基于金银纳米立方体构建高灵敏CA-153传感器的研究

贾翠娟，张思宝，杜璋璋

(1.济宁职业技术学院　生物与化学工程系,山东　济宁　272037；2.山东化工研究院，山东　济南　250014)



基于金银纳米立方体构建高灵敏CA-153传感器的研究

贾翠娟1*，张思宝2，杜璋璋1

(1.济宁职业技术学院生物与化学工程系,山东济宁272037；2.山东化工研究院，山东济南250014)

癌抗原-153(CA-153)是乳腺癌最重要的特异性标志物。利用CA-153与其抗体之间的特异性识别性构建“三明治”夹心结构的免疫传感器，在玻碳电极上修饰金纳米/氧化石墨烯复合材料，通过纳米金和CA-153抗体之间的吸附作用，将抗体固定于电极表面，以牛血清白蛋白封闭非特异性吸附位点。金银(AuAg)纳米立方体标记CA-153二抗，标记的AuAg纳米立方体催化过氧化氢氧化电子媒介体硫堇，采用差分脉冲伏安法检测CA-153的电化学信号。在最优条件下，此传感器的响应电流与CA-153浓度的对数在2.0×10-5～100 U/mL范围内呈良好的线性关系，检出限(S/N=3)为7.0×10-6U/mL。对实际血清样品进行加标回收实验，回收率为92.2%～110.2%，相对标准偏差不大于8.7%。

电化学免疫传感器；AuAg纳米材料；金纳米/氧化石墨烯复合材料；癌抗原-153

癌抗原-153(CA-153)是临床检查乳腺癌最重要的特异性标志物[1-2]。乳腺癌患者初期约有60%的血清CA-153水平明显升高，而转移性乳腺癌患者可达80%，CA-153是乳腺癌辅助诊断指标，也是复发和转移的重要信号，因此对于CA-153的高选择性和高灵敏性检测在医学诊断领域具有重要意义[3-4]。目前对CA-153的检测多采用辣根过氧化物酶作标记物研制电化学传感器[5-6]，建立化学发光酶联免疫传感器[7-9]、表面等离子体共振生物传感器[8]等免疫分析方法。电化学免疫传感器具有选择性好、灵敏性高、操作简单、线性范围较宽[10-11]等特点，但其灵敏度依靠生物分子固定和信号放大来提高[12]，但化学发光酶联免疫传感器和表面等离子体共振生物传感器的制备复杂且成本高，酶易失活，影响传感器的寿命，在实际应用时测定结果的准确性受到限制[13-14]。

纳米材料与辣根过氧化物酶相比具有易制备、成本低、易保存、易修饰和标记[15-16]等优越性。复合纳米材料具有不同于单组分纳米材料的独特的光、电和催化等性质，已成为当前纳米材料科学研究领域中的前沿和热点[17-18]。金属复合纳米粒子比单组分粒子的催化性能更优越，采用金属复合材料[19-20]固定生物分子，可实现高灵敏、快速的电化学检测。

本文利用金银立方体纳米材料作为标记物构建了电化学免疫传感器，用于乳腺癌标志物CA-153的高灵敏、快速检测。将CA-153抗体固定于AuNPs/GO/GCE传感界面，CA-153 抗原被捕获，与标记金银立方体纳米材料的CA-153抗体结合，制备夹心型的电化学免疫传感器。金银立方体纳米材料催化H2O2对电子酶介体硫堇氧化反应，产生电流信号，该电流信号与CA-153浓度的对数成正比，据此实现了CA-153的定量检测。

1　实验部分

1.1试剂与仪器

癌抗原153(CA-153)、癌抗原125(CA-125)、癌抗原199(CA-199)、癌胚抗原(CEA)、单克隆抗体CA-153(捕获抗体Ab1，标记抗体Ab2)、α-甲胎蛋白(AFP)和人绒毛促性腺激素(HCG)均购自上海领潮生物科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)、聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)、硫堇(TH)、氯金酸(HAuCl4·4H2O)购自上海国药集团有限公司；pH 7.0 10 mmol/L磷酸溶液(10 mmol/L Na2HPO4，10 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L NaCl，0.05% Tween-20和BSA 1%)为孵育及洗涤液；所用试剂均为分析纯。

