稻米代谢组学分析方法的建立及在产地溯源中的应用

冯 雪，柳艳霞，贺泽英,王雯雯，赵改名*

(1.河南农业大学 食品科学技术学院，河南 郑州 450002；2.农业部环境保护科研监测所 农业部农产品质量安全环境因子风险评估实验室,天津 300191；3.安捷伦科技有限公司，北京 100102)



稻米代谢组学分析方法的建立及在产地溯源中的应用

冯 雪1,2，柳艳霞1，贺泽英2,王雯雯3，赵改名1*

(1.河南农业大学 食品科学技术学院，河南 郑州 450002；2.农业部环境保护科研监测所 农业部农产品质量安全环境因子风险评估实验室,天津 300191；3.安捷伦科技有限公司，北京 100102)

采用气相色谱-串联四极杆飞行时间质谱(GC/Q-TOF MS)建立了稻米的代谢组学分析方法，并将其应用于产地溯源。利用D-最优设计对提取溶剂进行优化，通过偏最小二乘分析法考察了不同溶剂对代谢物提取效率的影响。考察了衍生试剂种类、衍生温度及时间对代谢物检测的影响,最终确定分析条件为：甲醇-水(1∶1)为提取溶剂,N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷(MSTFA-TMCS，99∶1)于60 ℃条件下衍生1 h。选取10种代谢物考察仪器精密度、方法重现性和衍生产物稳定性，相对标准偏差(RSD)均小于9%，证明了方法的可靠性。结合Mass Profiler Professional(MPP)软件,以主成分分析(PCA)法区分黑龙江省4个地区的29个绥粳4号稻米样本，分类效果显著。对显著变化(P<0.05，倍率变化≥2)的差异性代谢物进行鉴定，确定了11种特征标记物。结果表明,利用GC/Q-TOF MS建立代谢组学分析方法，结合主成分分析鉴别稻米产地具有可行性，为大米市场的规范和资源开发利用提供了依据。

稻米；气相色谱-四极杆飞行时间质谱；代谢组学；主成分分析；产地鉴别

稻米是我国的主要粮食作物之一，近三分之二的人口以大米为主食[1]。稻米中含有丰富的蛋白质、糖类、脂肪、膳食纤维等营养成分以及大量人体必需的微量元素[2]。随着生活水平的不断提高，消费者越来越注重其风味和营养品质。大米的品质特征不仅与品种有关，还与其产地环境，包括气候、土壤、水源等条件的关系十分密切[3]，优质稻米种植的区域性特点比较明显。方正米是继辽宁盘锦米、黑龙江五常米之后，我国第3个稻米原产地域保护产品，主产品种为绥粳4号稻米[4]。为了牟取暴利，一些不法商贩假冒地理标志，损害了消费者的利益。因此，建立一种行之有效的稻米产地鉴别方法具有重要意义。

目前，国内外关于稻米产地溯源的研究主要集中在矿物元素、稳定同位素、脂肪酸、蛋白质组分以及DNA指纹的分析方面，如电感耦合等离子质谱法测定稻米中的矿物元素[5]和碳氮稳定同位素[6]，气相色谱法测定稻米中的脂肪酸组成及含量[7]，近红外光谱结合偏最小二乘模式识别法鉴别不同产地的稻米[8],生物法测定稻米的遗传物质等[9]。代谢组学是以生物样品中的低分子量代谢产物(如有机酸、脂肪酸、氨基酸、糖等)为研究对象，通过高通量检测和数据处理，进行信息整合及生物标记物鉴定的科学[10]。在衍生化的基础上利用稻米的非靶标代谢轮廓对其进行产地鉴别的研究尚未见报道。

四极杆串联飞行时间质谱仪可进行最高特异性的结构确认分析和最准确的分子式解析，适用于分析目标化合物和未知化合物，已广泛应用于代谢组学研究。本实验利用气相色谱-串联四极杆飞行时间质谱(GC/Q-TOF MS)对不同产地稻米的代谢物进行分析，考察了不同试剂对代谢物提取效率的影响,优化衍生条件，建立了稻米代谢组学分析方法，并结合主成分分析对稻米进行产地鉴别，找出特征标记物，为稻米的产地溯源和真伪鉴别提供了技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

