fig.1　The product scan spectrogram and main fragmentation pattern of zanamivir

2.2质谱条件的优化

分别在正负离子模式下全扫描扎那米韦标准溶液(1.0 mg/L)，发现在正离子模式下响应值更高。进行一级质谱图全扫描，得到[M+H]+(m/z333.5)准分子离子峰，对选定的母离子进行子离子扫描，二级离子碎片扫描质谱图及可能的断裂规律见图1。选取离子m/z60.1作为扎那米韦的定量离子，m/z121.1作为定性离子，分别对子离子的碰撞能量进行优化，并在MRM模式下对雾化气压力、干燥气温度和流量等参数进行优化，优化参数见“1.3.2”。

2.3提取剂的选择

传统的QuEChERS方法通常选用乙腈或酸化乙腈作为提取剂，既有利于液液分层还能起到沉淀蛋白的作用，而扎那米韦易溶于水，微溶于甲醇，不溶于乙醚等有机溶剂。分别考察了乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯作为提取剂时对鸡肉中扎那米韦的提取效果。结果显示，甲醇的提取效率明显高于其它试剂。考虑到鸡肉基体杂质多，含蛋白、油脂较高，而扎那米韦易溶于水而难溶于有机溶剂等因素，实验比较了不同比例的盐酸-甲醇、乙酸-甲醇、甲酸-甲醇、三氯乙酸(TCA)-甲醇等混合溶液对扎那米韦的提取回收率以及沉淀蛋白的影响。结果发现0.2 mol/L盐酸溶液-甲醇(1∶9)混合溶剂的提取效果最好，此时扎那米韦的提取回收率为75%～87%。进一步考察了振荡提取、均质提取、超声提取3种不同提取方式对提取效率的影响，结果表明3种提取方式对扎那米韦的提取效率相近，因此实验选择易操作的超声提取法。

2.4QuEChERS净化条件的选择

扎那米韦结构上带有3个羟基，属于强极性化合物，同时也带有氨基(pKa=3.8)，属于弱碱性，在酸性溶液中主要以分子与离子状态共存，常规的C18型和离子交换型的固相萃取小柱均难以保留，QuEChERS方法使用分散固相萃取(DSPE)净化，固相吸附剂直接加入样品提取液以吸附干扰物，因此，重点研究了改良QuEChERS法对扎那米韦的净化。常用的固相吸附剂有C18粉、PSA等，PSA可吸附糖、有机酸等极性干扰物;C18可吸附脂肪等非极性干扰物，但吸附剂对目标化合物的吸附会导致回收率降低，影响测定结果的准确性，因此，对吸附剂的种类以及用量进行了优化。将扎那米韦直接加入空白鸡肉基质提取液中，按照本方法分别加入PSA和C18进行净化，考察不同吸附剂组合对基质的净化效果。结果表明，在实验条件下吸附剂PSA和C18对扎那米韦基本无吸附，2种净化剂组合均对基质有较好的净化作用，因此选择混合吸附剂PSA+C18。进一步研究了PSA吸附剂用量对空白样品基质提取液净化效果的影响，发现当PSA用量达30 mg/mL时可显著减少干扰峰的影响，继续增加其用量时净化效果无明显改善。进一步考察C18吸附剂用量对扎那米韦的吸附作用，结果表明，随着C18用量由20 mg/mL增至40 mg/mL，扎那米韦的回收率逐渐上升，但用量达到50 mg/mL时回收率开始下降。因此分别选择吸附剂PSA和C18的用量为30 mg/mL和40 mg/mL。另外，实验还比较了脱水剂无水MgSO4与无水Na2SO4对萃取回收率的影响，发现加入无水MgSO4会导致扎那米韦的回收率明显降低(见图2)，因此选用无水Na2SO4作为扎那米韦的脱水剂;进一步考察了无水Na2SO4的用量，发现随着无水Na2SO4的增加，回收率逐渐上升，用量达到50 mg/mL时基本达到饱和。

图2　不同吸附剂的种类和用量对扎那米韦 提取效率的影响(n=3)Fig.2　Influence of different sorbent composition on extraction efficiency of zanamivir(n=3)

图3　鸡肉空白基质(a)与鸡肉加标10 μg/kg(b) 的MRM色谱图Fig.3　MRM chromatograms of blank chicken(a) and chicken spiked with 10 μg/kg zanamivir(b)

