pH区带逆流色谱分离制备金果榄中的巴马汀及药根碱

刘　倩，孙常磊，宫成玉，杨　鹏,李大鹏，王　晓*

(1.山东省分析测试中心，山东省中药质量控制技术重点实验室，山东　济南　250014；2.山东农业大学　食品科学与工程学院，山东　泰安　271018；3.烟台出入境检验检疫局，山东　烟台　264000；4.济南康森三峰生物工程有限责任公司，山东　济南　250014)



pH区带逆流色谱分离制备金果榄中的巴马汀及药根碱

刘倩1,2，孙常磊1，宫成玉3，杨鹏4,李大鹏2，王晓1*

(1.山东省分析测试中心，山东省中药质量控制技术重点实验室，山东济南250014；2.山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安271018；3.烟台出入境检验检疫局，山东烟台264000；4.济南康森三峰生物工程有限责任公司，山东济南250014)

采用一种高效的pH区带逆流色谱方法分离制备金果榄中的巴马汀和药根碱，以氯仿-甲醇-水(4∶3∶2)为溶剂系统，在上相中加入20 mmol/L的HCl作为固定相，在下相中加入10 mmol/L三乙胺作为流动相，流速为2.0 mL/min，仪器转速为850 r/min。经一次pH区带逆流色谱分离，从2 g粗提物中得到512 mg巴马汀和421 mg药根碱。经高效液相色谱(HPLC)分析，其纯度均大于95%，采用MS，1H NMR和13C NMR对其化学结构进行确定。该方法具有简便、快捷、重现性好、上样量大等特点，可快速高效地分离制备金果榄中的巴马汀和药根碱。

pH区带逆流色谱；高效液相色谱(HPLC)；巴马汀；药根碱；金果榄

金果榄为防己科植物青牛胆Tinosporasagittata(Oliv.) Gagnep.或金果榄TinosporacapillipesGagnep.的干燥块茎，具有清热解毒、利咽止痛等功效[1]。内服用于治疗咽喉肿痛、扁桃体炎、急性胃肠炎、菌痢、痈肿疔疖等多种炎症；外用浸膏、磨汁涂搽或研末调搽用以治疗静脉炎、毒蛇咬伤等症[2]，主要活性成分为生物碱类化合物巴马汀和药根碱[3]。由于二者是结构和极性极其相似的季铵类生物碱，用传统的柱色谱方法分离，存在耗时长、样品不可逆吸附及回收率低等缺点，为了建立金果榄的质量标准和进一步研究其药理活性，研究一种快速高效地从金果榄中分离制备高纯度生物碱的方法具有重要意义。

pH区带逆流色谱(PZRCCC)是在高速逆流色谱(HSCCC)基础上发展的一种特殊的分离制备技术，依据化合物的解离常数(KD) 和疏水性的不同实现分离，适于可解离化合物(如有机酸和生物碱)的制备性分离，具有制备条件易优化、制备量大、分离馏分高度浓缩以及可通过pH值检测无紫外吸收的化合物等特点[4-6]。本研究采用pH区带逆流色谱法，通过优化两相溶剂系统，对金果榄总生物碱进行了分离纯化，得到2个高纯度的生物碱单体巴马汀和药根碱(结构式见图1)。

1　实验部分

1.1仪器、试剂与材料

TBE-300型高速逆流色谱仪购于上海同田生化技术有限公司(包括S-1007单缸柱塞泵和8823B紫外检测器，聚四氟乙烯管，管内径1.6 mm，螺旋管总体积300 mL，转速0～1 000 r/min)；Waters 600-996高效液相色谱系统，配有光电二极管阵列检测器(PDA)，购于美国Waters公司；Varian INOVA-400核磁共振波谱仪(美国Varian公司)；Agilent 1100 series 6320 ion-trap 质谱仪(美国Agilent公司)。

