UPLC-MS/MS法测定中药材中齐墩果酸与熊果酸的含量

杨晓静，陈丽娜，秦　瑶，李赛男，唐　英，李森林，刘春明

(长春师范大学　中心实验室，吉林　长春　130032)



UPLC-MS/MS法测定中药材中齐墩果酸与熊果酸的含量

杨晓静，陈丽娜，秦瑶，李赛男，唐英，李森林，刘春明*

(长春师范大学中心实验室，吉林长春130032)

建立了一种同时检测中药材中齐墩果酸(OA)和熊果酸(UA)含量的超高效液相色谱串联质谱方法。采用超高效液相色谱-三级四极杆质谱(UPLC-TQMS)法对样品进行测定，Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)进行分离，以乙腈-5 mmol/L乙酸铵水溶液(氨水调至pH 9.24)为流动相，梯度洗脱；负离子模式下检测。结果表明，齐墩果酸和熊果酸在0.5～50.0 ng/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数(r2)分别为0.999 8和0.999 7；检出限(S/N=3)分别为0.006 6,0.012 8 ng/mL，定量下限(S/N=10)分别为0.002 0，0.003 8 ng/mL；对OA和UA进行加标回收实验，平均回收率分别为101.1%和100.8%，相对标准偏差(RSD，n=9)分别为1.8%和0.04%。对10种不同中药材中齐墩果酸和熊果酸含量进行检测，结果表明该方法快速简便、准确度高、重现性好，可用于含有齐墩果酸和熊果酸的中药材含量测定。

中药材；齐墩果酸；熊果酸；超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)

齐墩果酸(OA)和熊果酸(UA)是互为同分异构体的2种五环三萜类化合物[1]，在自然界中分布十分广泛且具有很多的生物活性和药理活性，其结构式见图1。其中齐墩果酸分子式为C30H48O3，属于β-香树脂醇型五环三萜类化合物[2]，多以游离形式或与糖结合的形式存在于约60个科190种植物中[2]，具有保肝、消炎、降糖、抗HIV和抗肿瘤[3]等药理作用。熊果酸为α-香树脂醇型五环三萜类化合物，以游离形式或与糖结合的形式存在于约7个科62种植物中[3]，具有抑制血管生成、抗肿瘤、抗炎抑菌、抗HIV[4]等药理作用。目前已报道的齐墩果酸和熊果酸的检测方法有高效液相色谱-蒸发光检测器(HPLC-ELSD)法[5]、反相高效液相色谱-紫外检测器(RP-HPLC-DAD)法[6]、反相高效液相色谱-蒸发光检测器(RP-HPLC-ELSD)法[7]、薄层扫描(TLCS)法[8]、气相色谱(GC)法[9]、超高效液相色谱法(UPLC)[10]以及高效液相色谱法(HPLC)[11]等。但由于齐墩果酸和熊果酸的结构性质极其相似，以上方法存在灵敏度低、干扰大、分析时间长等不足。本研究建立了超高效液相色谱-三级四极杆质谱测定中药材中的齐墩果酸和熊果酸含量的方法，并对木瓜[12]、夏枯草[13]、山茱萸[14]、连翘[15]、山楂[16]、女贞子[17]、乌梅[18]、石榴皮[19]、柿蒂[20]以及白花蛇舌草[21]10种常用中药材中齐墩果酸和熊果酸的含量进行测定。结果表明，该方法与已报道方法相比具有有机溶剂用量少、干扰小、分析速度快、准确度高且超高效分离的特点，此外，该方法的定量下限可达ng级，灵敏度明显高于其他方法，为中药材中齐墩果酸和熊果酸的含量检测提供了科学依据。

1　 实验部分

1.1仪器与试剂

超高效液相色谱-三级四极杆质谱仪(Acquity UPLC-Xevo TQ-S,Waters公司,美国)：I class二元高压泵、FTN自动进样器、TQ-S质谱、Masslynx V4.1工作站；0.1 mg电子天平(BSA124S，赛多利斯，德国)；超声清洗仪(KQ-500E型，习仁科学仪器有限公司，上海)；具塞试管10 mL；滤膜(0.22 μm)。

