气相色谱-三重四极杆质谱联用法检测市售腊肠中9种挥发性亚硝胺

余卫军，王　佩，邱月升，容敏贤，邓　红

(南方医科大学　公共卫生与热带医学学院　营养与食品卫生学系，广东　广州　510515)



气相色谱-三重四极杆质谱联用法检测市售腊肠中9种挥发性亚硝胺

余卫军，王佩，邱月升，容敏贤，邓红*

(南方医科大学公共卫生与热带医学学院营养与食品卫生学系，广东广州510515)

采用QuEChERS方法对市售腊肠中的N-亚硝基二甲胺(NDMA)、N-亚硝基二乙胺(NDEA)、N-亚硝基甲乙胺(NMEA)、N-亚硝基二丙胺(NDPA)、N-亚硝基吡咯烷(NPYR)、N-亚硝基哌啶烷(NPIP)、N-亚硝基二丁胺(NDBA)、N-亚硝基吗啉(NMOR)、N-亚硝基二苯胺(NDPhA)9种对人体有致癌活性的挥发性亚硝胺进行分离净化，气相色谱-三重四极杆质谱联用法(GC-MS/MS)检测。最佳实验条件下，9种挥发性亚硝胺的线性范围为0.25～200 μg/L，检出限为0.01～0.10 μg/kg，加标回收率为90.7%～116.0%，相对标准偏差(RSD)为1.8%～14.0%。市售腊肠样品中NDMA，NMOR，NPYR，NDPA，NPIP，NDBA，NDPhA均有不同程度的检出，总挥发性亚硝胺的含量为1.85～13.44 μg/kg。该方法灵敏度高、操作简单，适合批量样品的快速检测。

挥发性亚硝胺；气相色谱-三重四极杆质谱联用；腊肠

N-亚硝胺类化合物是食物中危害性极高的化合物之一,一次或多次摄入过量的含亚硝胺类化合物的食物后，可引起急性毒性，主要为破坏血小板及损伤肝脏，以N-亚硝基二甲胺(NDMA)为例的急性毒性实验中，大鼠的经口半数致死含量(LD50)为27～41 mg/kg[1]。许多国家和地区的流行病学调查表明，食用咸鱼和腌制食品中高浓度的挥发性亚硝胺是患鼻咽癌的高危因素[2-3]。1987年国际癌症研究机构(IARC)将亚硝胺定义为有强致癌性的食物污染物，NDMA和N-亚硝基二乙胺(NDEA)被列为2A类致癌物，具有潜在的致癌性，其他亚硝胺为2B级，是可能的致癌物[4]。食品是人体摄入亚硝胺的重要来源，其中我国《食品中污染物限量》(GB 2762-2012)规定肉制品中的NDMA不超过3 μg/kg。

广州市居民素有喜食动物性腌制食品的饮食习惯，其中腊肠的市场比例更高达80%左右，因此本研究选取广州市居民消费量大的市售腊肠为研究对象，分析其中挥发性亚硝胺的人体暴露风险。关于肉制品中挥发性亚硝胺的检测，目前的提取净化方法有水蒸气蒸馏[5-7]、固相萃取[8-9]等，由于肉制品中挥发性亚硝胺的含量一般为10-9水平且基质复杂，因此对样品前处理和仪器分析技术要求较高。GC-TEA对N-亚硝胺化合物的检测具有强选择性和高灵敏度[10-13]的特点，已被众多权威标准所采用，但TEA检测器的应用范围狭窄，且造价昂贵，普适性差。GC-MS/MS是高灵敏度和普适性较好的检测方法，目前已有研究应用GC-MS/MS对肉制品中的N-亚硝胺进行分析[14]，效果较好。本研究采用QuEChERS方法对市售腊肠中的9种挥发性亚硝胺进行分离、净化，再用气相色谱-三重四极杆质谱联用法(GC-MS/MS)对其进行定性定量分析，避免了传统方法的样品前处理复杂、耗时、可操作性差等问题，取得了较好的效果。

1　实验部分

1.1仪器设备

气相色谱-三重四极杆质谱仪(7000A GC/MS Triple Quad，美国安捷伦公司)，CP100WX高速冷冻离心机(日本日立公司)，VORTEX-2 GENE旋涡混匀器(美国Scientific 公司)、MTN-2800W氮吹仪(天津奥特赛恩斯公司)、 AL104电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2试剂与材料

9种挥发性亚硝胺(NDMA,NDEA,NMEA,NDPA,NPYR,NPIP,NDBA,NMOR,NDPhA)的混合标准品购于美国Sigma公司(浓度均为2 000 mg/L)；内标N-亚硝基二甲胺-D6(NDMA-D6)和N-亚硝基二丙胺-D14(NDPA-D14)购于德国CNW公司(浓度均为1 000 mg/L)；陶瓷均质子、QuEChERS萃取包(包含4 g硫酸镁和1 g氯化钠)、QuEChERS基质分散净化包(包含50 mg N-丙基乙二胺固相吸附剂(PSA)、150 mg C18反向吸附剂和900 mg硫酸钠)均购自美国Agilent公司；乙腈(色谱纯，德国CNW公司)，实验用水经Milli-Q超纯水系统过滤。市售腊肠样品均于2015年2月采集于广州市大型超市或农贸市场，共15份代表性样品，并在24 h内带回实验室，-20 ℃冰箱冷藏待测。

