适体荧光分析法检测养殖废水中四环素类抗生素

赵秋伶,张尤华,于晓艳

(辽宁工程技术大学　矿业技术学院，辽宁　葫芦岛　125105)



适体荧光分析法检测养殖废水中四环素类抗生素

赵秋伶*,张尤华,于晓艳

(辽宁工程技术大学矿业技术学院，辽宁葫芦岛125105)

建立了核酸适体识别-荧光探针技术检测养殖废水中土霉素、四环素、金霉素及强力霉素4种四环素类抗生素(TCs)总残留量的新方法。两段DNA对TCs共同识别后折叠成稳定的 “发卡型” 双链结构，核酸染料4′-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)能插入“发卡”部位产生荧光信号发射，据此可实现对TCs的定量检测。在最优实验条件下，以土霉素为目标分子建立工作曲线，在10～50 nmol/L范围内，荧光强度与对应浓度呈良好线性关系，土霉素的检出限为2.3 nmol/L。用四环素、土霉素、金霉素和强力霉素分别进行加标回收实验，平均回收率为88.5%～102.3%，相对标准偏差(n=5)为3.2%～6.7%。5个养殖场水样中均有TCs检出，检出量在7.6～42.7 nmol/L之间。该方法简单、灵敏、快速，可满足养殖场废水中TCs总残留量的测定要求。

核酸适体；荧光分析法；四环素类抗生素；快速检测；废水

四环素类抗生素(TCs)是由放线菌产生的一类广谱抗菌素，其结构中含有并四苯基本骨架，在酸性和碱性条件下均不稳定[1]。TCs主要品种有土霉素、四环素、金霉素、强力霉素等。TCs被广泛用作兽药，同时又作为一种生长促进剂被添加到饲料中用于畜牧业、渔业等[2]。TCs在畜禽体内难以被肠胃吸收，约 30%～90% 以母体化合物的形态排出，残留于粪便、尿液及养殖水体中，并进入土壤、地表水及地下水等环境受体中，给人类健康造成潜在危害[3]。我国TCs的用量每年达数千吨，滥用、违规使用和使用不当的情况非常严重。因此必须加强对食品和养殖业废水中TCs残留的检测和监测力度，发展快速灵敏的检测方法。

核酸适体是人工合成的单链寡核苷酸(DNA 或RNA)[4]，有化学抗体之称，并具有抗体所不具备的优点，如易合成，易引入修饰基团用于标记和固定化，具有高亲合力和良好的稳定性等[5-7]。适体作为新的识别元素极大地促进了生物传感器的发展。土霉素(OTC)的核酸适体已被成功筛选[8]，具有良好的特异性及亲和力，目前多种基于适体检测OTC 的方法已被报道，如电化学、纳米金、酶联等[9-11]。适体作为识别元素的传感器满足简便、快速、经济的要求，且灵敏度高、特异性好，尤其适合发展现场的实时检测[12-14]。适体传感器弥补了传统仪器分析法的不足，但仍存在缺陷，如适体检测OTC的传感体系是简单水样，直接应用于实际试样时仍存在困难。

2014年，Gu课题组[15]将76-碱基序列的 OTC 核酸适体优化成 8-碱基序列的短链核酸适体(5′-CGGTGGTG-3′)，基于金纳米粒子比色分析法检测 OTC 时，灵敏度提高了500倍，并且该核酸适体对四环素、金霉素和强力霉素均具有良好的亲和力。本研究以此核酸适体作为识别元素，建立了基于适体构象变化的荧光传感器，快速、灵敏检测了养殖废水中土霉素、四环素、金霉素和强力霉素的总残留量。本方法采用微孔板上固定的 DNA 识别目标分子，因识别和检测分开进行，有效地排除了试样中的荧光物质对检测信号的干扰，实现了复杂试样中TCs的荧光分析检测。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

