一种新型PDE-5抑制剂衍生物的发现及结构鉴定

马春艳，段 琼，封淑华

(河北省药品检验研究院,河北 石家庄 050011)



一种新型PDE-5抑制剂衍生物的发现及结构鉴定

马春艳，段 琼，封淑华*

(河北省药品检验研究院,河北 石家庄 050011)

基于超高效液相色谱电喷雾四极杆飞行时间串联质谱联用(UPLC-DAD-QTOF-MS)技术检出某保健酒中非法添加了一种磷酸二酯酶-5(PDE-5)抑制剂衍生物，经制备液相色谱分离纯化，采用UPLC-DAD-QTOF-MS、核磁共振(NMR)和红外光谱(IR)技术对其进行了分析和结构鉴定，确定其为一种新型艾地那非衍生物，国内外均未见报道。

磷酸二酯酶-5(PDE-5)抑制剂衍生物；UPLC-QTOF-MS；NMR；IR；结构鉴定

磷酸二酯酶-5(PDE-5)抑制剂是一类应用广泛的治疗男性勃起功能障碍(ED)类药物，临床用药主要有西地那非、伐地那非和他达拉非3种。一些不法分子为了谋取暴利，利用人们相信中药和保健品是纯天然无毒副产品、可长期服用的心理，在中成药和保健食品中非法添加PDE-5抑制剂类化合物，对服用者安全造成严重隐患。国家食品药品监督管理局于2009年颁布了补肾壮阳类中成药中11种PDE-5抑制剂的检验方法，然而不法分子为规避技术监管，新型的PDE-5抑制剂衍生物层出不穷，而检验方法明显滞后，在监督检验中极易造成“假阴性”的结果。

随着对PDE-5抑制剂衍生物的不断研究，新发现的PDE-5抑制剂衍生物[1-6]越来越多。目前已报道的PDE-5类化合物主要是在西地那非、他达拉非、伐地那非、红地那非、艾地那非等化合物的官能团上进行结构修饰而得到的相应衍生物，如硫代西地那非是西地那非嘧啶环上的氧被硫取代，氨基他达拉非是他达拉非吡嗪环氮上的甲基被氨基取代，N-去乙基伐地那非是伐地那非哌嗪环氮上的乙基被消去，羟基红地那非是红地那非哌嗪环氮上的乙基被羟基乙基取代，苯丙氧基艾地那非是艾地那非苯环上的乙氧基被丙氧基取代。结构修饰呈多样化趋势，在监督检验中易发生漏检现象。笔者团队采用UPLC-DAD-QTOF-MS技术，在宣称具有壮阳作用的某保健酒中发现一种新型艾地那非类化合物，经制备液相色谱分离纯化后，进行紫外光谱、质谱、红外光谱和核磁共振光谱解析，确认为一种新型PDE-5抑制剂衍生物，目前国内外均未见报道。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

AB TripleTOF®5600+高分辨四极杆飞行时间质谱(美国AB公司)，岛津LC-30A超高效液相色谱仪(日本岛津公司);Waters制备液相色谱(美国Waters公司)；AVANCE-600超导核磁共振仪(瑞士布鲁克公司)；NICOLET iS 50 FT-IR傅立叶变换红外光谱仪(美国Thermofisher公司)；甲醇(色谱纯，Merck公司),乙酸(色谱纯，Fisher公司)，乙酸铵(Sigma公司，纯度≥99.99%)，实验用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。样品为购自超市的某保健酒。

1.2 UPLC-DAD-QTOF-MS检测条件

Shimadzu Shim-pack XR-ODS色谱柱(100 mm×2.0 mm,2.2 μm)，流动相为含0.1%乙酸的0.01 mol/L 乙酸铵溶液(A)-乙腈(B)。梯度洗脱程序：0～8 min，27%B；8～18 min，27%～80%B；18～20 min，80%B；20～21 min，80%～27%B；21～25 min，27%B。流速0.3 mL/min；波长扫描范围200～400 nm。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描，扫描方式：一级质谱全扫描，扫描范围为m/z100～1 000；二级质谱全扫描，扫描范围为m/z40～1 000。离子源参数：雾化气为高纯氮气，GS1为55 psi，GS2为55 psi，CUR GAS为30 psi，离子源温度(550 ℃)，电喷雾电压为5 500 V，去簇电压为80 V，碰撞能量为24 V。CDS自动校准(校准液为AB公司APCI positive calibration solution)。

1.3 制备HPLC条件

SunFire Prep C18OBD制备色谱柱(19 mm ×100 mm,5 μm)；流动相为甲醇-水，流速为10 mL/min，紫外检测器，波长为230 nm，进样量为200 μL。

1.4 NMR条件

溶剂为氘代氯仿(CDCl3)，内标为四甲基硅烷(TMS)，测试温度为298.5 K,1H NMR共振频率为 600 MHz,13C NMR共振频率为 150 MHz。

