水热法新型水溶性荧光碳点的制备及其性能研究

夏 旭，刘春花，周爱梅*，贺丽苹，刘 欣，曹 庸

(1.华南农业大学 食品学院，广东 广州 510642；2.广东省天然活性物工程技术研究中心，广东 广州 510642)



水热法新型水溶性荧光碳点的制备及其性能研究

夏 旭1，2，刘春花1，2，周爱梅1，2*，贺丽苹1，2，刘 欣1，2，曹 庸1，2

(1.华南农业大学 食品学院，广东 广州 510642；2.广东省天然活性物工程技术研究中心，广东 广州 510642)

以阿拉伯糖和磷酸酪蛋白肽进行水热反应，制备水溶性多色荧光碳点，利用透射电子显微镜(TEM)、紫外吸收光谱(UV)、荧光光谱(FL)、红外光谱(FTIR)和X射线衍射(XRD)等对所制备碳点的粒径大小、吸收光谱、发光性质、表面基团等进行表征，并考察了其性能和对不同金属离子的识别作用。结果表明：制备的荧光碳点平均粒径为4.62 nm，其紫外最大吸收波长为281 nm，XRD峰值约为21°，可在紫外灯下发出明亮的荧光，最大发射波长为414 nm，且呈荧光多元发射。红外光谱分析表明存在—COOH,—NH2和—OH 基团。该荧光碳点具有良好的性能，且对Cu2+和Fe3+有较强的选择性识别作用，其原因可能是荧光碳点的聚合导致粒径增大从而使荧光强度减弱。该碳点有望作为荧光探针用于检测分析和生物成像等领域。

碳点；荧光性能；荧光探针；金属离子

碳点(Carbon dots，CDs)又称碳量子点，是近年发现的一种新型的零维纳米材料[1]，因具有尺寸可调、抗光漂白性强、荧光稳定性高、无“光闪烁”现象、合成简单、生物相容性好和毒性低等优点[2-3]，有望取代量子点(Quantum dots)在生物医学和生化分析检测等领域的应用。

在金属离子分析检测领域，众多研究报道表明不同的反应前体和制备方法产生的碳点性质不一，可能由于表面状态的不同，对金属离子的选择性也有很大的差异[4-12]。如Liu等[6]以草为原料，采用水热法制备的碳点对Cu2+具有很好的特异性，铜离子能有效猝灭碳点荧光。Qu等[8]以柠檬酸和尿素为原料用微波法制备的碳点，以及Liu等[9]以蔗糖为碳源和乙二醇在微波条件下反应制备的碳点，均对Fe3+有特异选择性。 Zhu等[11]以柠檬酸和乙二胺为原料，采用水热法制备的碳点对Fe3+具有很好的选择性，但Fe2+，Zn2+，Cu2+，Co2+，Pb2+和 Hg2+对其荧光有一定的猝灭作用。Li等[12]以蚕丝为原料水热制备的碳点对Hg2+和Fe3+有特异选择性。碳点检测金属离子的原理是基于碳点表面的功能性基团与金属离子相互作用，从而导致碳点荧光强度发生变化。利用金属离子与碳点的选择性作用引起荧光猝灭或荧光增强的变化，可以建立金属离子浓度与荧光强度的关系，从而实现碳点对金属离子的定性或定量检测。

本研究首次以阿拉伯糖和磷酸酪蛋白肽进行水热反应，制备水溶性碳点。磷酸酪蛋白肽作为一种含有磷酸丝氨酸簇的多肽，其分子中含有丰富的氨基，可与阿拉伯糖中的羰基在高温水热反应中发生缩合反应，进而生成具有光致发光性质的碳点。实验制得的荧光碳点具有良好的荧光性质，有望用于金属离子检测以及生物成像等领域。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

磷酸酪蛋白肽(CPP，≥96%，广州绿翠生物科技有限公司)；D-阿拉伯糖(上海伯奥生物科技有限公司)；硫酸奎宁(阿拉丁试剂有限公司)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)、硝酸铅、硝酸铝、硝酸钙、硝酸银、无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯化钠、磷酸、乙酸、硼酸、硝酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、氯化铁、氢氧化钠、硫酸(98%)、HCl等其他试剂均为市售分析纯。

