气相色谱-质谱联用法结合保留指数对高良姜挥发油成分的分析

袁　源，周　伟，付云飞，林丽静，黄晓兵，李积华

(1.中国热带农业科学院　农产品加工研究所，广东　湛江　524001；2.农业部热带作物产品加工重点开放实验室，广东　湛江　524001)



气相色谱-质谱联用法结合保留指数对高良姜挥发油成分的分析

袁源，周伟*，付云飞，林丽静，黄晓兵，李积华

(1.中国热带农业科学院农产品加工研究所，广东湛江524001；2.农业部热带作物产品加工重点开放实验室，广东湛江524001)

采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)法结合保留指数(RI)对高良姜水蒸气蒸馏法(SD)、超声波辅助溶剂提取法(UAE)和亚临界流体萃取法(SFE)所制备的挥发油进行分析，分别鉴定出51，46和60个挥发性组分，并通过峰面积归一化法确定各组分的相对含量。结果表明，高良姜挥发油的指标性成分1,8-桉叶素含量的大小顺序为SD法≈SFE法>UAE法，UAE法虽耗时少、能耗低，但由于所用有机溶剂难去除，所得挥发油品质较差。SFE法可得到部分SD法无法得到的化合物，如2-羟基-1,8-桉叶素、二苯基庚烷类等。另外β-石竹烯、α-石竹烯、α-法尼烯、γ-杜松烯等高沸点组分比例，SFE法所得高于另两种方法；α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、柠檬烯、樟脑和α-松油醇等低沸点组分比例，SD法所得最高。同一批药材不同提取方法所得的挥发油成分大部分相似，但部分成分与组分比例因不同提取方法的原理存在差异，实际生产中可根据功效需求选择不同提取方法加以开发利用。

挥发油；气相色谱-质谱联用(GC-MS)；水蒸气蒸馏法；超声波辅助溶剂提取法；亚临界流体萃取法

由于精油组分非常复杂，无法采用标准物质逐个组分进行对比鉴定，而且不同气相色谱-质谱联用仪器的性能和分离柱柱效存在差异，组分分离效果不同，对质谱产生许多干扰因素。因此，单纯选用质谱检索高匹配度化学结构来确定相应峰的组分存在很大的不确定性。Kovats保留指数(Kvoats' retention index,简称RI)是化学物质在相应类型分离柱中对应正烷烃的一种比较稳定的性质。只要用于分离的色谱柱性质相同，气相色谱条件相近，同种组分在不同仪器上所计算出的RI值通常为常数。因此，同时考虑分离峰的质谱匹配度和RI匹配度可大大提高鉴定结果的准确性。在芳香精油复杂组分鉴定中，该方法在国际上得到普遍认可并大量使用[1-2]。

高良姜，别名高凉姜、良姜、蛮姜和佛手根等，为姜科山姜属多年生草本植物高良姜(AlpiniaofficinarumHance)的根茎，主产于广东湛江的徐闻等县市[3]，目前主要来源为人工栽培。其药用历史悠久，历代本草均有记载，始载于《名医别录》，列为中品；历版《中国药典》均有收载，为“十大广药”之一[4]。高良姜有镇痛、抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗腹泻等功效[5]，其主要有效成分为黄酮类及挥发油成分。作为辛温类药材，挥发油是判断其质量优劣的指标之一。水蒸气蒸馏法是挥发油类成分提取的传统方法，以往的高良姜挥发油研究主要采用该方法提取[6-7]。然而该方法加热时间长，温度高，与水共煮或水上蒸馏无法避免某些热敏性成分热分解与易水解成分水解的问题。因此，近年有超临界CO2流体萃取法、溶剂提取法和超声波提取法应用于高良姜挥发油提取的相关报道[8-9]。由于超临界CO2流体萃取法操作压力普遍大于25 MPa，极高压力限制了设备有效容积的放大，同时较高的设备制造和运行成本制约了该技术在生产中的应用，亚临界流体萃取法应运而生。

亚临界流体萃取法(Subcritical fluid extraction，SFE)是以亚临界状态的流体(高于沸点，但在临界温度和压力下，以流体形式存在的复合溶液)为溶媒，在低温低压状态下提取目标组分的一种新技术，其保留了超临界CO2流体萃取法效率高、活性成分不易破坏、无杂质、无溶剂残留和环保的优点，同时克服了其成本高、不易开展工业化生产等不足[10]。随着亚临界流体萃取技术的发展，萃取剂的使用正朝着无毒安全方向发展[11]。