1.5 IR条件

溴化钾压片，扫描范围为4 000～400 cm-1。

1.6 样品制备

1.6.1 UPLC-DAD-QTOF-MS 精密吸取保健酒样品1 mL，置于50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

1.6.2 制备HPLC 取保健酒适量进行旋蒸浓缩，当残留溶剂约为5 mL时过滤进样，收集主成分色谱峰，减压蒸发除去溶剂，即得纯化物。

1.6.3 NMR 取制备得到的纯化物约15 mg，用0.5 mL氘代氯仿溶解至核磁共振测试管中。

1.6.4 IR 取制备得到的纯化物约5 mg，与适量KBr混匀，研细，压片。

2 结果与讨论

2.1 UPLC-DAD-QTOF-MS分析

按国家药品检验补充检验方法和检验项目批准件(批准件编号2009030)及参考文献[7-15]，建立了UPLC-DAD-QTOF-MS检测缓解体力疲劳及补肾壮阳类药物PDE-5 抑制剂数据库，通过特征碎片离子筛查，发现该保健酒样品中有一响应较高但准分子离子峰与数据库不匹配的未知峰(见图1)，其紫外吸收光谱图与西地那非和艾地那非有一定的相似度。此未知峰的[M+H]+精确分子量为531.274 6，同位素丰度比m/z531∶532∶533∶534=100∶31.59∶14.95∶1.3；其m/z小于300的碎片离子与西地那非及艾地那非基本一致，其中包含有m/z113艾地那非(衍生物)的特征碎片离子，因此综合未知物的紫外光谱和一级、二级质谱信息，推断该未知物为艾地那非衍生物。

图1 未知物的图谱Fig.1 Spectrum of unknown compound

综合同位素、精确分子量以及碎片离子信息分析，通过Formulafinder软件，筛查出其分子式为C26H38N6O4S，此化合物的同位素相对丰度比理论值为m/z531∶532∶533∶534=100∶32.49∶10.34∶2.18，实验值与理论值基本一致，匹配度达97.1%。该衍生物比艾地那非(C23H32N6O4S)多3个CH2单元，比文献[3]报道的丙氧基苯基艾地那非Propoxyphenyl aildenafil(C24H34N6O4S) 多2个CH2单元(见图2)。经质谱图比对，发现该衍生物除本身的准分子离子峰m/z531([M+H]+峰)外，其它离子碎片与Propoxyphenyl aildenafil基本一致(见表1),由此推测该衍生物是在Propoxyphenyl aildenafil基础上(结构见图3)进行了结构改造。

图2 艾地那非和propoxyphenyl aildenafil[3]的二级质谱图Fig.2 MS2 spectra of aildenafil and propoxyphenyl aildenafil[3]

图3 西地那非、艾地那非、propoxyphenyl aildenafil[3]的分子结构Fig.3 Molecular structures of sildenafil,aildenafil and propoxyphenyl aildenafil[3]

Table 1 UPLC-QTOF-MS data for sildenafil,aildenafil,propoxyphenyl aildenafil[3]and unknown

NameFormulaExtractionmass(Da)Foundatmass(Da)Error(ppm)MS2SildenafilC22H30N6O4S475212247521220475，311，299，283，254，99AildenafilC23H32N6O4S4892278489228921489，432，377，311，299，283，254，166，113，99Propoxyphenylaildenafil[3]C24H34N6O4S50324355032418-34503，391，325，299，283，113，99UnknownC26H38N6O4S53127485312745-06531，503，391，325，311，299，283，254，166，113，99

2.2 NMR结构解析

2.2.1 氢谱信号峰的解析 由质谱分析可知未知物的元素组成为C,H,O,N,S 5种元素，其分子式为C26H38N6O4S。核磁共振谱有一维谱图(1H NMR,13C NMR,DEPT135,DEPT90)和二维谱图(1H-1H COSY,HMQC,HMBC)，具体图谱见图4。

图4 未知物的核磁共振图谱

Fig.4 NMR spectra of unkonwn compounds

13C谱显示未知物含23个C，结合DEPT135可知，此化合物含有8个季C,由其分子式为C26H38N6O4S分析，可得出该化合物含有3组对称C原子；由1H谱可知，δ8.13(s,1H)、δ7.75(d,1H)、δ7.09(d,1H)、δ4.69(q,2H)、δ4.24(s,3H)、δ4.06(t,2H)、δ3.63(d,2H)、δ2.99(m,4H)、δ1.89(m,4H)、δ1.80(m,2H)、δ1.50(t,3H)、δ1.03(m,12H)，共37个氢，含1个活泼氢。氢信号峰的分析见表2。