黑色96 微孔板(康宁)；亲和素、牛血清白蛋白(BSA)及四环素、土霉素、金霉素、强力霉素均购于美国 Sigma 公司，土霉素、四环素、金霉素和强力霉素使用前以甲醇配成0.1 mmol/L的储备液；核酸外切酶Ⅰ(E.coliExonucleaseⅠ)购自大连宝生物工程有限公司；DNA(1)序列(5′-Biotin-TTAAAGGTG-3′)，DNA(2)序列(5′-CGGTTTTA-3′)均由上海生工生物工程公司合成，经HPLC纯化后，用超纯水配成100 μmol/L储备液；缓冲溶液(碳酸盐缓冲液：0.5 mol/L，pH 9.0；PBS缓冲液：0.1 mol/L，pH 7.4；PBST缓冲液：0.1 mol/L，pH 7.4，含2 mmol/L MgCl2和0.12% Tween 20；结合缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6，含100 mmol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，5 mmol/L KCl，1 mmol/L CaCl2，0.02% Tween 20)；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，1 mg/mL，乙醇)购自美国Invitrogen 公司，使用前以结合缓冲液稀释100倍；养殖废水采自锦州北镇的规模化养殖场；其它试剂为分析纯。实验用水为超纯水(Milli-Q制备,18.2 MΩ·cm)。

1.2实验方法

1.2.1微孔板包被亲和素亲和素用碳酸盐缓冲液稀释至适当浓度,每孔包被100 μL，4 ℃反应12 h后,用PBST缓冲溶液清洗数次，每次5 min，拍干。最后用1% BSA 封闭孔板，反应1 h后，用PBST洗涤3次。

1.2.2DNA固定至微孔板实验在PBS缓冲液中进行，首先向PBS中加入检测DNA(1)，配成合适浓度。亲和素包被的微孔板凹槽用200 μL PBST洗涤3次，每次5 min。然后在微孔板的每个凹槽中加入100 μL DNA(1)，置于37 ℃摇床反应2 h。将DNA(1)的5′端是生物素标签，通过生物素与亲和素的特异相互作用，将DNA(1)固定到亲和素包被的微孔板的凹槽。凹槽用200 μL PBST洗涤3次，每次 5 min，以去除未反应或吸附的DNA。然后加1% BSA做封闭反应，反应1 h，反应完毕用PBST洗涤3次。检测DNA(1)包被的微孔板立即用于下步反应。

1.2.3识别反应与工作曲线的建立OTC标准溶液用结合缓冲液稀释成系列浓度，分别加入到包被了检测DNA(1)的微孔板中,每孔100 μL，同时加入DNA(2)，保证其浓度相对于DNA(1)略过量，室温孵育40 min，DNA(1)和DNA(2)与OTC充分反应。在反应液中加入1.0 μL核酸外切酶Ⅰ(Exo Ⅰ，5 U/μL)和11 μL 10×Exo Ⅰ缓冲液，37 ℃孵育30 min，未与OTC作用的DNA(1)和DNA(2)被Exo Ⅰ水解，反应完毕，倒掉反应液，用200 μL PBST缓冲液洗涤3次，每次5 min。然后在微孔板凹槽中加入100 μL 适当浓度的核酸染料(DAPI)，室温孵育10 min。用酶标仪测定荧光光谱。DAPI的激发和发射波长分别为358 nm和461 nm。未加入OTC前,测得荧光强度为IF0；加入OTC后,测得荧光强度为IF，以IF定量分析OTC浓度，并绘制工作曲线。

1.2.4加标回收实验将4 ℃保存的自家养鱼废水离心取上清液，向样品中分别添加10.0，30.0 nmol/L的四环素、土霉素、金霉素和强力霉素标准液，室温下放置过夜后，再次离心，取上清液。用建立的方法检测荧光强度，根据工作曲线计算回收量，同时计算回收率及相对标准偏差。

1.2.5养殖场废水中TCs总残留的检测取锦州北镇规模化养殖场的养殖废水，离心取上清液，用建立的方法检测荧光强度，再根据工作曲线计算检出量。

2　结果与讨论

2.1实验原理

自动化系统的主要功能为：数据采集、传输和处理。通过端站的传感器和执行端完成数据的采集和命令执行；各站的数据通信设备完成数据传输任务；最后由监控中心站的微机系统完成数据处理工作，包括数据识别、校验、存贮和分析，并将处理后的数据和结果进行显示、存储和打印。