不同的提取方法，由于原理与工艺不同，得到的高良姜挥发油之成分组成与比例可能也存在较大差异。因此，为了全面客观地评价不同方法对高良姜挥发油提取的适用性和实用性，本研究对水蒸气蒸馏法(SD)、超声波辅助溶剂提取法(UAE)以及亚临界流体萃取法(SFE)所提取的高良姜挥发油进行对比研究，旨在较系统地认识这些方法，为实际生产中科学选取提取工艺提供借鉴。

1　实验部分

1.1实验材料

高良姜由广东丰硒良姜有限公司(湛江徐闻)从原产地徐闻收集采购，经除杂、洗净、干燥、粉碎后备用。原植物标本经中国热带农业科学院农产品加工研究所林丽静副研究员鉴定为高良姜AlpiniaofficinarumHance。

1.2仪器与试剂

Shimadzu QP2010-Plus气相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司)，HAS-2000超声波清洗机(深圳好顺超声设备有限公司)，Heidolph LR4002旋转蒸发仪(德国海道尔夫公司)，CBE-5L亚临界流体萃取设备(河南省亚临界生物技术有限公司)。

正构烷烃标准品：C7～C30，部分标准品(德国Sigma公司)；其它试剂：除甲醇、正己烷为色谱纯外，其余皆为分析纯。

1.3高良姜挥发油的提取

1.3.1水蒸气蒸馏法取上述药材粉末500 g，按2010年版中国药典一部附录XD挥发油测定法中的甲法制备挥发油。

1.3.2超声波辅助溶剂提取法取上述药材粉末500 g，加入500 mL石油醚(30～60 ℃)提取剂，超声功率360 W，提取温度40 ℃，提取2次，每次20 min。合并两次滤液，置于旋转蒸发仪中低温(35 ℃)浓缩至2 mL。

1.3.3亚临界流体萃取法取上述药材粉末500 g，装入特制的提取袋后，投入亚临界萃取釜中。在温度45 ℃，压力0.8 MPa下通入亚临界流体丁烷，对样品逆流萃取3次，每次60 min，待亚临界流体回收干净后得粗制品。

1.4高良姜挥发油的供试品制备

1.4.1水蒸气蒸馏法供试品制备将“1.3.1”蒸馏所得挥发油加入约1 g无水硫酸钠，取上清液以甲醇稀释40倍至2 mL样品瓶中制备供试品溶液。

1.4.2超声波辅助溶剂提取法供试品制备将“1.3.2”提取所得挥发油经旋蒸处理至2 mL样品瓶中制备供试品溶液。

1.4.3亚临界流体萃取法供试品制备将“1.3.3”萃取所得粗制品添加1∶1正己烷和1%活性炭萃取脱色，取上层溶液以正己烷稀释4倍至2 mL样品瓶中制备供试品溶液。

1.5GC-MS分析条件

色谱条件：色谱柱：Rtx®-5 ms毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，日本岛津公司)；程序升温：起始温度60 ℃，保持6 min，以10 ℃/min升至160 ℃，保持5 min，再以20 ℃/min升至240 ℃，保持5 min；载气(He)流速1.6 mL/min；压力100.0 kPa；分流比30∶1；进样温度250 ℃；进样量1 μL。

质谱条件：电子轰击(EI)离子源；离子源温度230 ℃；接口温度250 ℃；溶剂延迟2.5 min；数据采集方式Scan；质量扫描范围m/z40～450；检测器增益电压1.18 kV。

1.6RI值的测定

2　结果与讨论

2.1不同提取方法的提取率与所得挥发油的感官评价

表1为不同提取方法制备高良姜挥发油的提取率与感官评价。由表1可知，虽然不同提取方法的提取率差别很大，但根据GC-MS检测结果可知，3种方法所得的挥发油量与提取率并非呈正比例关系。这可能是由于UAE法通过旋蒸浓缩挥发油，使部分挥发油随石油醚同时被蒸出，导致其含量降低。另外SFE法通过相似相溶的萃取原理可得到大量植物油脂等低极性粗制品，因其含有部分易水解及热敏性物质，精制后挥发油含量较传统SD法高。

表1　不同提取方法制备高良姜挥发油的提取率与感官评价

2.2GC-MS检测

将按“1.5”条件分析所得各组分峰用NIST Chemical Structures(美国国家标准研究所，第八版)库和Wiley Library(威廉图谱库，第九版)库进行检索，结合文献RI值，以质谱匹配度和RI值匹配度最高的化学结构为最佳鉴定结果，部分主要成分利用标准品(STD)进一步确认，可信度更高。各组分峰相对含量的确定采用峰面积归一化法。所得结果列于表2。

表2　不同提取方法所得高良姜挥发性成分的分析及鉴定结果

(续表2)