金果榄总生物碱的制备以及pH区带逆流色谱所用甲醇、氯仿、石油醚和乙酸乙酯均为分析纯(中国医药集团上海化学试剂公司)；HPLC用甲醇、乙腈为色谱纯(美国天地公司)，HPLC实验用水为娃哈哈纯净水；其他实验用水为过滤蒸馏水。

金果榄药材购自山东中医药大学中鲁医院，经山东中医药大学李佳教授鉴定为防己科植物金果榄TinosporacapillipesGagnep.的干燥块茎。

1.2金果榄总生物碱的制备

取金果榄药材2 kg，粉碎过40目筛；用10 L乙醇(90%)回流提取3次，每次2 h，过滤，合并提取液；减压回收乙醇，得浓缩液2 L；用HCl调至pH 2.0，用等体积石油醚萃取浓缩液后，再用氨水调至pH 10.0，最后用等体积的氯仿连续萃取3次，合并萃取液，减压回收氯仿，得金果榄总生物碱15 g，置于冰箱内备用。

1.3两相溶剂系统及样品溶液的制备

pH区带逆流色谱溶剂系统为氯仿-甲醇-水(4∶3∶2)，总体积为1.8 L，按比例将上述溶剂置于分液漏斗中混合，振荡后充分静置使其分层。使用前分取上下相，在上相中加入20 mmol/L HCl作为固定相，下相中加入10 mmol/L三乙胺作为流动相，超声除去气泡，备用。

称取2 g金果榄总生物碱置于试管中，加入10 mL已添加盐酸的上相和10 mL未加三乙胺的下相，超声振荡使样品溶解，制备成样品溶液。

1.4pH区带逆流色谱分离过程

溶剂系统中的上相(固定相)以20 mL/min流速注满高速逆流色谱仪的螺旋管，待出口流出一定量的液体(约50 mL)，调整分离柱转速为850 r/min，将上述溶解好的样品溶液20 mL用注射器注入进样圈，同时下相(流动相)以2.0 mL/min流速泵入。开启检测器和记录仪，检测器的检测波长为254 nm，记录仪灵敏范围1 A，量程100 mV，记录纸速度6 cm/h，根据记录的色谱图收集色谱平台组分。待分离结束，用压缩空气吹出螺旋管中的液体，计算固定相的保留率。

1.5HPLC分析及结构鉴定

金果榄总生物碱和pH区带逆流色谱分离得到的各组分均采用HPLC进行分析。HPLC条件：色谱柱为Waters C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；检测波长为254 nm；流动相为乙腈-0.2%磷酸水溶液(30∶70)，等度洗脱，流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL。

电喷雾离子源(ESI)，正离子模式检测，样品通过流动注射泵进样，流速为0.2 mL/min，干燥气温度为350 ℃，干燥气流量为9.0 L/min，雾化气压力为2.38 MPa，毛细管电压为4 kV，质量扫描范围为m/z50～1 200，实验前质量数经过校正。

2　结果与讨论

2.1HPLC条件的优化

根据溶质电离理论，当流动相的pH

pKb时，生物碱溶质以中性状态为主，在C18上的保留增强。因此，当流动相的pH≈pKb时，保留时间则随着pH值的微小变化而灵敏变化，使色谱分离的重复性较差；当pH≥pKb±2时，保留时间稳定，即色谱分离有较好的重复性[7-9]。巴马汀的pKb为4.3，故溶剂系统的pH值一般不宜选在4.3附近[10]。本研究分别考察了乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾(pH 4.6)、乙腈-0.4 mol/L氯化铵(pH 5.3)和乙腈-0.2%磷酸(pH 2.1)作为HPLC流动相时的分离效果。结果表明，用乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾和乙腈-0.4 mol/L氯化铵流动相时的峰形拖尾，拖尾因子超过1.05；当采用乙腈-0.2% 磷酸作为流动相进行等度洗脱(30∶70)，流动相流速为1.0 mL/min时，保留时间适宜，峰形较好，无拖尾，各成分可以实现基线分离，分离效果如图2A所示。