2.5基质效应的考察

液相色谱-质谱方法开发和确证过程中需对基质效应作出评价,基质效应会对分析方法的重复性、灵敏度、准确度等产生较大影响，尤其是使用ESI源，常表现为对目标化合物的离子抑制作用[16]。本文以基质匹配校准曲线的斜率/溶剂标准校准曲线的斜率[17]考察化合物的基质效应，其比值越接近 1，则基质效应越小，反之亦然。分别比较了空白基质提取液、鸡肉提取液在不同添加水平(5.0，10，20，100 μg/L)下的基质效应，结果表明，不加净化剂和加净化剂后的基质抑制效应分别为58%和25%。本文使用基质匹配标准曲线的方法来进行化合物的定量测定。

2.6方法学评价

2.6.1线性范围、检出限与定量下限用QuEChERS方法净化后的空白样品溶液配制质量浓度分别为0，5，10，20，50，100 ng/mL的扎那米韦系列标准溶液，按“1.2”方法进行测定。以分析物的峰面积(y)和质量浓度(x，ng/mL)进行线性回归分析。结果表明，扎那米韦的线性范围为5～100 ng/mL，相关系数均大于0.990。以3倍信噪比(S/N)计算检出限(LOD)，10倍信噪比(S/N)计算定量下限(LOQ)，鸡肉和鸡肝中扎那米韦的LOD分别为3.0 μg/kg和3.2 μg/kg，LOQ均为10 μg/kg(见表1)。

表1　扎那米韦的线性方程、相关系数、检出限、定量下限及平均回收率(n=6)

2.6.2回收率与精密度选取空白的鸡肉和鸡肝作为加标回收实验基质，分别进行10，20，100 μg/kg 3个不同水平的加标回收试验，每个水平平行6组，结果如表1所示。在不同加标浓度下扎那米韦的平均回收率为80.5%～88.7%，相对标准偏差(RSD)为7.3%～11.8%。空白鸡肉加标样品的色谱图见图3，扎那米韦的峰形良好，无杂质干扰。

2.7方法应用

运用本文建立的分析方法对购于市场的22份鸡肉样品进行检测，采用基质匹配外标法进行定量分析，结果均未检出扎那米韦残留。

3　结　论

本文基于QuEChERS技术，建立了鸡肉组织中扎那米韦残留检测的超高效液相色谱-串联质谱法。该方法快速、简单、准确可靠，符合残留检测的要求，为鸡肉中扎那米韦的快速检测提供了简便的样品前处理方法和分析手段。

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Rapid Determination of Zanamivir Residues in Chicken Tissues Using QuEChERS Combined with Ultra-performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

REN Ming-xing1，LIU Zheng-cai2*，TANG Huan-yu2,YANG Fang2，LIN Yong-hui2，SU Zhi-jiao2,DONG Wen-hong1

(1.Shaoxing Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau,Shaoxing312000，China;2.Fujian Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau，Fuzhou350001，China )

A rapid method for the determination of zanamivir residues chicken tissues was developed using QuEChERS approach coupled with ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS).After ultrasonically extracted with(0.2 mol/L) hydrochloric acid-methanol(1∶9),the supernate was purified by QuEChERS method.The separation was performed on a NUCLEOSHELL®HILIC(3.0 mm×100 mm，2.7 μm) column by gradient elution using a mobile phase consisted of 5 mmol/L ammonium acetate(containing 0.2% formic acid) and acetonitrile.The identification of zanamivir was carried out by MS/MS in positive electrospray ionization(ESI+) and multiple-reaction monitoring(MRM) mode，and the quantification was performed by the external standard calibration method.The results showed that the calibration curves were linear in the range of 5-100 ng/mL with correlation coefficients(r) greater than 0.990.The limits of quantitation(LOQs，S/N=10) of this method were 10.0 μg/kg for the chicken muscle and liver.The average recoveries of zanamivir at three spiked levels of 10，20，100 μg/kg were in the range of 80.5%-88.7% with relative standard deviations(RSDs，n=6) of 7.3%-11.8%.The method was applied in the determination of zanamivir residues in practical chickens.The developed method is simple，accurate，rapid，sensitive and efficient,and could be applied in the determination of zanamivir residues in chicken tissues.

QuEChERS;ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS);zanamivir;residues;chicken tissues

2015-12-28；

2016-01-09

国家质检总局科技项目(2014IK110)

刘正才，高级工程师，研究方向：食品安全检测，Tel：0591-87065542，E-mail:54369174@qq.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.07.013

O657.63;TQ460.72

A

1004-4957(2016)07-0854-05