聚四氟乙烯内衬水热合成釜(郑州合众仪器有限公司)，VERTEX 70傅立叶变换红外光谱仪(德国Bruker公司)，AL104万分之一分析天平(瑞士Mettler公司)，214116C型马弗炉(Fisher公司)，RF-5301荧光分光光度计(日本岛津公司)，PB-10pH计(德国Sartorius公司)，2300型多功能酶标仪(美国PE公司)，UV-1750紫外-可见分光光度计(日本Shimadzu公司)，KQ-500B超声仪(昆山市超声仪器有限公司)，Centrifuge 5415 R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)，MSALXD-2型X射线衍射仪(北京普析通用仪器有限公司)，Tecnai 12透射电镜(荷兰FEI公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 碳点的制备 称取0.08 g阿拉伯糖、0.05 g磷酸酪蛋白肽溶于30 mL蒸馏水，用1 mol/L NaOH溶液调至pH 9.0，加入50 mL聚四氟乙烯内衬水热合成釜中，置于马弗炉中于180 ℃水热反应3 h；反应结束后，得到黄褐色澄清溶液，产物经12 000 r/min离心后，取上清液过0.22 μm滤膜，即得分散均一、水溶性良好的碳量子点溶液。

1.2.2 荧光量子产率的测定与计算 采用参比法测定并计算荧光碳点的量子产率[12]。具体操作如下：将硫酸奎宁配成0.1 mol/L的硫酸溶液(量子产率为0.54，溶剂的折射率为1.33)，再用0.1 mol/L硫酸稀释至合适的浓度，在狭缝1 nm、吸收池光程10 mm的条件下进行吸收光谱扫描，记录350 nm下的吸光度值，碳点胶体溶液则用水稀释(折射率η为1.33)；然后在350 nm激发，激发狭缝为10 mm，发射狭缝为20 nm，在390～580 nm范围内进行发射光谱扫描，记录测得荧光发射峰的积分面积。分别配制5个适当浓度梯度的碳点胶体溶液和硫酸奎宁溶液标准系列，使两者的吸光度相近且不大于0.10。根据碳点胶体溶液和硫酸奎宁溶液在350 nm激发波长下的荧光光谱，计算给定波长范围内的荧光积分面积。根据荧光积分面积和吸光度进行线性拟合，得到硫酸奎宁标准物及待测样品的拟合直线斜率。要求所得线性拟合直线的相关系数(r2)接近1。待测碳点的量子产率按式(1)计算:

(1)

式中，x和s分别代表待测碳点和硫酸奎宁参比溶液，φ表示量子产率；Grad表示荧光积分面积和吸光度对应直线的斜率；η代表溶剂的折射率。

2 结果与讨论

2.1 碳点的表征

2.1.1 紫外-可见光谱与荧光光谱 与文献报道类似[13]，碳点的水溶液在281nm处观察到典型的芳香烃吸收峰(见图1A)，这类似于多环芳烃。Bourlions等[14-15]提出碳点发光是由于出现多种芳香化合物所致，这一理论认为有机物热分解过程中会出现碳原子重新组合，形成多环芳香化合物，从而引起发光。

图1 碳点胶体溶液的紫外-可见光谱图(A)及荧光光谱图(B)

Fig.1 UV-Vis absorption(A)and fluorescence(B) spectra of the CDs

碳点的荧光发射光谱如图1B显示，在302～482 nm 波长范围内，碳点可被激发而发出荧光，且荧光强度随激发波长的增加呈先上升(302～342 nm)后下降的趋势，最大激发波长为342 nm，最大发射波长为414 nm，这与紫外灯下碳点发射明亮蓝色荧光一致。此外，碳点的发射波长随着激发波长的增加而逐渐红移，表现出典型的碳点的“荧光红移现象”，呈现多元激发、多元发射的光谱特性，这些特性与文献报道[16]相符。这可能是由于碳原子发生重新排列组合形成多环芳烃共轭体系[14]以及碳点表面发射位点不同和制备过程中不均匀纳米粒径的量子尺寸效应等所造成[17]。在生物成像应用中，可借助激发光波长的改变实现多色发光，从而有利于其在生物成像中的应用。