7200 GC/Q-TOF MS(美国Agilent公司),Neoguege 23R centrifuge离心机(香港Heal Force公司)，高速台式离心机(上海安享科学仪器公司)，ULTRA-TURRAX匀浆机(美国IKA公司)，氮吹仪，旋涡混合器(美国Thermo公司)，水浴锅(北京市永光明医疗仪器厂)。

甲氧基胺盐酸盐(纯度98%)，吡啶(色谱纯)，N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA),N-甲基-N-(叔丁基二甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(MTBSTFA),含1% 叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCI)购自阿拉丁试剂有限公司(上海)；三甲基氯硅烷(TMCS)购自百灵威科技有限公司(北京)；甲醇、乙腈、丙酮购自Fisher公司(美国)。实验用水为Millipore超纯水。

绥粳4号稻米由黑龙江省农科院提供，包括方正县地标保护区域的7个样本，延寿县7个样本，虎林县9个样本，木兰县6个样本。经晾晒、脱壳、精磨、磨粉，室温风干后冷藏。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 精确称取5 g样品于100 mL离心管中，加提取溶剂20 mL，18 000 r/min高速均质2 min,离心(5 000 r/min)后取上清液400 μL至1.5 mL离心管中，加入20 μL浓度为2 mg/L的核糖醇水溶液，氮气吹干，加入100 μL甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液(20 mg/mL)，涡旋40 s，水浴加热。之后加入100 μL硅烷化衍生试剂,密封，涡旋40 s，水浴加热。衍生结束后取出离心管冷却至室温，15 000 r/min 离心5 min，取上清液转移至进样瓶中上机。

1.2.2 色谱条件 色谱柱为HP-5MS(Agilent，30 m× 250 μm × 0.25 μm)，进样模式为不分流进样，进样量1 μL，流速为1 mL/min。升温程序：初始温度 60 ℃，保持1 min，以40 ℃/min升温至120 ℃，再以5 ℃/min升温至310 ℃。载气为氦气，进样口温度280 ℃。

1.2.3 质谱条件 采用全扫描方式分析稻米的代谢物，采用EI模式采集。离子源温度280 ℃，扫描速度5 spectra/s，溶剂延迟时间3 min，质量扫描范围45～550 amu。

1.2.4 数据分析 利用Mass Hunter Unknown Analysis(Agilent，美国)软件解卷积，提取质谱信息，并与NIST14库、Fiehn库比对，对代谢物进行鉴定。使用SIMCA-P软件(V11.5，Umetrics AB，Umea，Sweden)对数据进行偏最小二乘(PLS)分析，以确定最佳提取溶剂。利用SPSS16.0对数据进行单因素方差分析确定衍生试剂种类。用Mass Profiler Professional(MPP) 软件(Agilent，美国)对数据进行主成分分析，并筛选特征标记物。

2 结果与讨论

2.1 提取方法的优化

2.1.1 提取试剂的优化 代谢组学的研究对象是生物样本中相对分子质量小于1 000的内源性小分子化合物[11]。稻米样本中的代谢物种类繁多，且含量和极性差别较大，既有极性较强的糖、氨基酸类等，又包括极性较弱的脂类、固醇类等代谢物。甲醇、乙腈、丙酮、水是代谢组学中较常用的提取溶剂，它们极性不同，且能互溶。为建立稻米的非靶标代谢轮廓分析方法，全面反映代谢物组分信息，且在提取过程中兼顾不同性质的化合物，本实验采用上述4种溶剂及其混合溶液提取稻米中代谢物，通过代谢物峰面积考察不同溶剂对稻米代谢物整体提取效率和稳定性的影响。根据D-最优设计原理，使用Modde 11.5软件(Umetrics，Sweden)对4种溶剂进行方案设计(见表1)。