2.2pH区带逆流色谱分离条件的优化

在pH区带逆流色谱分离制备中药活性成分的过程中，最关键是选择合适的两相溶剂系统。合适的两相溶剂系统不仅能提供理想的分配系数KD，即满足Kacid≪1和Kbase≫1，而且满足样品在溶剂系统中有良好的溶解度[11-13]。根据文献报道以及本实验室在高速逆流色谱分离制备化合物方面的经验，首先选择极性范围较广的四元溶剂系统石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水。另外，考虑到所分离的化合物为生物碱，选用三乙胺作为保留剂，盐酸作为洗脱剂进行分离。在溶剂系统方面，考察了石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶1)、石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶5∶5)、石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(3∶7∶5∶5)、石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(3∶7∶3∶7)的分离效果，4种溶剂系统中均在上相加10 mmol/L三乙胺，下相加10 mmol/L盐酸。结果显示，前3个溶剂系统的KD不满足Kacid≪1和Kbase≫1的要求，溶剂系统石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(3∶7∶3∶7)虽然能够提供较为合适的KD值，但金果榄总生物碱在该溶剂系统中溶解度太小，不能进行制备级分离。

考虑到季铵型生物碱的理化性质，以及该类化合物在氯仿中的溶解度，且氯仿常用于生物碱的萃取纯化，因此将溶剂系统选定为氯仿-甲醇-水，并在上相加20 mmol/L盐酸作为保留剂，下相加10 mmol/L三乙胺作为洗脱剂，对不同的溶剂比例(2∶1∶1,4∶3∶3,4∶3∶2)进行了考察。结果发现氯仿-甲醇-水(4∶3∶3)和(4∶3∶2)不仅能够提供合适的分配系数，而且溶解度得到大幅提高[14-15]。进一步测试发现，溶剂系统氯仿-甲醇-水(4∶3∶3)虽有一定的分离趋势，但未能形成明显的pH区带，分离结果如图3A所示。而溶剂系统氯仿-甲醇-水(4∶3∶2)能够在4 h内形成两个不规则的矩形峰，且杂质成分被富集在两个矩形峰之间，实现了化合物的成功分离，分离效果如图3B所示。因此，最终选定氯仿-甲醇-水(4∶3∶2)作为溶剂系统，并在上相固定相中加入20 mmol/L盐酸作为保留剂，下相流动相中加入10 mmol/L三乙胺作为洗脱剂，对金果榄中的生物碱成分进行分离。经一次pH区带逆流色谱分离，从2 g金果榄总生物碱中分离得到巴马汀(512 mg)和药根碱(421 mg)，经HPLC分析，纯度分别为95.1%和95.3%，分析结果如图2B～C所示。

2.3pH区带逆流色谱分离组分的结构鉴定

化合物a：ESI-MSm/z:353[M+H]+;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6):9.86(1H,s,H-8),9.04(1H,s,H-13),8.17(1H,d,J=9.2 Hz,H-11),8.02(1H,d,J=9.2 Hz,H-12),7.69(1H,s,H-4),7.07(1H,s,H-1),4.93(2H,t,J=6.4 Hz,H-6),4.08(3H,s,9-OCH3),4.05(3H,s,10-OCH3),3.92(3H,s,2-OCH3),3.85(3H,s,3-OCH3),3.21(2H,t,J=6.4 Hz,H-5);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6):152.4(C-9),150.1(C-3),149.8(C-2),145.8(C-8),143.8(C-10),138.4(C-13a),134.5(C-4a),129.1(C-13b),127.3(C-13),123.9(C-12),122.0(C-12a),120.8(C-8a),112.4(C-4),112.0(C-11),108.9(C-1),62.1(C-9a),57.6(C-3a),56.8(C-2a),56.3(C-10a),56.1(C-6),27.0(C-5)。以上数据与文献[16]报道的基本一致，由此确定化合物a为巴马汀。