齐墩果酸标准品(纯度≥98.5%，CAS：508-02-1)、熊果酸标准品(纯度≥98.5%，CAS：77-52-1)；甲酸(色谱纯)、乙酸铵(色谱纯≥99.0%，CAS：631-61-8)购自Aladin公司；氨水(可用于LC-MS浓度≥25%，Aladin公司，CAS：1336-21-6)；乙腈、甲醇(色谱纯，美国Thermo Fisher公司)；实验用水为超纯水(Microcon YM-100，美国Millipore公司)；10种中药材样品购自吉林省长春市同仁堂，由长春师范大学中心实验室陈丽娜老师鉴定。

1.2对照品溶液的制备

分别精密称取齐墩果酸和熊果酸对照品1.00 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成浓度为0.1 mg/mL的对照品溶液，于4 ℃下保存，使用前稀释至所需浓度。

1.3供试品溶液的制备

分别精密称取10种中药材样品细粉0.20 mg于具塞试管中，精密加甲醇5 mL,密塞，称定质量，在室温下浸渍2 h，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀后过滤，取滤液于4 ℃下保存，使用前稀释至所需浓度，过0.22 μm滤膜备用。

1.4色谱-质谱条件

色谱条件：色谱柱：Weters AcquityTMBEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)；柱温：30 ℃；进样体积5.00 μL；流动相：乙腈(A)-5 mmol/L乙酸铵水溶液(B)(氨水调至pH 9.24)；梯度洗脱程序：0～0.5 min，67%A，0.5～3.0 min，67%～70%A，3.0～3.5 min，70%～95%A，3.5～5.0 min，95%～67%A；流速：0.3 mL/min。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)。采用负离子模式；毛细管电压：2.87 kV；离子源温度：120 ℃；去溶剂气温度：350 ℃；锥孔气流量：150 L/h；去溶剂气流量：697 L/h；碰撞气为氩气，流速为0.15 mL/min；检测模式：多反应监测模式(MRM)；两种化合物的离子对见表1。

表1　齐墩果酸和熊果酸的质谱参数条件

2　结果与讨论

2.1质谱条件的选择

采用初始流动相稀释齐墩果酸和熊果酸标准品，分别对两个标准品溶液进行全扫描，确定每种化合物的母离子，然后对其进行子离子扫描，选出丰度较高的子离子作为定量离子，建立多离子反应监测(MRM)离子对。然后结合流动相对其他质谱参数(如干燥气流速、锥孔气流速、毛细管电压、干燥气温度等)进行优化，确保灵敏度达到最佳值。优化的质谱参数如“1.4”所示。

2.2色谱条件的优化

在离子对色谱中，组分离子与平衡离子的生成以及离子对的形成均与流动相的pH值密切相关。从上述流动相体系的考察可看出，相对于酸性环境，碱性环境更有利于二者的分离，因此实验用氨水调节流动相中水相的pH值(分别为4.01，7.24，8.39，8.90，9.24)并记录其分离情况。结果表明，随着pH值的增加，二者的分离情况得到改善，在pH 9.24时，齐墩果酸和熊果酸可在5 min内达到良好分离。

此外，流动相的流速对分离效果也有影响，低流速相对高流速更有助于分离，但会延长分离时间。分别对流速为0.2 mL/min和0.3 mL/min时的分离情况进行考察，结果显示，流速为0.2 mL/min时的出峰时间略晚于流速为0.3 mL/min，但分离度无明显差异，故选择流速为0.3 mL/min。

2.3方法验证

2.3.1线性关系分别取对照品储备液，精确稀释成浓度分别为0.05，0.1，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，25.0，50.0 ng/mL的混合对照品溶液，在优化条件下分别进样测定，重复3次，以各物质特征碎片离子峰面积的平均值(Y)对被测物质的质量浓度(X，ng/mL)进行线性回归，得到回归方程、相关系数和线性范围。结果显示，OA和UA在0.5～50.0 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数分别为0.999 8,0.999 7，方法检出限(S/N=3)分别为0.006 6，0.012 8 ng/mL，定量下限(S/N=10)分别为0.002 0，0.003 8 ng/mL。方法具有较高的灵敏度，当样品中目标物浓度超过此线性范围时，可适当稀释后进行测定。