表1 不同比例提取溶剂试验设计

Table 1 Experimental design of different compositions of extraction reagent

ExperimentNo．Volumeratio(methanol∶acetonitrile∶acetone∶water)ExperimentNo．Volumeratio(methanol∶acetonitrile∶acetone∶water)11∶0∶0∶0141∶1∶1∶020∶1∶0∶0155∶1∶1∶130∶0∶1∶0161∶5∶1∶140∶0∶0∶1171∶1∶5∶151∶1∶0∶0181∶1∶1∶561∶0∶1∶0191∶1∶1∶171∶0∶0∶1201∶1∶1∶180∶1∶1∶0211∶1∶1∶190∶1∶0∶1221∶0∶0∶0100∶0∶1∶1230∶1∶0∶0110∶1∶1∶1240∶0∶1∶0121∶0∶1∶1250∶0∶0∶1131∶1∶0∶1

图1 不同提取试剂的PLS分析得分图Fig.1 PLS scores plot obtained with different solvents

数据经MassHunter Unknown Analysis软件解卷积后，对筛选出的峰进行鉴定。以鉴定出的代谢物的峰面积作为数据集X，以提取溶剂不同组成作为数据集Y，利用SIMCA-P软件进行偏最小二乘分析，得到提取两个主成分的PLS模型，该模型具有较好的可解释性(R2X=0.4,R2Y=0.3)及可预测性(Q2=0.3)，可以解释30%的数据。PLS分析结果以t[1]和u[1]构建得分图(图1)，表示第一个主成分下峰面积和溶剂之间的整体对应关系。左下角的样品提取效率低，而右上角的样品提取效率高。由图1可知，各点近似呈一条45°的直线，表明代谢物的峰面积与提取溶剂之间呈现较好的相关性。结果显示，用甲醇-水(1∶1)作为提取溶剂的提取效率最高，仅用20 mL乙腈作为提取溶剂的提取效率最低。试验组平行样本的分布相对集中,表明方法的重复性较好。

图2 不同提取溶剂的PLS分析载荷图Fig.2 PLS loading plots obtained with different solvents

以第一、二个主成分得到的X、Y数据综合权重W*C[1]、W*C[2]作图，得到的PLS载荷图(图2)可以直观地表示X数据集和Y数据集之间的关联性[12]。图中小方块表示溶剂相对位置，小三角表示不同代谢物。每个方块周围的化合物表明该溶剂对这些化合物有较高的提取效率。由图可知，只有少数化合物(如图中圈出的化合物：磷酸盐、尿囊素)可以通过乙腈或丙酮的提取获得较大的峰面积，这与文献的研究结果一致[13]。靠近中心位置的化合物受混合溶剂的影响较小，大部分化合物靠近甲醇和水的位置，说明甲醇和水对这些代谢物的提取有促进作用，二者混合可得到更大的代谢物覆盖面。经鉴定，这些化合物以糖、氨基酸、有机酸为主。

图3 衍生试剂对4个稻米样本代谢物种类的影响Fig.3 Effects of different derivatization reagents on metabolites for 4 rice samples

2.1.2 衍生条件的优化 一些含有氨基、羧基、羟基等极性基团的化合物因不易挥发，易热分解而不易被GC/Q-TOF检测。在硅烷化反应过程中，含活性氢的基团会被硅烷基团所取代，衍生后的分析产物具有更高的挥发性、更低的极性和更好的热稳定性[14]。其中，MSTFA是最常用的硅烷化衍生试剂[15]，TMCS可以促进MSTFA与酰胺、仲胺以及一些与单独的MSTFA无法发生衍生反应的羟基反应。MTBSTFA可与羟基、羧基、巯基以及伯胺和仲胺发生反应，其衍生产物较MSTFA的衍生产物更稳定[16]。稻米中的代谢物种类繁多，而且含量差异较大，对分析方法的覆盖度要求较高。因此本文以4个地区的稻米样本为研究对象，比较对其进行不同衍生处理(不衍生，MSTFA衍生，MSTFA-TMCS 99∶1以及MTBSTFA衍生)所获得的代谢物数量(图3)。