2.1.2 高分辨率透射电镜分析 碳点的高分辨透射电子显微镜(HRTEM)图像表明，本研究所制备的碳点表现为相对均一的球形颗粒，且碳点的粒径呈近正态分布，纳米碳点的直径尺寸80%集中分布在3～6 nm之间，平均粒径约4.62 nm(图2)。

Fig.2 HRTEM images(A) and size distribution(B) of CDs insert:photographs of the solution of CDs taken under visible light(left) and ultraviolet light(right)

图3 磷酸酪蛋白肽(a)、阿拉伯糖(b)以及碳点(c)的红外光谱图Fig.3 FTIR spectra of casein phosphopeptides(a)，arabia sugar(b)and carbon dots(c)

图4 碳点的X射线衍射图Fig.4 XRD pattern of carbon dots

图5 pH值对碳点荧光性能的影响Fig.5 Effect of pH value on fluorescence intensity of carbon dot excitation at 402 nm；emission at 496 nm

该碳点形成的反应机理可能是：在水热高温高压条件下，阿拉伯糖分子间发生脱水聚合，生成的线状或枝状寡聚糖。随着反应的进行，生成的线状或枝状寡聚糖与磷酸酪蛋白肽发生美拉德反应生成含氮聚合物，线状或枝状的含氮聚合物将进一步发生分子间脱水，相互交联而引发爆发式的迅速成核。最后，碳核和亲水性表面通过脱水分别进一步重排形成芳环或多糖，原料经过一定程度的交联不完全碳化得到荧光碳点粒子。所形成的碳点粒子表面具有很多缺陷能带和—COOH及—OH等基团。碳点的生长机制与曲晓刚[22]、孙旭平课题组[23]之前的报道相似，也与Bourlions等[14]的碳原子重新组合理论相符。

2.2 碳点的性能研究

除了碳点的光谱特性外，为了进一步研究碳点的性能，实验考察了碳点在不同条件下的荧光特性。结果表明，碳点具有良好的水溶性和光稳定性，碳点胶体溶液在紫外线下持续暴露180 min，荧光强度几乎无变化，这表明该碳点具有良好的抗光漂白能力。其次，研究发现该碳点胶体溶液在不同的氯化钠浓度(0～1.0 mol/L)下荧光强度基本保持不变，说明该碳点还具有良好的抗盐能力，这有利于碳点在生物方面的应用。但在研究pH值对碳点荧光性能的影响(图5)时发现，当pH 值从3.0增至12.0时，碳点的荧光强度基本趋于稳定，而当pH值大于12.0或小于3.0时，荧光强度受到显著影响。这可能是由于在强酸或者强碱性条件下，碳点表面的功能基团—OH，N—H和—COOH 等之间发生相互作用，引起碳点聚集而导致荧光猝灭[20]。此外，实验还比较了水、乙醇、丙酮和乙酸乙酯等溶剂对其荧光强度的影响，研究发现不同的溶剂对其荧光强度有一定的影响，这种溶剂效应可能是由不同溶剂对碳点的表面发射能阱影响不一所致[21]。

图6 不同金属离子对碳点荧光强度的影响Fig.6 Fluorescence response of CDs to various mental ions λex=402 nm；[Mn+]=50 mg/L；pH 7.5;F0 and F are CDs fluorescence intensities at 496 nm in the absence and presence of ions，respectively

图7 CDs-Cu聚合物的高分辨透射电镜照片Fig.7 HRTEM images of CDs-Cu aggregation

2.3 不同金属离子对碳点的影响

在相同实验条件下，考察了不同的金属离子(Ca2+，Ag+，Zn2+，Mg2+，Al3+，Pb2+，Fe3+，Mn2+和Cu2+)对碳点荧光强度变化(F/F0)的影响(图6)，结果发现 Ca2+，Ag+，Zn2+，Mg2+，Al3+和Pb2+对荧光强度的影响很小，Mn2+对其有一定的影响，但Cu2+和Fe3+对碳点荧光强度的影响最为显著，分别达到82%和65%。表明所制备的碳点对 Cu2+和Fe3+比其他金属离子具有更高的选择性。磷酸酪蛋白肽因其对钙离子等的螯合作用，广泛应用于食品领域中。在本实验中发现碳点对Cu2+和Fe3+有特异性，但对Ca2+却没有，可能是因为在碳点的合成过程中磷酸酪蛋白肽和阿拉伯糖发生了美拉德反应，碳原子重排，作为多肽分子存在时的活性中心磷酸丝氨酸基团被破坏或并未存在于碳点的表面。

