DART-Orbitrap质谱法对黄芩药材的快速分析

李乐乐 ，郭云龙 ，刘文龙 ，李　卓 ，王　洋 ，刘淑莹,3*

(1.长春中医药大学　吉林省人参科学研究院，吉林　长春　130117；2.长春中医药大学　附属医院，吉林　长春　130021；3.中国科学院　长春应用化学研究所，吉林　长春　130022)



DART-Orbitrap质谱法对黄芩药材的快速分析

李乐乐1，郭云龙1，刘文龙1，李卓2，王洋1，刘淑莹1,3*

(1.长春中医药大学吉林省人参科学研究院，吉林长春130117；2.长春中医药大学附属医院，吉林长春130021；3.中国科学院长春应用化学研究所，吉林长春130022)

将实时直接分析(DART)离子源与高分辨率质谱Orbitrap联用，建立了一种对黄芩药材进行快速定性定量分析的方法。定性分析时，对其中的化学成分进行标准品比对和二级质谱确证，同时参考相应文献进行确认。定量分析时，采用Full MS-SIM及Targeted-MS2扫描方式采集信号，Targeted-MS2扫描方式下分别对黄芩素和汉黄芩素的母离子和子离子的提取离子流图积分，通过峰面积计算含量。在黄芩药材中检出黄芩素、汉黄芩素、韧黄芩素Ⅱ、二羟基-二甲氧基黄酮、5，7，2′，5′-四羟基-8，6′-二甲氧基黄酮和SkullcapflavonⅡ的[M+H]+峰。定量分析结果显示，黄芩素(m/z271.06→ 123.01)的线性范围为49.7～447.3 ng，相关系数(r2)为0.995，平均加标回收率为87.0%；汉黄芩素(m/z285.07→270.05)的线性范围为50.0～350 ng，r2为0.995，平均加标回收率为66.0%。该方法可用于黄芩药材的快速定性检测和定量分析。

实时直接分析(DART)；Orbitrap质谱；黄芩；快速分析

黄芩是一种应用广泛的常用中药,中国药典规定的正品为唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根。现代医学证明黄芩具有清热解毒、抗炎、降压、减轻组织的缺血损伤、清除氧自由基、抗氧化、调节免疫等作用。药理研究表明,黄酮类化合物是黄芩的主要有效成分,在黄芩中已发现的41 种黄酮类化合物中,含量较高并具有明显药理作用的是黄芩苷(Baicalin)、黄芩素(Baicalein)、汉黄芩苷(Wogonoside)和汉黄芩素(Wogonin) 4种[1-2]。

2010版中国药典利用薄层色谱法以黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素为对照品对黄芩药材进行定性鉴别，利用高效液相色谱法测得黄芩苷含量作为定量依据。但薄层色谱法的操作较繁琐，有机溶剂消耗量大，高效液相色谱法则对实验条件要求较高，且色谱分离过程需花费大量时间。在传统中药材的质量控制中常选用一种或多种特定的化学成分作为定性定量分析标记物，筛选标记物的原则是选取含量较高且具有特定生物活性的成分[3-5]。然而，中药材化学成分高度复杂的特性增加了色谱分离时间并使得前处理更复杂，因此需要更加高通量的方法对中药材进行质量控制。

实时直接分析[6](Direct analysis in real time,DART)离子源是一种新型的敞开式大气压电离技术，在2005年由Cody等[7]首次提出，同年由JOEL和IonSense公司将其商业化。这种电离技术不需对样品进行复杂的前处理，能在数秒内分析存在于气体、液体、固体或材料表面的化合物，对样品消耗量较低，分析过程中无需大量的有机溶剂。DART可与多种质谱仪联用，如飞行时间质谱、四极杆质谱、离子阱质谱等，应用于食品安全、爆炸物的检测、药品非法添加等方面[7-8]。朱洪斌等[9]利用DART-MS建立了快速检测乌头炮制品有效成分的方法，但该方法在中药材快速定性和定量方面的应用特别是同时定性定量多种成分的研究相对较少[10]。本研究以黄芩为例，运用DART-Orbitrap质谱技术尝试建立了一种对含黄酮类成分中药材快速检测的方法。

1　实验部分

1.1主要仪器、材料与试剂

DART离子源(自动滑轨，十孔载样器，载样筛网)购于美国Ion Sense公司；Q-Exactive Orbitrap质谱仪(Xcaliber工作站)购于美国赛默飞世尔公司。

甲醇(分析纯，北京化工厂)；高纯氮气、氦气(纯度>99.999%，长春巨洋氧气厂)；黄芩素(北京北纳创联生物技术研究院，批号：130115)，汉黄芩素(北京北纳创联生物技术研究院，批号：130203)；黄芩药材由长春中医药大学中药鉴定实验室提供。

1.2检测条件

DART条件：参考本实验室前期工作[10-11]，选择离子化气体为氦气，待机气体为氮气，气体压力为0.5 MPa，气体温度为300 ℃，其他参数采用仪器默认设置。定性鉴别采用玻璃管蘸取样品进行检测，定量分析采用筛网方式进行检测，载样器滑动速度为0.2 mm/s，正离子模式采集。