表2 氢谱信号峰的分析

Table 2 Analysis of1H NMR data

1HNMR(ppm)1H-1HCOSY(ppm)HMQC(ppm)13CDEPT135Structureδ813δ775δ13185CH(15)δ775δ813，δ709δ12993CH(17)δ709δ775δ11264CH(18)δ424-δ385CH3(10)-X1-CH3δ469δ150δ628CH2(a)-X2-CH2CH3δ150δ469δ144CH3(b)δ406δ180δ704CH2(20)-X3-CH2CH2CH3δ180δ406，δ103δ224CH2(21)δ103δ180δ106CH3(22)δ299δ189δ279CH2(11)-CH2CH2CH3δ189δ299，δ103δ225CH2(12)δ103δ180δ141CH3(13)δ362[2]，δ189δ189，δ362δ528CH2(25，29)δ299δ362，δ102δ503CH(26，28)δ103δ299δ193CH3(30，31)

[2]分析认为，δ3.62与δ1.89处质子数为4的多重峰，H-H COSY显示此两组峰互为强相关，HMQC谱、碳谱、DEPT谱显示该峰与亚甲基谱线δ52.8直接相关，即该碳谱包含两个亚甲基碳，此两个亚甲基处于对称的结构上。其氢谱化学位移不一致是因为亚甲基处于环上的结构位置，直立键氢与平伏键氢的空间化学环境不同使得氢谱上的化学位移不同，所以归属为25和29位亚甲基。

2.2.2 季碳谱信号峰的解析 季碳信号峰的归属见表3。

表3 季碳信号峰的分析

Table 3 Analysis of13C NMR data

13CNMR(ppm)HMBC(ppm)13CStructureδ1607δ709(18)，δ406(20)，δ813(15)，δ775(17)C(19)δ1557δ469(a)，δ424(10)C(7)δ1462δ299(11)C(9)δ1444δ299(11)，δ189(12)，δ424(10)C(3)δ1553δ469(a)，δ813(15)，δ709(18)C(5)δ1211δ424(10)C(8)δ1266δ709(18)，δ813(15)，δ775(17)C(14)δ1296δ813(15)，δ775(17)，δ709(18)C(16)

图5 NMR的解析结构图Fig.5 Structure of NMR analysis

综上分析，此化合物含有两个结构片段，片段1(结构B)与片段2(结构C)。依据元素价键理论分析，X1与3位C间应有一杂原子X6；9位C与5位C间有一杂原子X7相连，如图5所示结构D，从质谱分析可知X1，X6，X7在S，O，N中选择N原子最为合理。

2.3 IR解析

通过红外光谱图可确定此未知物存在的一些官能团(见表4)。因此由25位氢δ值为3.62，26位氢δ值为2.99可知，24位所连官能团为磺酰基；片段1中X4应为N元素，所连基团为N—SO2—R；片段1与片段2通过磺酰基相连；X5为N元素所连活泼氢，因此可确定该未知物的结构，其分子式为C26H38N6O4S。通过与艾地那非的结构进行比对，发现此化合物为艾地那非19位上的乙氧基被丙氧基取代，6位N原子上的活泼氢被乙基取代后的衍生物。与Propoxyphenyl aildenatil的结构进行比对，则此化合物为Propxyphenyl aildenatil 6位N原子上的活动氢被乙基取代后的衍生物。

表4 红外光谱数据分析

Table 4 Analysis of IR data

σ/cm-1VibrationFunctiongroup2961～2874亚甲基、甲基的C—H伸缩振动亚甲基和甲基1457C—H的变形振动亚甲基和甲基1647C‖O伸缩振动酰胺1608C‖N的振动氮杂环1576，1505苯环骨架中C‖C振动苯环1417氮甲基(N—CH3)的振动吸收氮甲基1318酮基的不对称吸收磺酰基1264不饱和醚键(‖C—O—)的振动吸收不饱和醚键1163磺酰基(RSO2—N—)的振动吸收磺酰基

3 结 论

本文通过建立的UPLC-DAD-QTOF-MS检测方法和数据库，发现某保健酒中未知物的二级碎片中有PDE-5抑制剂的特征碎片，其紫外吸收光谱与西地那非、艾地那非相似，且实验获得的同位素丰度比与Formulafinder软件筛查出的分子式(C26H38N6O4S)理论值基本一致，从而确定了分子元素组成。再进一步用制备液相色谱进行了分离纯化，将得到的纯化品进行NMR和IR分析，最终确定未知物的结构。此未知物是在艾地那非的基础上进行了结构修饰：19位上的乙氧基被丙氧基取代，6位N原子上的活泼氢被乙基取代，此未知物为一种新型艾地那非衍生物，国内外均未见报道。此种结构修饰的PDE-5抑制剂是非法添加的新趋势，应引起足够的重视。