由图可知，对于木兰、虎林和延寿县的稻米，用MSTFA-TMCS(99∶1)进行硅烷化所得到的代谢物数量均最多，并且与其他处理得到的代谢物数量存在显著差异。对于方正县的稻米，用MSTFA硅烷化得到的代谢物数量与MTBSTFA差异显著，但TMCS的加入对代谢物的提取并未起到明显的改善作用。不进行硅烷化衍生得到的代谢物最少，验证了硅烷化的必要性。所以实验最终选用MSTFA-TMCS(99∶1)作为硅烷化试剂。

在硅烷衍生化过程中，衍生化时间及温度对代谢物的提取效率有很大影响。为确定最佳条件，将硅烷化反应温度设为20，30，40，50，60，70，80 ℃，硅烷化反应时间为100 min，考察温度对总相对峰面积和代谢物数量的影响；将硅烷化反应时间设为10，20，40，60，80，100，120，140 min，硅烷化反应温度为60 ℃，考察总相对峰面积和代谢物数量随时间的变化情况。

图4 方正米的总离子流色谱图Fig.4 Total ion chromatogram(TIC) of rice from Fangzheng

结果表明，随着衍生温度的升高，总相对峰面积和代谢物数量先增加后减小，在60 ℃时达到最大值。随着衍生时间的增加，代谢物总数和总相对峰面积呈先增加后趋于平稳的趋势，在60 min时，二者达到最大值，说明此时已达到最好的衍生效果。最终确定将各样品于60 ℃条件下硅烷化衍生60 min。

2.2 方法学考察

典型的稻米总离子流色谱图如图4所示。经解卷积、谱库检索后确定的代谢物种类包括糖、脂肪酸、有机酸、氨基酸、甾体等。选取甘醇酸、亮氨酸、丝氨酸等10种匹配度较高的代谢物进行方法学考察。以相对响应因子(代谢物峰面积与内标峰面积的比值)为指标，考察方法重现性(同一样本取5份制样上机)、仪器精密度(样品溶液连续重复上机5次)及衍生产物稳定性(样品溶液于-20 ℃下储存，分别于0，6，12，24，36，48 h检测)，结果如表2所示。各代谢物的精密度、重现性及稳定性良好，相对标准偏差(RSD)均小于9%,满足生物样本的分析要求。

表2 方法重现性、仪器精密度以及衍生产物的稳定性

Table 2 Reproducibility，precision of the method and stability of the derived products

Retentiontime(min)CompoundReproducibility(RSD/%)Precision(RSD/%)Stability(RSD/%)502Glycolicacid(甘醇酸)532989515Leucine(亮氨酸)361326627Serine(丝氨酸)611536746Uracil(尿嘧啶)264048812Malicacid(苹果酸)781432831Threonine(苏氨酸)513860960Cyclamicacid(环拉酸)4226511038Sinapicacid(芥子酸)3516431494Arabinitol(阿拉伯糖醇)4839651942Mannitol(甘露糖醇)3410562468Maltitol(山梨糖醇)281668

2.3 稻米代谢组学分析方法在产地溯源中的应用

图5 4个不同产地稻米的PCA得分图Fig.5 Score plot of rice from 4 different geographical origins

主成分分析可对数据进行降维，消除众多信息中重叠的部分，进而用少数因子解释原始数据中的大部分信息，区分变量间的相似度和差异[17]。4个地区29个稻米样本的数据经Mass Hunter Unknown Analysis软件解卷积后，利用MPP软件对数据进行主成分分析。图5结果显示，29个稻米样本明显分为4类，且每个地区样本的聚合度较好。主成分PC1，PC2，PC3的累计贡献率达83.41%。对显著变化(P<0.05，倍率变化≥2)的代谢物进行初步鉴定，确定了11种对化学组成上的产地区分有较大贡献的特征标记物，结果如表3所示。其中鉴定出的代谢物有8种，分别为芥子酸、肌醇、十八碳烯酸、维生素E、亚油酸单甘油酯、蔗糖、麦芽糖、海藻糖，根据文献报道进一步确定这些化合物为稻米中的内源代谢物[16，18]，其余3个化合物有待进一步鉴定。