实验原理如图1 所示，黑色微孔板上固定的DNA(1)序列(5′-Biotin-TTAAAGGTG-3′)经专门设计,其5′端带有生物素标签，通过生物素与亲和素的特异相互作用，被固定到亲和素包被的微孔板上。DNA(2)序列(5′-CGGTTTTA-3′)也经专门设计。DNA(2)中的TTTA和DNA(1)中的TAAA反向互补，在溶液中存在平衡反应。DNA(2)和DNA(1)的粗体序列合在一起为TCs的核酸适体，识别TCs后DNA(2)和DNA(1)发生构象转换并形成稳定的“发卡型”双链结构(图中DNA-TCs)，不再被外切核酸酶Ⅰ(Exo Ⅰ)水解，核酸染料DAPI插入双链的小沟中间，产生荧光信号发射；无TCs时，微孔板上固定的DNA(1)和游离的DNA(2)被Exo Ⅰ剪切，“发卡型”双链结构不存在，DAPI无法插入，无荧光信号发射。Exo Ⅰ是单链特异性3′→5′核酸外切酶，可特异性地提高检测信号，同时降低背景及噪音信号，提高分析的灵敏度。由于本研究检测的是成分复杂并发射一定强度荧光信号的养殖废水体系[16],将DNA(1)固定到微孔板后，能实现高效快速分离，有效去除非特异性干扰，进而试样中的复杂成分及荧光成分对检测信号均不产生影响，提高了检测灵敏度。

图1　传感器的原理图Fig.1　Schematic illustration of the sensor

2.2实验条件的优化

2.2.1微孔板包被亲和素浓度的优化生物素DNA通过与包被于微孔板上的亲和素之间的特异性结合固定于微孔板上，适合的亲和素包被浓度是实验成功的基础。考察了亲和素包被浓度分别为10，20，30，40，50，60，70 mg/L时,包被前后溶液在280 nm处吸光度值的减少量ΔA(ΔA=A1-A2)(A1为包被前，A2为包被后)。结果显示,在亲和素包被浓度为50 mg/L时,吸光度值减少最为明显,表明此时微孔板已被亲和素饱和。因此,亲和素包被浓度采用50 mg/L。

2.2.2DNA(1)包被浓度的优化固定亲和素包被浓度为50 mg/L，在过量DNA(2)存在时，考察了浓度分别为20，30，40，50，60，70 nmol/L 的DNA(1)包被微孔板后，与500 nmol/L的OTC发生识别反应后的荧光强度。结果显示，DNA(1)包被浓度为40 nmol/L时，461 nm波长处的荧光强度最大，表明此时微孔板包被的DNA(1)最多。因此，选择DNA(1)包被浓度为40 nmol/L。

2.2.3DAPI用量的优化固定亲和素包被浓度为50 mg/L，DNA(1)包被浓度为40 nmol/L，在过量DNA(2)存在时，与500 nmol/L的 OTC 发生识别反应形成“发卡型”双链结构后，分别与不同浓度DAPI(0.01，0.1，10，50 μmol/L)孵育10 min，测定荧光强度。结果显示 DAPI 浓度为 10 μmol/L时,461 nm波长处的荧光强度最大，此后随着DAPI 浓度增加荧光强度不再增加，说明此时反应已饱和。因此，DAPI 浓度采用 10 μmol/L。

2.2.4Exo Ⅰ用量的优化当 DNA(1)包被浓度为40 nmol/L，DNA(2)浓度为40 nmol/L时，未做识别反应，DNA(1)和DNA(2)直接被Exo Ⅰ水解，考察了 Exo Ⅰ 用量分别为0.5，0.8，1.0，1.2，1.5，1.8 μL(5 U/μL)时，检测体系在461 nm处的荧光强度。结果显示：随着Exo Ⅰ用量的增加，体系荧光强度降低，当Exo Ⅰ用量增至1.0 μL时，体系荧光强度降至最低，说明此时 Exo Ⅰ 用量已足够。因此，本实验选择 Exo Ⅰ 的用量为1.0 μL。

图2　DNA传感器与不同浓度的OTC作用后的荧光光谱Fig.2　Fluorescence spectra of DNA sensing system in presence of various concentrations of OTC concentrations of OTC(from a to j):0,10,15,20, 30,40,50,100,200,500 nmol/L； λex=358 nm,λem=461 nm

图3　461 nm处的荧光强度与OTC浓度的关系曲线Fig.3　Linear relationship between fluorescence intensity in 461 nm and OTC concentration