JEM 1400透射电子显微镜(日本Hitachi公司)；电化学阻抗的测定使用交流电压5 mV，频率范围0.01 Hz～3 MHz，5 mmol/L的[Fe(CN)6]3-/4-(含0.1 mol/L KCl)过电化学工作站(德国Zahner公司)进行；电化学测量以玻碳电极(直径3 mm)为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，Pt电极为辅助电极(对电极)，采用三电极体系通过CHI760D电化学工作站(上海辰化仪器有限公司)进行。

1.2实验过程

1.2.1AuNPs/GO 纳米复合物的制备柠檬酸钠还原氯金酸制备纳米金溶胶(AuNPs)[21]。AuNPs/GO纳米复合物的制备参照文献[22-23]，取2.0 mL GO(0.5 mg/mL)分散液与4 mL PDDA(质量分数1%)溶液混合，超声30 min混匀。以5 000 r/min离心后用蒸馏水洗涤分散至2.0 mL水中，获得PDDA-GO溶液。在该溶液中缓慢滴加5.0 mL AuNPs 溶液，超声30 min后离心洗涤3次，分散至2.0 mL水中，得AuNPs /GO溶液。

1.2.2金银立方体纳米粒子(AuAg CNPs)的制备[24]将50 μL 2.0 mmol/L HAuCl4·4H2O溶液和50 μL 2.0 mmol/L AgNO3溶液快速混合加入2.0 mL水中，随后立即加入10 μL 0.1 mmol/L抗坏血酸，剧烈搅拌，30 s内溶液颜色变蓝，表明AuAg NPs形成。随后加入1 mL 0.1 mmol/L的CTAB用于稳定纳米粒子及保持其分散性，将上述溶液离心(8 000 r/min，5 min)，用水洗涤3次。

Ab2/AuAg NPs制备:将20 mg AuAg NPs超声分散至2 mL磷酸缓冲液(PBS，50 mmol/L，pH 6.8)中，再加入500 μL Ab2(0.2 mg/mL)，在4 ℃下轻轻搅拌，孵化12 h，6 000 r/min离心5 min后用PBS洗涤，离心后洗涤，重复操作3次，加入 1.0%BSA溶液封闭剩余活性位点。制得的Ab2/AuAg NPs复合物于4 ℃下储存。

1.3电化学免疫传感器的制备

将玻碳电极(Φ=3 mm)分别在粒径为 1.0，0.3，0.05 μm 的Al2O3糊中抛光打磨，用二次水和乙醇分别超声清洗，吹干备用。将10 μL Au NPs/GO溶液滴涂到电极上，室温下晾干。将10 μL Ab1滴至AuNPs/GO/GCE上孵育2 h，抗体与Au NPs相连接，用1.0% BSA封闭活性位点，30 min后用 0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)清洗，除去非特异性吸附抗体。将5 μL不同浓度的CA-153滴涂到电极表面，孵育40 min，制得CA-153/Ab1/AuNPs/GO/GCE电极(见图1)，然后将5 μL Ab2/AuAg NPs滴至电极表面，孵育40 min，二次水洗涤3次，置于pH 7.0 PBS溶液中，在H2O2浓度为2.0 mmol/L，硫堇浓度为1.0 mmol/L条件下，采用差分脉冲法对CA-153进行检测。

2　结果与讨论

2.1纳米材料的表征

图2A为石墨烯的透射电子显微镜图(TEM)，可以看出石墨烯丝绸状褶皱的表面特征及不规则、大小不同的碎片；图2B为AuNPs的TEM 照片，可观察到粒径在10～20 nm左右，大小均一，分散较好；图2C为Au NPs与GO复合物的TEM照片，由图可见GO上分布有很多Au NPs，说明Au NPs 已组装到GO上，此结果表明采用该方法可有效地固载大量Au NPs。AuAg纳米材料的扫描电镜(SEM)图则表明AuAg纳米材料具有立方结构，边长约为50 nm，分散均匀，尺寸均一(图2D)。