近年来，不法分子为逃避监管，采用高科技造假，检验机构不断检出新型PDE-5抑制剂，综合分析近年来PDE-5抑制剂衍生物的种类，常见在O和N上进行结构修饰，通常为短链的甲基、乙基、丙基取代，因此当准分子离子峰不同，但二级碎片中出现PDE-5抑制剂的基本母核的特征碎片时，应给予特别的关注。

致谢：衷心感谢本院郭永辉博士以及石药集团中奇制药有限公司对本实验提供的帮助。

参考文献：

[1] Wang M L，Zeng L，Yan H F，Li Y J，Dai H.J.Instrum.Anal.(王美玲，曾乐，颜鸿飞，李拥军，戴华．分析测试学报)，2014，33(3)：239-247.

[2] Qiu Z W，Ye R H，Liu Y L,Sun Y F，Chen Y，Li Z Q，Pan W L.J.Instrum.Anal.(仇镇武，叶汝汉，柳亚玲，孙一峰，陈泳，李正全，潘文龙．分析测试学报),2013，32(4)：488-493.

[3] Kee C L，Ge X W，Koh H L，Low M Y.J.Pharm.Biomed.Anal.，2012，70：265-272.

[4] Qiu Y J，Zou Y H.Chin.J.Mod.Appl.Pharm.(裘一婧，邹耀华.中国现代应用药学),2015,32(8):1000-1004.[5] Sun J，Yu H，Hu Q，Feng R，Zhang S，Ji S.ActaPharm.Sin.(孙健,于泓,胡青,冯睿,张甦,季申.药学学报),2014,49(4):513-516.

[6] Deng K P，Luo Z Y，Lei Y.Chin.Pharm.J.(邓鲲鹏，罗卓雅，雷毅．中国药学杂志),2011，46(18)：1441-1444.[7] Lee E S,Lee J H，Han K M，Kim J W，Hwang I S，Cho S，Han S Y，Kim J.J.Pharm.Biomed.Anal.,2013,83:171-178.

[8] Yu H，Hu Q，Zhang S,Sun J，Feng R，Ji S.Chin.Pharm.J.(于泓，胡青，张甦，孙健，冯睿，季申.中国药学杂志),2013,48(15):1312-1318.

[9] Patel D N，Li L，Kee C L,Ge X W,Low M Y，Koh H L.J.Pharm.Biomed.Anal.，2014，87：176-190.

[10] Li R，Chen G B.Chin.J.Pharm.Anal.(李锐，陈国彪.药物分析杂志)，2014，34(5)：879-884.

[11] Gao Q，Zhang Z，Guo H Z，Dai H，Che B Q，Wang Z B.Chin.Pharm.J.(高青，张喆，郭洪祝，戴红，车宝泉，王志斌．中国药学杂志),2008，43(1)：142-146.

[12] Xu Y J，Xu G P，Wei Y A.J.Instrum.Anal.(徐远金,许桂苹,魏远安.分析测试学报),2006，25(2)：35-38.[13] Xing J，Sun L，Zhong D F.J.Chin.MassSpectrom.Soc.(邢杰，孙璐，钟大放.质谱学报),2002，23(1)：1-6.[14] Shi Y，Wei F，Zhu X P，Xiong J，Ma S C，Lin R C.Chin.J.Pharm.Anal.(石岩，魏锋，朱晓鹏，熊婧，马双成，林瑞超.药物分析杂志),2014，34(1)：121-129.

[15] Wu S，Wang H，Zhu H G，Zhao Y，Tian Q Q，Sun W J，Ding L，Chen B.Chin.J.Anal.Chem.(吴双，王华，朱慧果，赵勇，田清青，孙文剑，丁力，陈波.分析化学),2012，40(7)：1081-1085.

Discovery and Structure Identification of a New Phosphodiesterase-5 Inhibitor Derivative

MA Chun-yan,DUAN Qiong,FENG Shu-hua*

(Hebei Institute for Drug Control,Shijiazhuang 050011,China)

One suspected phosphodiesterase-5 inhibitor(PDE-5) derivative was found in a kind of medicinal liquor by UPLC-DAD-QTOF-MS.Sample purification was carried out by a preparative HPLC system，and its structure was determined by NMR,IR and UPLC-DAD-QTOF-MS methods.The results showed that the compound is a new aildenafil derivative which has never been reported at home and abroad.

PDE-5 inhibitor analogue;UPLC-QTOF-MS;NMR;IR;structure identification

2015-11-26；

2015-12-17

河北省食品药品监督管理局重点科技项目(ZD2014006)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.05.009

O657.65；TQ460.72

A

1004-4957(2016)05-0551-06

*通讯作者：封淑华，硕士，主任药师，研究方向：保健食品和药物分析，Tel：0311-89892090，E-mail：shuhua08@sina.com