2.3.2精密度以白花蛇舌草样品作为供试品，采用本方法在1 d内选取6个不同的时间对同一供试样品中齐墩果酸和熊果酸含量进行检测，连续测定3 d，根据峰面积的变化值求出齐墩果酸和熊果酸的相对标准偏差(RSD)分别为1.8%和1.7%。

2.3.3重复性以白花蛇舌草样品作为供试品，取同一批次的6个独立样品，采用本方法进行检测，根据所得峰面积求出齐墩果酸和熊果酸对应的RSD均为1.4%。

2.3.4稳定性以白花蛇舌草样品作为供试品，取同一批供试品，采用本方法分别在0，2，4，8，10，12 h进行检测，根据所得峰面积求出齐墩果酸和熊果酸对应的RSD分别为1.0%和1.8%。

2.3.5回收率以白花蛇舌草样品作为供试品，精密称取9份白花蛇舌草粉末，每份约1.0 g，每3份为一组，每组分别精密加入一定量的齐墩果酸和熊果酸对照品。按“1.3”方法制备供试品溶液，采用本方法检测，根据峰面积计算齐墩果酸和熊果酸的回收率及RSD，结果见表2。齐墩果酸和熊果酸的平均回收率分别为101.1%和100.8%，RSD(n=9)值分别为1.8%和0.04%，说明该方法的准确度和精密度均较高。

表2　回收率试验

2.4样品测试

取10种常见的中药材，在优化条件下进行检测，结果见表3。由表3可见，本研究的10种同批中药材中，木瓜中齐墩果酸和熊果酸的总含量最高，可达31.26 mg/g，乌梅中齐墩果酸和熊果酸的总含量相对较少，仅1.72 mg/g。该方法可快速准确地测定出中药材中齐墩果酸和熊果酸的含量。

表310种中药材中齐墩果酸和熊果酸的含量(n=2)

Table 3Contents of OA and UA in 10 kinds of Chinese herbal medicine(n=2)w/(mg·g-1)

3　结　论

本文首次建立了UPLC-MS/MS同时检测中药材中的齐墩果酸和熊果酸含量的方法，采用Weters AcquityTM BEH C18色谱柱分离，以乙腈-水(含5 mmol/L乙酸铵，氨水调至pH 9.24)为流动相进行梯度洗脱，二者可在短时间内达到良好的分离。应用本法对10种常用中药材中齐墩果酸和熊果酸的含量进行检测，结果表明，该方法重现性好、操作简便、灵敏度和准确度高，可用于传统中药材中两者的含量测定。

[1]Tian L T,Ma L,Du N S.Chin.J.Chin.Med.(田丽婷，马龙，堵年生.中国中药志)，2002，27(12):884-886.[2]Liu D,Meng Y Q,Zhao J.Chem.Bul.(刘丹，孟艳秋，赵娟.化学通报)，2007，1:14-20.

[3]Hsu H Y,Yang J J,Lin C C.CancerLett.,1997,111:7-13.

[4]Liu J.JEthnopharm.,1995,49:57.

[5]Li Y,Lü Y,Lin L P.J.Chin.Mater.Med.(李英,吕晔,林丽萍.中药材)，2014，3(37):451-453.

[6]Xu X H,Su Q,Zang Z H.J.Pharm.Anal.,2012，3(2):238-240.

[7]Zhao Y X,Ma G Y,Liang H.J.Chin.Tradit.PatentMed.(赵永席，马国营，梁恒.中成药)，2005，27(11):1314-1316.

[8]Ji C R,Yuan K,Hu R H.J.Chin.Med.Pharmacol.(冀春茹，袁珂，胡润淮.中医药学报)，1997,(6):43-44.[9]Yan H L,Zhao L H,Zhu D N.Chin.J.Chin.Mater.Med.(闫花丽，赵陆华，朱丹妮.中国中药杂志)，1999,24(12):744-746.

[10]Yu X H,Chen X H,Dai R H,Bi K S.Mod.Chin.Med.(俞喜华，陈晓辉，戴荣华，毕开顺.中国现代中药)，2010，12(5):26-28.