Orbitrap质谱条件：扫描范围m/z50～750，分辨率为35 000，AGC Target 1×10-6(Automatic gain control)，正离子模式扫描，碎裂电压黄芩素为NCE 80、汉黄芩素为NCE 50。DART离子源与质谱入口之间的距离为1 cm。

1.3样品制备

分别配制0.994 mg/mL黄芩素标准品溶液与1 mg/mL汉黄芩素标准品溶液作为储备液。称取黄芩粉末0.5 g，置于5 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声提取40 min，用甲醇补足至刻度，取上清液作为供试品。定性检测时用熔点管蘸取样品进样，每次检测时间为6 s；定量检测时用移液枪吸取样品点在载样筛网上进行检测，滑动速度为0.2 mm/s，每个样品重复检测3次。

图1　黄芩素和汉黄芩素的离子强度随温度的变化曲线Fig.1　Signal intensities of baicalein and wogonin ion on different helium gas temperatures

2　结果与讨论

2.1载气温度的选择

以熔点管进样方式分别测试了100～450 ℃范围内(50 ℃为梯度)黄芩素与汉黄芩素的响应值与载气温度变化的关系(如图1)，测得最佳离子化温度为300 ℃[13]。在较低载气温度下两种待测组分的信号强度均很弱，黄芩素在200 ℃以下，汉黄芩素在100 ℃时几乎无响应信号，另据多篇文献报道，不同类别化学物亦出现此情况[5,13-14]。由于高温有利于待测物质去溶剂化并转移到气相中[7]，故在达到最大响应值前(黄芩素为400 ℃，汉黄芩素为300 ℃)信号强度随温度的增高而增强。然而过高的温度会使样品分解与碳化，因此出现信号强度值随温度升高而下降的区段。考虑到温度对各检测指标的影响，实验选定300 ℃为离子化温度。

2.2碎裂电压的选择

以熔点管进样方式分别优化黄芩素与汉黄芩素的碎裂电压(NCE，30～80 eV)，测得黄芩素和汉黄芩素的最佳碎裂电压分别为 80 eV和50 eV。在给定NCE电压(80 eV)条件下可观察到相对丰度较大的黄芩素(图2A)的[M+H]+m/z271.06 和子离子峰m/z123.01，而对于汉黄芩素(图2B)，高NCE电压下难以观察到其[M+H]+峰，故选用低于黄芩素的碎裂电压50 eV。

图2　黄芩素(A)和汉黄芩素(B)的串联质谱图Fig.2　DART tandem mass spectra of baicalein(A) and wogonin(B)

2.3定性检测

用熔点管蘸取黄芩提取液置于氦气流中，用Orbitrap 质谱采集信号(如图3A)。在质谱图中可以看到黄芩素的[M+H]+峰(m/z271.06)以及汉黄芩素的[M+H]+峰(m/z285.07)，此外还可观察到m/z301.07，315.08，347.07，375.10等特征峰。黄芩中主要含有黄酮类化合物[14]，通过对比发现，质子化的韧黄芩素Ⅱ、二羟基-二甲氧基黄酮、5，7，2′，5′-四羟基-8，6′-二甲氧基黄酮和黄芩新素Ⅱ的精确分子量与上述特征峰一致。 对黄芩素的[M+H]+离子(m/z271.06)和汉黄芩素的[M+H]+离子(m/z285.07)进行碎裂，结果如图2所示，利用串联质谱进一步对目标峰进行确定，增强了黄芩药材鉴别的准确性，因此可用上述6个特征峰结合黄芩素与汉黄芩素的串联质谱图对黄芩药材进行定性鉴别。另外，对黄芩药材进行直接检测，将黄芩饮片切开，切面置于离子化区域，按“1.2”条件进行一级质谱检测(图3B) 。对比黄芩提取液的质谱图(图3A)可以看出，上述6种特征峰均存在，在用黄芩药材直接检测时，信号强度降低，但对于药材的定性鉴别影响不大。实验结果表明DART-MS技术可对黄芩进行定性检测，与传统的薄层色谱方法相比，具有速度快、节省有机溶剂、无需样品前处理等优点。

图3　黄芩提取液(A)和黄芩药材(B)的DART-MS谱图Fig.3　DART mass spectra of extracted solution(A) and Scutellaria Radix medicinal material(B) of Scutellaria Radix

2.4定量检测

依据2010版《中国药典》对黄芩药材的规定，选取黄芩苷作为定量检测的指标。在本实验中难以检测到黄芩苷离子峰，可能是由于糖苷类化合物的挥发性较弱，在检测温度下无法使其转移到气相进入质谱被检测，这与前期研究结果相符[9]，所以选取黄芩素和汉黄芩素作为定量指标。采用Targeted-MS2扫描模式，分别对黄芩素(m/z271.06→123.01)和汉黄芩素(m/z285.07→270.05)的母离子与子离子的提取离子流图积分，通过峰面积计算含量。该方法对黄芩素和汉黄芩素的检出限(S/N=3)分别为0.497 ng和0.500 ng。