*:no data

由表2可见，不同方法提取得到的高良姜挥发油中分离鉴定出61种挥发性化合物，SD法检出物占总量的99.85%，UAE法检出物占总量的85.98%(其余为石油醚中挥发性烷烃成分)，SFE法检出物占总量的97.14%(其余为植物油脂)，检出物主要由萜烯类、酯类、酮类、醇类及其含氧衍生物组成。结果表明，1,8-桉叶素为高良姜挥发油中的主要成分，与文献报道一致[6-8]。

经MS分析鉴定、RI值验证和STD确定后，不同提取方法对高良姜挥发油成分组成有一定影响。与传统SD法需长时间与水共煮或者水上加热相比，UAE法和SFE法所需温度不超过45 ℃且提取体系不含水，因此可得到部分高温或与水蒸馏无法得到的化合物，如2-羟基-1,8-桉叶素、β-人参烯、α-摩勒醇、α-杜松醇等。其中2-羟基-1,8-桉叶素是一种羟基功能化的1,8-桉叶素，与1,8-桉叶素的分子结构相似，仅多1个羟基官能团，因此二者活性与气味相似；因其多了羟基官能团，抑菌活性与芳香气味较1,8-桉叶素更佳[12]。同时该化合物因具有羟基，极易溶于水，在高温下易脱水分解，因此在SD法所得的挥发油中无法检出该化合物[13]。

SFE法因萃取剂呈亚临界流体状态，因此得到部分独有的化合物，如β-榄香烯、1,7-二(3,4-二羟基苯基)-4-烯-3-庚酮、环状异长叶烯、β-桉叶油醇、α-红没药醇、5-羟基-1,7-二苯基-3-庚酮。其中1,7-二(3,4-二羟基苯基)-4-烯-3-庚酮和5-羟基-1,7-二苯基-3-庚酮是一类被称为二苯基庚烷类的化合物，该类化合物主要存在于姜科植物中，目前已发现此类化合物具有多种生物学和药理学活性，包括抗氧化、治疗神经损伤、抗肝毒性、抗炎、抗增殖、止吐、抗肿瘤等[14]。二苯基庚烷类化合物是一类低极性化合物，具有低挥发性和热不稳定性[15]，传统常规的提取方法无法得到该类化合物。

经峰面积归一化法测得3种萃取方法中各组分的比例存在较大差异。其指标性成分l,8-桉叶素的含量分别为SD法(21.59%)，UAE法(36.53%)，SFE(10.29%)，但由于所得挥发油含量不同，经修正后(表1)，所得1,8-桉叶素含量的大小顺序为SD法≈SFE法>UAE法。由此可见，UAE法虽耗时少、能耗低，但由于所使用的有机溶剂难去除，所得挥发油品质较差。此外，文献[6，8]中述及高良姜挥发油均含有的成分：β-石竹烯、α-石竹烯、α-法尼烯、γ-杜松烯等高沸点组分的比例，SFE所得比例高于另两种方法；α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、柠檬烯、樟脑、α-松油醇等低沸点组分比例，SD法所得更高。这可能与SD法加热时间长，难挥发的高沸点组分在长时间蒸煮下容易受到破坏的原因有关。

3　结　论

本研究通过GC-MS联用结合保留指数对高良姜经3种不同提取原理制备的挥发油成分进行分析，发现同一批药材不同方法提取所得的挥发油成分大部分相似，但部分成分与组分比例因不同的提取原理存在差异。

挥发油具有辅助药物透皮吸收的作用，是衡量中药质量和疗效的指标之一。高良姜药材中挥发油的含量较高，辛香气味是判断其药材质量优劣的一个指标。本研究发现其指标性成分l,8-桉叶素在3种提取方法中的含量为SD法≈SFE法>UAE法；其中活性更强的2-羟基-1,8-桉叶素因选用了非热提取方法得以报道。SFE法所得的二苯基庚烷类物质为另两种方法所不能得，因此SFE法可在某些生产需要中代替传统SD法。由于不同提取方法所得的高良姜挥发性成分具有多样性，高良姜产业化中各产品应根据具体的实际功效需求选择不同提取方法加以开发利用。

[1]Zhu J X,He W,Ma J C.FoodandDrug(朱家校,何伟,马建春.食品与药品),2009,11(9):68-70.

[2]Zhong R M,Zeng Q X,Zhang Z M,Wang Y M,Peng H G.J.Instrum.Anal.(钟瑞敏,曾庆孝,张振明,王羽梅,彭华贵.分析测试学报),2006,25(5):16-20.

[3]Gao Z R,Yin G Y,Lu Y L,Li L X,Shi H L.J.AnhuiAgric.Sci.(高则睿,阴耕云,芦燕玲,李亮星,施红林.安徽农业科学),2012,40(24):12247-12249.