1.3标准溶液的制备

准确吸取一定体积的9种亚硝胺混合标准溶液，用乙腈定容至1 mL得到200 mg/L的混合标准储备液，于-20 ℃储存。准确吸取一定体积的混合标准储备液，以乙腈为溶剂逐级稀释成0.25，0.5，2.5，5.0，10，25，50，200 μg/L系列浓度的混合亚硝胺标准溶液，内标浓度均为10 μg/L。

1.4样品前处理

样品经液氮处理后，用粉碎机搅碎，称取10 g均质样品，加入适量内标(NDMA-D6和NDPA-D14，浓度均为2 μg/L)，再加入10 mL乙腈，涡旋混匀，于-20 ℃冰箱中冷冻30 min，加入2个陶瓷均质子和bond elut QuEChERS 萃取盐，迅速振荡30 s，8 000 r/min于0 ℃低温离心10 min，取上清液6 mL加至15 mL bond elut QuEChERS 基质分散净化管中，涡旋1 min，于0 ℃8 000 r/min离心10 min，取5 mL上清液在室温下氮吹浓缩至1 mL，过 0.2 μm针头式滤膜，待测。

1.5仪器分析

1.5.1色谱条件采用DB-WAXETR(30 m×0.25 μm×0.25 μm)对目标物进行分析；升温程序：起始柱温为50 ℃，保留1 min，以10 ℃/min升至110 ℃，再以15 ℃/min升至200 ℃，然后以4 ℃/min升至280 ℃，保留13.75 min；进样口温度为250 ℃；进样体积为2 μL，采用不分流进样；载气为高纯氮气，柱流量：1.2 mL/min。

1.5.2质谱条件采用电子轰击离子源(EI)，电离能量70 eV，溶剂延迟2 min，离子源温度为230 ℃，四极杆温度为150 ℃，SRM多反应监测模式。9种挥发性N-亚硝胺的保留时间及质谱参数如表1所示。

表1　9种挥发性亚硝胺的保留时间、定量定性离子对和碰撞能量(CE)

2　结果与讨论

2.1样品前处理的优化

肉制品中挥发性亚硝胺的常用提取方法有蒸馏法[5-7]和固相萃取法[8-9]，传统的提取方法存在回收率差、前处理耗时、耗费大量有机溶剂、操作繁琐、样品用量大以及不利于批量处理等缺点。本实验采用QuEChERS方法结合气相色谱-三重四极杆质谱联用法检测市售腊肠中9种挥发性亚硝胺，该前处理方法具有快速，简便，有机溶剂使用量较少，有利于批量处理等优点，回收率为90.7%～116.0%，符合检测要求。

本研究采用乙腈作为提取溶剂，可同时去除腊肠样品中油脂等杂质和沉淀蛋白质[15]。考虑到腊肠样品中的亚硝胺含量低，本研究将上清提取液直接上机，优化成取5 mL提取溶液常温氮吹浓缩至1 mL后上机，改进后方法检出限理论上降低为未浓缩直接上机的1/5。本实验选取1种腊肠，分别添加不同浓度(相当于10 g样品中添加1.5，3.0，10 μg/kg)的亚硝胺混合标准溶液后，按照上述样品制备方法处理，3次重复试验取平均值，扣除样品空白试验中亚硝胺含量。结果如表2所示，其加标回收率为90.7%～116.0%，相对标准偏差(RSD)为1.8%～14.0%。由此可见，用该前处理方法对肉制品中9种挥发性亚硝胺进行分离净化和富集具有良好的回收率和重复性。

表2　市售腊肠中9种挥发性亚硝胺的回收率和相对标准偏差(n=3)

* no detected

2.2仪器条件的优化

分别考察不同仪器(超高效液相色谱串联质谱联用仪(UPLC-MS/MS)、气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)和气相色谱-串联质谱联用仪(GC-MS/MS))分析检测目标亚硝胺的灵敏度是否满足检测需求。UPLC-MS/MS用ESI源调谐，发现重点关注的亚硝胺(如NDMA)响应值极低，无法满足检出限要求，而GC-MS(EI源)调谐发现亚硝胺(如NDMA)检出限欠佳，灵敏度不理想，而用GC-MS/MS(EI源)调谐时灵敏度符合检测要求，因此选用GC-MS/MS(EI源)进行检测。进一步考察不同极性色谱柱：非极性色谱柱(DB-5，(5%-苯基)-甲基聚硅烷)和极性色谱柱(DB-WAXETR，聚乙二醇(PEG))对9种挥发性亚硝胺的色谱分离效果。结果发现采用DB-5时色谱峰拖尾，而选用极性色谱柱(DB-WAXETR)时各组分的色谱峰尖锐对称，满足方法学要求。在“1.5”所述条件下，对9种挥发性N-亚硝胺混合标准溶液进行分析，得到标准品的总离子流图(见图1)，实现了对9种挥发性亚硝胺的良好分离。