采用ζ-电位对材料的组装方式进行表征，结果显示，GO带负电，这主要由于GO表面带有羧基、羟基等基团；带正电荷的PDDA被吸附于GO表面，使得GO-PDDA带有正电荷；而带负电的Au NPs与带正电的PDDA相互吸附后，形成了Au NPs/GO复合物，Au NPs/GO整体呈负电。

2.2免疫传感器修饰过程的电化学表征

在电极修饰过程中，可采用电化学方法表征电极电流的变化。图3A显示了不同修饰电极于修饰过程中的电流变化曲线。结果显示，Ab1/Au/GO/GCE在pH 7.0 PBS中无明显的氧化还原峰(曲线a)。当Ab1/Au/GO/GCE在CA-153样品溶液中孵育一段时间后，有低电流出现(曲线b)，表明形成的抗原抗体复合物阻碍了电子传递。当Ab2/AuAg NPs发生免疫反应后，在-0.19 V和-0.25 V处出现1对明显的氧化还原峰(曲线c)，这是Ab2/AuAg NPs催化硫堇的氧化还原信号，当反应条件在pH 7.0 PBS(含2.0 mmol/L H2O2)时，免疫传感器发生催化现象，阴极峰升高，阳极峰降低(曲线d)，说明在电子媒介体TH的作用下，由Ab2/AuAg NPs复合材料中的类辣根过氧化物酶催化H2O2还原反应产生了催化电流。曲线e和f显示，Ab2/Ag NPs和Ab2/Au NPs在体系中对氧化还原峰略有增强作用，但氧化还原峰电位未发生变化，说明Ag和Au纳米材料仅起到信号增强作用，并无AuAg纳米粒子类酶催化特性。

在电极的修饰过程中,EIS 能给出电极表面阻抗的变化情况。图3B是不同修饰电极于 5.0 mmol/L[Fe(CN)6]4-/3--0.10 mol/L KCl(pH 7.0) PBS溶液中的交流阻抗谱，曲线a为裸电极的阻抗曲线，曲线b为修饰Au NPs/GO后的阻抗曲线。修饰后电极的阻抗值变大，原因在于Au NPs/GO略微降低了电子的传输。抗体Ab1修饰Au/GO/GCE后，阻抗值进一步增大(曲线c)；采用BSA封闭活性位点后，减少了对抗原的非特异性吸附，由于BSA的导电性差，阻抗值继续增大(曲线d)。加入抗原CA-153发生免疫反应后，阻抗值增大(曲线e)，表明电子的传递受到抗体和抗原的阻碍作用；修饰Ab2/AuAg NPs后，阻抗值进一步增大(曲线f)，表明电子的传递受到了非导电性物质抗体的阻碍作用。

2.3实验条件的优化

由于酸度对免疫传感器有较大影响，因此检测了免疫传感器在pH 5.0～9.0 PBS溶液中的电化学信号。结果显示，当pH值由5.0增至6.8时，电流强度随之增大；在pH 7.0左右，电流强度最大且稳定；pH值高于7.6后电流强度逐渐减小。因此，实验选择pH 7.0作为最佳pH值。孵育时间也是影响免疫反应的重要因素，实验结果显示，响应电流随反应时间的增加而增强，在40 min 时，响应电流基本平稳，因此选择最佳免疫反应时间为40 min。同样考察了温度对免疫反应的影响，实验结果表明，随着孵育温度的提高，电流响应增大，当达到35 ℃时，电流出现最大值，随后开始降低，因此实验选择在35 ℃下进行。

2.4试剂浓度的选择

H2O2和硫堇浓度对传感器性能有着非常大的影响。在pH 7.0 PBS缓冲溶液中，考察了H2O2和硫堇浓度对10 U/mL CA-153电流信号的影响。结果显示，峰电流均随着H2O2和硫堇浓度的增加而增大，电流信号分别在H2O2浓度为2.0 mmol/L、硫堇浓度为1.0 mmol/L时达到最大并趋于稳定，因此实验选择H2O2和硫堇的最佳浓度分别为2.0 mmol/L和1.0 mmol/L。