2.4.1线性关系精密吸取黄芩素对照品储备液适量，配成质量浓度为49.7 μg/mL的对照品溶液，分别吸取上述对照品1，2，3，4，5，6，7，8，9 μL，点样在筛网上，以载样器滑动速度为0.2 mm/s进行检测。以峰面积(Y)对标准品质量(X,ng)进行回归分析。结果表明，黄芩素在49.7～447.3 ng范围内线性关系良好，回归方程为Y=2.89×106X-1.43×108，r2=0.995。

精密吸取汉黄芩素对照品储备液适量，配成质量浓度为50 μg/mL的对照品溶液，同法测定并进行回归分析。结果表明，汉黄芩素在50.0～350 ng范围内线性关系良好，回归方程为Y=5.76×106X-1.20×107，r2=0.995。

2.4.2回收率取已测定含量的黄芩药材，按照“1.3”方法制备供试品溶液，分别吸取3 μL供试品溶液5份点样于载样筛网上，待溶剂挥干后再分别吸取3 μL浓度为49.7 μg/mL的黄芩素对照品溶液点样于载样筛网上，将筛网置于滑轨上按黄芩素检测条件进行检测。测定黄芩素的含量，计算得其加标回收率为82%～95%，平均加标回收率为87.0%，加标回收率结果良好。

另分别吸取3 μL供试品溶液5份点样于载样筛网上，待溶剂挥干后再分别吸取3 μL浓度为50 μg/mL的汉黄芩素对照品溶液点样于载样筛网上，将筛网置于滑轨上按汉黄芩素检测条件进行检测。测定汉黄芩素的含量，计算得其回收率为59%～72%，平均加标回收率为66.0%，加标回收率结果良好。

2.4.3精密度取黄芩素对照品溶液5 μL，点样至筛网上，按“1.2”条件进行检测，重复检测6次，以黄芩素母离子m/z271.06和子离子m/z123.01提取离子流图的峰面积计算[15]，相对标准偏差(RSD)为9.0%。以汉黄芩素母离子m/z285.07和子离子m/z270.05提取离子流图的峰面积计算，汉黄芩素的RSD为8.9%。表明仪器的精密度良好。

2.4.4重复性分别取5份供试品溶液各5 μL，点样至筛网上，按“1.2”条件进行检测。以黄芩素提取离子流图的峰面积计算RSD为12.3%，汉黄芩素提取离子流图的峰面积计算RSD为9.8%，表明该方法的重复性良好。

3　结　论

本实验采用DART离子源结合Orbitrap高分辨质谱对黄芩进行检测，建立了一种快速定性定量分析黄芩的方法。在定性鉴别时无需对样品进行前处理，直接将药材置于离子化区域，通过质谱信号的精确分子量进行定性鉴别。与传统的性状鉴别和显微鉴别等快速鉴别手段相比，DART-Orbitrap质谱法更加准确可靠，减少了人为因素对实验的干扰，多种成分同时检测提高了定性分析的准确性；定量分析结果表明，本方法具有良好的精密度，但准确度与HPLC法相比有一定差距。该方法适用于复杂基质条件下对中药的指标性成分进行快速分析，方法准确、快速、简便、绿色，可为中药材、饮片以及中成药的分析和质量控制提供方法参考。

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Rapid Analysis of Scutellaria Radix by Using DART Coupled with Orbitrap Mass Spectrometry

LI Le-le1，GUO Yun-long1，LIU Wen-long1，LI Zhuo2，WANG Yang1，LIU Shu-ying1,3*

(1.Jilin Ginseng Academy,Changchun University of Chinese Medicine,Changchun130117，China；2.The Affiliation Hospital to Changchun University of Chinese Medicine,Changchun130021，China；3.Changchun Institute of Applied Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Changchun130022，China)

A DART coupled with Orbitrap mass spectrometric method was developed for the qualitative and quantitative analyses ofscutellariaradix.The component was identified by comparing with standard component and the report of relative researches as well as the full scan spectra and secondary spectra.In quantitative analysis,the Full MS-SIM and Targeted-MS2mode was applied to obtain the mass spectrum,extract ion chromatography based on the parents ion and the product ion of baicalein(m/z271.06→123.01) and wogonin(m/z285.07→270.05) were used for quantitative analysis in the Targeted-MS2mode.The signals of baicalein,wogonin,SkullcapflavonⅡ and other components were observed in the mass spectra ofscutellariaradix.The linear ranges of baicalein and wogonin were 49.7-447.3 ng(r2=0.995) and 50.0-350 ng(r2=0.995),respectively.Their average recoveries were 87.0% and 66.0%,respectively.This method is suitable for the rapid analysis ofscutellariaradixand other traditional Chinese herbal medicines.

direct analysis in real time(DART); Orbitrap mass spectrometry;ScutellariaRadix; rapid analysis

2015-11-03；

2016-01-11

农业部公益性行业基金(201303111)

刘淑莹，博士，研究员，研究方向：有机质谱学，Tel:0431-86045155，E-mail:syliu@ciac.ac.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.07.014

O657.63; TQ460.72

A

1004-4957(2016)07-0859-05