[4]Ly T N,Yamauchi R,Kato K.FoodSci.Technol.Res.,2001,7(4):303-306.

[5]Lai Z P，Cheng X X,Yang Q,Chen H B,Nan H J.Asia-PacificTradit.Med.(赖展鹏,程轩轩,杨全,陈虎彪,南海军.亚太传统医药),2010,6(9):6-8.

[6]Zhou X,Guo X L,Feng Y F.Chin.Tradit.HerbalDrugs(周漩,郭晓玲,冯毅凡.中草药),2006,37(1):33-34.[7]Wang P,Chen X L,Li L,Liu N J.Chin.Tradit.PatentMed.(王平,陈锡林,李丽,柳能军.中成药),2004,26(6):440-443.

[8]Yang Q,Yan H J,Pang Y X,Lu M M,Tang X M,Cheng X X,Zhang C R,Teng X F.J.GuangdongPharm.Univ.(杨全,严寒静,庞玉新,鲁明明,唐晓敏,程轩轩,张春荣,滕希峰.广东药学院学报),2012,28(4):382-386.

[9]Barton A F,Dell B,Knight A R.J.Agric.FoodChem.,2010,58(18):10147-10155.

[10]Ma Q C,Jia K,Lu J,Wang L,Han Y Q,Xue C H.Sci.Technol.FoodInd.(马勤川,贾凯,卢杰,王兰,韩玉谦,薛长湖.食品工业科技),2012,33(13):197-200.

[11]Wan C J,Huang F H,Zhang M,Li W L,Huang Q D.Trans.Chin.Soc.Agric.Eng.(万楚筠,黄凤洪,张明,李文林,黄庆德.农业工程学报),2014,30(21):324-331.

[12]Sun Y,Tabata K,Matsubara H,Kitanaka S,Suzuki T,Yasukawa K.PlantaMed.,2008,74(4):427-431.

[13]Zhao Z Y,Jiang S F,Huang D Z,Zhu S J.Chem.Bioeng.(赵志勇,蒋少芳,黄道战,朱守记.化学与生物工程),2014,31(10):29-31.

[14]An N,Zou Z M,Tian Z,Luo X Z,Yang S L,Xu L Z.Fitoterapia,2008,79(1):27-31.

[15]Li J,Sun J X,Yu H Y,Chen Z Y,Zhao X Y,Ruan H L.Chin.Chem.Lett.,2013,14(6):521-523.

Analysis of Volatile Oils in Rhizoma Alpiniae Officinarum by GC-MS and Retention Index

YUAN Yuan,ZHOU Wei*，FU Yun-fei，LIN Li-jing，HUANG Xiao-bing，LI Ji-hua

(1.Agricultural Product Processing Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Zhanjiang524001,China；2.Key Laboratory of Ministry of Agriculture for Tropical Crop Processing,Zhanjiang524001,China)

A gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS) combined with retention index(RI) method was developed for the analysis of volatile oils inRhizomaAlpiniaeOfficinarum extracted by steam distillation(SD),ultrasonic assisted solvent extraction(UAE) and subcritical fluid extraction(SFE).51,46 and 60 volatile components in the oils extracted by the three above-mentioned methods were identified,respectively.Meanwhile,each of them was quantified by area normalization method.The results indicated that the content of the index constituent,i.e.,1,8-cineole,the content by SD was similar to that by SFE,and higher than that by UAE.Although UAE was time-saving and less energy consumption,the oil quality was poorer due to the use of organic solvents hard to remove.In addition,some constituents could be gained by SFE but not by SD,such as 2-hydroxycineole,diarylheptanoids and etc.On one hand,the relative contents of high boiling components obtained by SFE,likeβ-caryophyllene,α-caryophyllene,α-farnesene andγ-cadinene,were higher than the others.On another hand,the relative contents of low boiling components obtained by SD,likeα-pinene,camphene,β-pinene,limonene,camphor andα-terpineol,were the highest of three.In conclusion,volatile oil components by different extraction methods from the same batch of materials were proved broadly similar,but there were some differences in composition and component ratio.Therefore,development and utilization of different extraction methods must be selected according to the functional requirements of products.

volatile oil;gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)；steam distillation；ultrasonic assisted solvent extraction；subcritical fluid extraction

2015-10-28；

2015-12-10

海南省自然科学基金(20153054)；广东省湛江市科技计划项目(2014C1005)

周伟,硕士，助理研究员，研究方向：热带作物的应用基础，Tel:0759-2221090，E-mail:1274044249@qq.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.010

O657.63;TQ460.72

A

1004-4957(2016)06-0692-06