2.5免疫传感器的重现性、稳定性及选择性

采用电化学免疫传感器对4种不同浓度(0.5，5，20，100 U/mL)的CA-153样品进行5次测量，得到相对标准偏差(RSD)分别为3.7%，2.5%，4.1%，3.9 %。表明构建的传感器具有很好的重现性。

将免疫电极置于0.1 mol/L pH 7.0 PBS(含2 mmol/L H2O2)中，工作100个循环后，峰电流只降低了3.2%。干燥处理后于4 ℃保存30 d，测得信号为原信号的91.4%。推测因为复合物上固定的抗体逐渐失活而导致电流缓慢降低。

为验证免疫传感器的抗干扰能力，将20 U/mL的CA-153分别与相同量的CA-125,CA-199和20 ng/mL的HCG，PSA，CEA，AFP共存，其电流响应与单独测定CA-153时相差不大，说明共存肿瘤标记物引起的干扰可以忽略不计，表明此传感器具有良好的选择性。

2.6分析性能

在最佳条件下，免疫传感器的差分脉冲伏安峰电流值与CA-153浓度的对数值在2.0×10-5～100 U/mL范围内呈良好的线性关系，回归方程为I=59.22+9.02lgc(U/mL)，相关系数为0.998 1，检出限(信噪比的3倍标准偏差)为7.0×10-6U/mL。正常人CA-153值为0～25 U/mL，结果表明，该方法检出限完全满足检测要求。

表1　实际样品的测定

*n=5

2.7实际样品的测定

用电化学免疫传感器对癌症患者血清样品进行检测，若含量超过检测上限，采用PBS溶液进行稀释。采用标准加入法进行回收实验，对4个血液样品平行测定5次，结果如表1所示。测定结果RSD不大于8.7%，回收率为92.2%～110.2%，该方法具有较好的精密度。

3　结　论

基于Au NPs/GO复合材料构建了一种用于肿瘤标志物CA-153检测的电化学免疫传感器传感界面，Au NPs/GO复合材料具有良好的生物相容性，可增加抗体在电极表面的固载量并保持其良好的生物活性。AuAg纳米立方体还具有类辣根过氧化物酶特性，用于抗体标记，可提高电极的稳定性，且利于免疫传感器信号放大和灵敏度提高。该电化学免疫传感器制备简单，测定结果准确可靠，对CA-153的检测具有线性范围宽、检出限低等优点，有望用于实际样品的测定。

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A Highly Sensitive CA-153 Sensor Based on AuAg Cube Nanomaterial

JIA Cui-juan1*,ZHANG Si-bao2,DU Zhang-zhang1

(1.Department of Biology and Chemical Engineering,Jining Vocational Technology College,Jining272037,China；2.Chemical Technology Academy of Shandong,Jinan250014,China)

Cancer antigen-153(CA-153) was very significant specific tumor marker.An Au nanoparticles/graphene oxide(Au NPs/GO)-based electrochemical immunosensing platform was fabricated for the sensitive detection of CA-153 by the sandwich immunoassay protocol.Au NPs/GO composite material was used to modify the glassy carbon electrode.CA-153 antibody was anchored on the surface of Au NPs by the absorbtion of Au NPs and CA-153 antibody.Bovine Serum Albumin(BSA) was used to block possible remaining active sites of nanomaterials and avoid the nonspecific adsorption.AuAg cube nanomaterial available to catalyze the reduction of hydrogen peroxide was used to lable antibody(Ab2).The electrochemical signals derived from the carried AuAg cube toward the reduction of H2O2using the thionine as electron mediator,and were measured by differential pulse voltammetry.Under the optimized experimental conditions,the linear range and the detection limit(S/N=3) of CA-153 immunosensor were 2.0×10-5-100 U/mL and 7.0×10-6U/mL,respectively.The proposed method was applied in the detection of CA-153 in spiked human serum samples with recoveries of 92.2%-110.2% and RSD not more than 8.7%.

electrochemical immunosensor；AuAg nanoparticles；Au nanoparticle/graphene oxide composites;cancer antigen-153

2015-07-27；

2015-12-17

贾翠娟，硕士，讲师，研究方向:生物分析化学，Tel:0537-2232873，E-mail:2293622049@qq.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.013

O657.1；S852.43

A

1004-4957(2016)06-0709-05