碳点的表面状态不同，对金属离子的选择性也有很大差异。本实验中所制备得到的碳点粒子可能由于表面具有丰富的—COOH和—OH等基团，从而对Cu2+和Fe3+等离子存在较强的选择性。研究中对碳点胶体溶液与金属Cu2+反应后产物进行了收集表征，结果发现碳点发生了显著的聚合现象(如图7)，聚合物的粒径分布在15～52 nm之间，从而也证明了Cu2+的猝灭机理可能是金属离子或金属离子氢氧化合物易与碳点表面某些特异性的基团(如羧基等)结合，导致碳点发生聚合[24]，粒径增大进而导致荧光猝灭。利用碳点的这种特性，可用作荧光探针用于定性或定量检测溶液中的Cu2+和Fe3+。

3 结 论

本研究首次以阿拉伯糖和磷酸酪蛋白肽为碳源，经水热法成功制备了荧光碳点。所制备的荧光碳点平均粒径约为4.62 nm。在紫外光的激发下，碳点胶体溶液会发出明亮的肉眼可见荧光，且荧光光谱会随着激发光谱的红移而红移。利用紫外光谱，红外光谱和XRD等综合手段表征，结果表明在碳点的制备过程中，碳点可能进行了芳环化碳原子重排，碳点的部分基团被氧化，因此表面存在着丰富的—OH和—COOH等含氧基团。进一步研究碳点的性能时发现该碳点具有良好的抗盐以及抗光漂白性，该碳点在pH 3.0～12.0范围内也显示了良好的荧光稳定性，且不同溶剂对该碳点的荧光性能有一定的影响。此外，研究发现所制备的碳点对Cu2+和Fe3+等金属离子具有较强的选择性，可能是因为Cu2+等离子会引起碳点的聚合导致碳点粒径增大，从而导致荧光强度减弱。研究结果表明，本文制备的荧光碳点有望作为荧光探针用于检测分析和生物成像等领域。

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Study on Preparation and Properties of Water Soluble Fluorescent Carbon Dots by Hydrothermal Method

XIA Xu1，2，LIU Chun-hua1，2，ZHOU Ai-mei1，2*，HE Li-ping1，2，LIU Xin1，2,CAO Yong1，2

(1.College of Food，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2.Guangdong Research Center for Engineering Technology in Bioactive Natural Products，Guangzhou 510642，China)

The water soluble carbon dots were prepared by hydrothermal reaction with arabia sugar and casein phosphopeptides.Transmission electron microscopy(TEM)，ultraviolet absorption spectroscopy(UV)，fluorescence spectroscopy(FL) and infrared spectroscopy(FTIR) and X-ray diffraction(XRD) were used to characterize the particle size，absorption spectra，luminescence properties and surface groups of the carbon dots.The FL intensity changes in the presence of representative metal ions under the same conditions were investigated to evaluate the selectivity of the carbon dots.The results showed that the average particle size of the fluorescent carbon dots is 4.62 nm,and its maximum absorption wavelength is 281 nm.The fluorescent carbon dots could emit bright fluorescence in the ultraviolet light with maximum emission wavelength of 414 nm.The carbon dots have good water solubility，and the fluorescence emission spectrum is red shift with the increase of the excitation wavelength.FTIR spectra analysis revealed the presence of —COOH，—NH2and —OH groups are on the surface of the carbon dots，and the XRD peak is about 21°.Tremendous FL intensity decrease was observed by addition of Cu2+and Fe3+.The reason may be that the ions caused the aggregation of the fluorescent carbon dots，leading to the decrease of fluorescence intensity.The carbon dots are expected to be used as a fluorescent probe for analysis and biological imaging.

carbon dots；fluorescence property；fluorescent probe；metal ion

2015-10-15；

2015-11-30

广东省教育厅科研项目(平台)(2013gjhz0003)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.05.004

O657.3；O613.7

A

1004-4957(2016)05-0520-06

*通讯作者：周爱梅，副教授，研究方向：食品化学与营养及水产品加工，Tel：020-85286234，E-mail：zhouam@scau.edu.cn