2.3线性范围与检出限

在最佳实验条件下，测定不同浓度OTC与适体传感器作用后的荧光光谱。结果如图2 所示，随着OTC浓度的增加，461 nm处的荧光强度逐渐增大。根据461 nm处的光谱数据绘制出荧光强度与OTC浓度的关系曲线(图3)。结果显示，在10～500 nmol/L范围内，随着体系中OTC 浓度的逐渐增加，溶液的荧光强度迅速增大，之后趋于缓慢。在10～50 nmol/L 范围内，体系的荧光强度(IF)与 OTC 浓度(c,nmol/L)呈良好的线性关系(图3插图)，回归方程为IF=1 603c+3 593，相关系数(r)为0.985 6，检出限(3σ/n)达2.3 nmol/L。

考察了10～50 nmol/L浓度范围内，其它四环素体系荧光强度与其浓度的关系。实验结果表明：在相同条件下，用上述建立的方法测定四环素、金霉素和强力霉素时，在10～50 nmol/L 范围内，体系的荧光强度与浓度也呈良好的线性关系，线性方程分别为IF=1 579c+3 586，IF=1 586c+3 574和IF=1 629c+3 591，检出限分别为 2.1，3.2，3.6 nmol/L。由于4种化合物的线性方程相似，为了简化处理，后续实验以土霉素为目标分子建立的标准曲线为工作曲线，近似验证该方法的适用性。

2.4回收实验

选择自家养鱼废水进行加标回收实验，加标水平分别为10，30 nmol/L，四环素、土霉素、金霉素和强力霉素的回收率和相对标准偏差见表1。4种目标分析物的平均回收率为88.5%～102.3%，相对标准偏差(n=5)为3.2%～6.7%。表明本方法的准确度和灵敏度良好。同时养殖废水中加标回收实验结果与纯水中的加标回收数据一致,说明养殖废水中可能出现的复杂成分(钠、钾、氯、硫酸盐、磷酸盐、铵盐、钙离子等无机物质；尿素、尿激酶、表皮生长因子、生长激素等有机物质[16])对TCs的检测无影响，表明该方法对TCs的检测具有良好的特异性。

表1　回收率实验结果(n=5)

2.5实际样本的检测

应用本方法检测锦州北镇5个规模化养殖场(1#，2# 和3# 是养猪场,4# 和5# 是养鸡场)采集的废水，结果均检出四环素类抗生素残留，总残留浓度为7.6～42.7 nmol/L。

3　结　论

基于核酸适体构象变化及 Exo Ⅰ 辅助的信号放大策略，构建了适体荧光传感器用于TCs总残留的检测。在优化实验条件下，荧光强度与TCs浓度在10～50 nmol/L范围内呈良好的线性关系，检出限不高于3.6 nmol/L。该方法简单，结果准确，可满足养殖场废水中TCs总残留量的测定，同时满足大批量样品和现场快速检测的要求。适体构象变化形成“发卡”结构的结合模式也为其它物质的检测和传感器的设计提供了新思路。

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Detection of Tetracycline Antibiotics in Aquaculture Wastewaterby DNA-based Fluorescence Assay

ZHAO Qiu-ling*,ZHANG You-hua,YU Xiao-yan

(College of Mining Industry Technology，Liaoning Technical University，Huludao125105，China)

A novel analysis method based on specific recognition of aptamer and fluorescence probe technique was established for the detection of total residues of tetracycline antibiotics(TCs)，including oxytetracycline,tetracycline,chlortetracycline and doxycycline etc.in aquaculture wastewater.Two segments of DNAs work together to identify TCs to fold into a stable “hairpin” double chain structure that can be inserted by nucleic acid dye DAPI to generate of fluorescence emission.Based on this,TCs can be quantified.Under the optimal experimental conditions,the working curve was established with oxytetracycline as target molecule,the fluorescence intensity showed a good linear relationship with concentration of oxytetracycline in the range of 10-50 nmol/L,and the detection limit of oxytetracycline was 2.3 nmol/L.When having oxytetracycline,tetracycline,chlortetracycline and doxycycline as additives,the average recoveries ranged from 88.5% to 102.3%,with relative standard deviations(n=5) of 3.2%-6.7%.The method is simple,sensitive and rapid,and could satisfy the requirements for determination of total TCs residues in the farm wastewater.

aptamer；fluorescence analysis；tetracyclines；rapid detection；wastewater

2016-01-31；

2016-02-18

国家自然科学基金资助项目(21506087)

赵秋伶，博士，讲师，研究方向：化学生物学与食品安全分析，Tel:0429-5310568，E-mail:flyzhql@iccas.ac.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.07.016

O657.6；R978.1

A

1004-4957(2016)07-0869-05