2.3线性范围与检出限

配制一系列质量浓度分别为0.25,0.5,2.5,5.0,10,25,50,200 μg/L的标准工作溶液，在选定的色谱及质谱条件下进行测定，以定量离子对的峰面积与内标定量离子对的峰面积之比(Y)为纵坐标，以质量浓度(X，μg/L)为横坐标进行线性回归。结果显示，在0.25～200 μg/L范围内，9种待测物与对应响应值呈良好的线性关系，相关系数不低于0.999 8。根据3倍信噪比(S/N)和10倍S/N，得出9种挥发性亚硝胺的仪器检出限和定量下限(表3)。《GB-T5009.26-2003食品中N-亚硝胺类的测定》中要求方法检出限为1.0 μg/kg，本实验方法灵敏度高可以满足腊肠中9种挥发性亚硝胺检测要求。由于挥发性亚硝胺含量在肉质品中含量为10-9水平，低的检出限能更好的监测肉制品中挥发性亚硝胺水平。

表3　9种挥发性亚硝胺化合物的线性方程、相关系数、线性范围、检出限及定量下限

2.4实际样品的分析

采用本方法对15个不同种类的市售腊肠进行检测，结果7种挥发性亚硝胺(NDMA，NMOR，NPYR，NDPA，NPIP，NDBA和NDPhA)均有检出，其中NDMA检出量为0.20～6.14 μg/kg，NMOR为0.07～1.78 μg/kg，NPYR为n.d.～4.92 μg/kg，NDPA为n.d.～3.05 μg/kg，NDBA为n.d.～0.20 μg/kg，NPIP为n.d.～1.05 μg/kg，NDPhA为n.d.～2.17 μg/kg;其中以NDMA，NMOR，NPYR和NDPA的检出率较高，其检出率大于80%，实验结果与文献[14]接近。且33%的市售腊肠样品(5份)中NDMA含量超过我国肉制品限量标准(NDMA≤3 μg/kg)，分别为3.05，3.59，4.57，5.87，6.14 μg/kg。

以样品中9种挥发性亚硝胺含量总和为总挥发性亚硝胺含量，得到样品的总挥发性亚硝胺含量为1.85～13.44 μg/kg。目前我国尚无总挥发性亚硝胺的含量标准，参照2005年美国农业部规定食品中总挥发性亚硝胺不能超过10 μg/kg，而本研究中有2个样品的总挥发性亚硝胺含量已超过10 μg/kg，其值分别为13.21 μg/kg和13.44 μg/kg。图2为某市售腊肠样品的总离子流图。

3　结　论

本文采用QuEChERS/GC-MS/MS对肉制品中9种挥发性亚硝胺进行分析，优化了提取净化方法，并通过浓缩降低了检出限。该方法样品前处理成本较低，简便快速，灵敏可靠，适用于腊肠中挥发性亚硝胺的筛查和定量分析，便于市售腊肠样品中亚硝胺检测的推广应用。

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Determination of Nine Volatile Nitrosamines in Local Sausage on Sale by Gas Chromatography Tandem Triple Quadrupole Mass Spectrometry

YU Wei-jun，WANG Pei,QIU Yue-sheng,RONG Min-xian,DENG Hong*

(Department of Nutrition and Food Hygiene,School of Public Health and Tropical Medicine,Southern Medical University,Guangzhou510515,China)

A selective gas chromatography tandem triple quadrupole mass spectrometry was used to detect nine volatile nitrosamines,including N-nitrosodimethylamine(NDMA),N-nitrosodiethylamine(NDEA),N-nitrosomethylethylamine(NMEA),N-nitrosodipropylamine(NDPA),N-nitrosopyrrolidine(NPYR),N-nitrosopiperidine(NPIP),N-nitrosodibutylamine(NDBA),N-nitrosomorpholine(NMOR),N-nitrosodiphenylamine(NDPhA) in local sausage on sale by using QuEChERS sample pretreatment.The calibration curves of nine volatile nitrosamines were linear in the range of 0.25-200 μg/L,with detection limits of 0.01-0.10 μg/kg.The recoveries were in the range of 90.7%-116.0% at three spiked concentration levels in sample,with relative standard deviations(RSDs) of 1.8%-14.0%.The method was applied in the detection of local sausage on sale,and seven volatile nitrosamines were all detected.The detection rates of NDMA，NMOR，NPYR，NDPA were higher than that of the others.The contents of total volatile nitrosamines were in the range of 1.85-13.44 μg/kg.The developed method was simple,rapid,sensitive and accurate.Key words：volatile nitrosamines；gas chromatography tandem triple quadrupole mass spectrometry；local sausage

2016-03-08；

2016-04-23

国家自然科学基金(81373008)

邓红，博士，副教授，研究方向：营养与食品卫生学，Tel：020-62789446，E-mail：1792835456@qq.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.015

O657.63;O623.732

A

1004-4957(2016)06-0719-05