化合物b：ESI-MS,m/z:338[M+H]+;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6):9.71(1H,s,H-8),8.74(1H,s,H-13),8.08(1H,d,J=8.0 Hz,H-11),7.97(1H,d,J=8.0 Hz,H-12),7.63(1H,s,H-1),6.84(1H,s,H-4),4.48(2H,m,H-6),4.18(3H,s,9-OCH3),4.09(3H,s,10-OCH3),4.00(3H,s,2-OCH3),3.18(2H,m,H-5);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6):150.6(C-9),150.5(C-2),148.4(C-3),145.0(C-8),144.5(C-10),139.1(C-13a),134.2(C-12a),129.1(C-4a),126.8(C-12),123.1(C-11),122.0(C-13b),119.7(C-13),118.2(C-8a),114.7(C-4),108.8(C-1),61.3(9-OCH3),56.4(2-OCH3),56.2(C-6),55.7(10-OCH3),26.4(C-5)。以上数据与文献[16]报道的基本一致，由此确定化合物b为药根碱。

3　结　论

本研究运用pH区带逆流色谱技术成功分离了金果榄中的季铵型生物碱类化合物，通过优化，最终选用氯仿-甲醇-水(4∶3∶2)作为溶剂系统，并在上相中加入20 mmol/L盐酸作为保留剂，下相中加入10 mmol/L三乙胺作为洗脱剂，经一次pH区带逆流色谱分离，在4 h内从2 g金果榄总生物碱中分离得到巴马汀(512 mg)和药根碱(421 mg)，经HPLC分析，纯度均在95%以上。研究结果表明pH区带逆流色谱技术在分离制备中药中生物碱类化合物时，具有操作简单、快速高效、制备量大等特点，可作为中药活性成分(生物碱和有机酸)研究的有效方法进行推广。

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Preparative Separation of Palmatine and Jatrorrhizine from Tinospora Capillipes Gagnep.by pH-Zone-refined Counter-current Chromatography

LIU Qian1,2,SUN Chang-lei1,GONG Cheng-yu3,YANG Peng4,LI Da-peng2,WANG Xiao1*

(1.Key Laboratory of TCM Quality Control Technology,Shandong Analysis and Test Center,Shandong Academy of Sciences,Jinan250014,China;2.College of Food Science and Engineering,Shandong Agricultural University,Taian271018,China;3.Yantai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Yantai264000,China;4.Kangsen Sanfeng Biological Engineering Technology Co.,Jinan250014,China)

An efficient method was developed for the preparative separation of palmatine and jatrorrhizine fromTinosporacapillipesGagnep.by pH-zone-refined counter-current chromatography(CCC). The two-phase solvent system of chloroform-methanol-water(4∶3∶2) was selected,in which hydrochloric acid(20 mmol/L) was added into the upper aqueous phase as the stationary phase,and triethylamine(10 mmol/L) was added to the lower orgnic phase as the mobile phase.The apparatus was rotated at a speed of 850 r/min,while the mobile phase was pumped into the column at 2.0 mL/min.From 2 g of crude extract,512 mg palmatine and 421 mg jatrorrhizine with purities of 95.1% and 95.3% were obtained.The chemical identification of the isolated compounds was carried out by electrospray ionization-mass spectrometry(ESI-MS),1H NMR and13C NMR.The introduced method is a rapid and efficient approach for the preparative separation of palmatine and jatrorrhizine intinosporacapillipesgagnep.

pH-zone-refined counter-current chromatography;high performance liquid chromatogranphy(HPLC);palmatine;jatrorrhizine;TinosporaCapillipesGagnep.

2015-12-23；

2016-01-28

山东省科技发展计划项目(2014GZX219003)

王晓，博士，研究员，研究方向：天然产物研究与开发，Tel:0531-82605304，E-mail:wangx@sdas.org

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.021

O657.7;TQ460.72

A

1004-4957(2016)06-0748-05