表3 差异性代谢物的鉴定

Table 3 Identification of differential compounds

NumberRetentiontime(min)CompoundMatchfactor11038Sinapicacid(芥子酸)884222233Inositol(肌醇)960132275Unknown(未知)42418Octadecenoicacid(十八碳烯酸)864552538Unknown(未知)63240Tocopherol(维生素E)879273255Glyceryllinoleate(亚油酸单甘油酯)926883278Sucrose(蔗糖)901593489Maltose(麦芽糖)9367103627Trehalose(海藻糖)9637113717Unknown(未知)

3 结 论

本文通过对稻米代谢物的提取试剂、衍生条件进行优化，建立了基于GC/Q-TOF MS技术的稻米代谢轮廓的分析方法。最终确定代谢物的最佳提取溶剂为甲醇-水(1∶1),硅烷化衍生条件为：MSTFA-TMCS(99∶1) 60 ℃条件下衍生1 h。方法学考察结果证明，该法具有良好的精密度、重现性以及稳定性。在此基础上，利用主成分分析建立了不同产地稻米的鉴别方法，实验结果显示，方正县及其周边的延寿、木兰、虎林县4个产地的稻米在PCA分析中存在明显差异，并鉴定出11个特征标记物。本实验所建分析方法及产地鉴别模型仅通过少量稻米样本获得，其稳定性和代表性有待进一步探索验证。在今后的研究中，将进一步扩大产地范围，增加样本数量，得到更科学的溯源体系，并从机理层面研究产地和年际对稻米中代谢物种类及含量的影响，进一步完善稻米产地溯源技术。

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Development of an Analysis Method of Metabolomics in Rice and Its Application in Geographic Authenticity

FENG Xue1,2，LIU Yan-xia1，HE Ze-ying2，WANG Wen-wen3，ZHAO Gai-ming1*

(1.College of Food Science & Technology，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China；2.Laboratory of Environmental Factors Risk Assessment of Agro-product Quality Safety，Agro-environmental Protection Institute， Ministry of Agriculture，Tianjin 300191，China；3.Agilent Technologies(China) Company，Ltd.，Beijing 100102，China)

An effective method was established for the analysis of metabolomics in rice from different geographical origins by gas chromatography-quadrupole time-of-flight-mass spectrometry(GC/Q-TOF MS)，and was applied in geographic authenticity identification of rice.D-optimal experimental design was used to optimize the different extraction solvents，and the extraction efficiency was evaluated by partial least squares(PLS).Effects of derivatization reagents，derivatization temperature and time on the analysis of metabolites were investigated.The best result was obtained using methanol-water(1∶1) as extraction reagent，and derivatizing with N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide-trimethylchlorosilane(MSTFA-TMCS,99∶1) at 60 ℃ for 1 h.10 highly matched metabolites were selected to assess the precision，reproducibility of the method and the stability of derived products.Satisfactory results were obtained with relative standard deviations(RSD) lower than 9%，confirming reliability of the method.Principal component analysis(PCA) prediction model was establised by mass profiler professional(MPP) to classify the Suijing 4 rice from four different geographical origins in Heilongjiang Province，and the results showed that samples from different places clustered into four different groups significantly.11 differential compounds were determined，which satisfiedP<0.05 and a fold change cut-off ≥2.This demonstrates the feasibility of the developed analysis method in rice by GC/Q-TOF MS and its application in geographic authenticity identification of rice combined with PCA analysis.The method could provide a scientific basis for the standardization of rice market and the utilization of the resources.

rice；gas chromatography-quadrupole time-of-flight-mass spectrometry(GC/Q-TOF MS)；metabolomics；principal component analysis(PCA)；geographic authenticity

2015-09-14；

2015-11-18

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.05.003

O657.71；TS213.3

A

1004-4957(2016)05-0514-06

*通讯作者：赵改名，博士，教授，研究方向:肉类加工与产品质量控制技术，Tel:0371-63558150，E-mail:gmzhao@126.com