[11]Xu D R,Ding Q,Wang Z T.Chin.Tradit.HerbalDrugs(徐德然，丁晴，王峥涛.中草药)，2002，33(11):996-997.[12]Lü M H,Xie X M,Cha X Z,Jiang C L,Yu G X,Wang Z T.J.AnhuiTCMCollege(吕美红，谢小梅，查孝柱，江茶龙，俞桂新，王峥涛.安徽医药学报)，2010，29(3):72-74.

[13]Guo S Y,Feng B.ChinaPharm.(郭淑英,冯波.中国药房)，2010，21(27):2537-3538.

[14]Zhao Y X,Ma G Y,Liang H.Chin.TraditPatentMed.(赵永席，马国营，梁恒.中成药),2006，40(2):239-242.[15]Zhao S H,Liu M Y,Wang Y F,Xu H H,Zhang Y F,Wang M.FoodSci.(赵韶华，刘敏彦，王玉峰，许红辉，张永峰，王猛.食品科学),2012，33(2):224-226.

[16]Ding Y H,Sun Y C,Wang Z Z,Bi Y A,Zhang G R,Yang Y J,Xiao W.Chin.Tradit.HerbalDrugs(丁银花，孙永成，王振中，毕宇安，张广仁，杨瑶珺，萧伟.中草药)，2014，45(14):2084-2088.

[17]Qi Z H,Wang S W.Chin.J.Inf.TCM.(戚志华，王四旺.中国中医药信息杂志)，2007，14(5):40-42.

[18]Fan C J,Liu Y P,Chen H P,Shi Y H.LiShizhenMed.Mater.Med.Res.(范成杰，刘友平，陈鸿平，石宇华.时珍国医国药)，2008，19(8):1843-1844.

[19]Liu H,Chen L,Zou S Q.LiShizhenMed.Mater.Med.Res.(刘洪，陈亮，邹盛勤.时珍国医国药)，2007，18(12):2884-2885.

[20]Zhu Z Y,Zheng F,Chen W.AnhuiAgric.Sci.(朱智勇，郑丰，陈武.安徽农业科学),2007，35(31):9840-9841.[21]Yang Y H,Chen Y X.HeraldMed.(杨宜华,陈玉祥.医药导报)，2005，27(5):589-591.

Determination of Oleanolic Acid and Ursolic Acid in Chinese Herbal Medicine by UPLC-MS/MS

YANG Xiao-jing,CHEN Li-na,QIN Yao,LI Sai-nan,TANG Ying,LI Sen-lin,LIU Chun-ming*

(Central Laboratory,Changchun Normal University,Changchun130032,China)

An ultra performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometric(UPLC-MS/MS) method was established for the simultaneous determination of oleanolic acid(OA) and ursolic acid(UA) in Chinese herbal medicine.The sample was detected by ultra performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS).The separation of two compounds was achieved on a Waters Acquity UPLC BEH C18column(50 mm×2.1 mm,1.7 μm) with a mobile phase of 5 mmol/L ammonium acetate in water(ammonium hydroxide adjust pH 9.24) and acetonitrile in gradient elution mode.The detection of the compounds was performed in negative ion mode.The result indicated that the concentration of OA and UA had good linear relationships with peak area in the concentration range of 0.5-50.0 ng/mL,and the correlation coefficients(r2) were 0.999 8 and 0.999 7,respectively.LODs(S/N=3) of the two compounds were 0.006 6 ng/mL and 0.012 8 ng/mL,respectively.LOQs(S/N=10) were 0.002 0 ng/mL and 0.003 8 ng/mL,respectively.The recoveries of OA and UA were 101.1% and 100.8%,with RSDs(n=9) of 1.8% and 0.04%,respectively.The method showed the advantages of simpleness,high accuracy and good reproducibility,and could be used for the detection of OA and UA content in the Chinese herb.

Chinese herb；oleanolic acid；ursolic acid;ultra performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)

2015-11-25；

2016-03-10

国家自然科学基金资助项目(31170326,31370374)；吉林省科技厅资助项目(20130413043 GH)

刘春明，博士，教授，研究方向：天然药物分析，Tel：0431-86168777，E-mail:ccsf777@163.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.022

O657.65；TQ460.72

A

1004-4957(2016)06-0753-05

实验技术