液下单液滴微萃取/快速气相色谱-质谱联用法测定蔬菜中多种有机磷农药残留

胡美华，朱惠芳，马丽芳

(南昌市疾病预防控制中心,江西 南昌 330038)



液下单液滴微萃取/快速气相色谱-质谱联用法测定蔬菜中多种有机磷农药残留

胡美华*，朱惠芳，马丽芳

(南昌市疾病预防控制中心,江西 南昌 330038)

建立了液下单液滴微萃取/快速气相色谱-质谱联用测定蔬菜中多种有机磷农药残留的方法，并对前处理条件进行了优化。采用液下单液滴微萃取技术对样品进行萃取和浓缩，以快速气相色谱-质谱(GC-MS)分离检测，内标法定量。在优化条件下，治螟磷、甲拌磷、异稻瘟净、甲基对硫磷、皮蝇磷、马拉硫磷、毒死蜱、水胺硫磷和喹硫磷9种有机磷农药的色谱峰分离良好，相关系数均不低于0.995 8，检出限为0.32～0.91 μg/kg，加标回收率为83.2%～134.5%，相对标准偏差(n=5)为3.4%～16.5%。该方法样品前处理简单，分析快速，灵敏度高，能够应用于蔬菜中这9种有机磷农药残留的检测。

液下单液滴微萃取；有机磷；快速；气相色谱-质谱联用；蔬菜

众所周知，农药在防治病虫害、去除杂草、提高农业经济效益以及控制人畜传染病等方面起关键作用。为此，从20世纪40年代开始，农药已成为提高农产品产量和质量的不可或缺的中坚力量。据估计，若不对农作物使用农药，全世界每年因病、虫、草害约损失粮食总产量的50%，而使用农药可挽回上述损失中的30%，农药的效益大约是其使用成本的4倍[1]。但农药在给人们带来好处的同时，也给人们带来了危害。如有机磷被人体吸收后，与乙酰胆碱酯酶结合，将破坏神经功能，易导致人体麻痹甚至死亡[2]。据调查，我国蔬菜、水果和粮食的农药超标率平均为22.15%，18.79%和6.2%[3]。随着有机磷农药在农业中的广泛应用，大量的农药残留出现在食品、土壤和水中。因而，研究有机磷农药残留检测技术具有重要意义。

气相色谱法具有分离效率高、灵敏、快速等优点，是有机磷农药残留分析最常用的检测方法[4-5]。近年来，随着科技的发展，各种联用和快速分析技术朝着省时省力、环境友好、快速、低成本等方向发展，已成为当今研究的热点[6]。在有机磷农药残留分析中，样品前处理技术直接影响检测分析的成分、效率，并在很大程度上决定了分析结果的可靠性。在有机磷农药分析中，常见的样品前处理技术有液-液萃取[7]、固相萃取[8]和固相微萃取[9]等。但这些前处理技术具有有机试剂使用多、耗时、成本高等不足。

单液滴微萃取技术是由Jeannot和Cantwell[10]在1996年提出的一种新型前处理技术。该技术通过将吸取一定体积萃取剂的微量进样针插入待测试样的顶空或溶液中，然后缓慢推出萃取剂，使其悬挂于进样针针尖的顶端，萃取一定时间后，将液滴吸回至进样针。与传统的液-液萃取法相比，单液滴微萃取法具有简单、快速、灵敏、廉价、环境友好，以及集采样、萃取和浓缩于一体等优点。本课题组已将该技术结合气相色谱法成功应用于奶粉和尿液中碘的测定[11]。

随着科技的发展，快速分析已成为当前研究热点。快速气相色谱能够解决多种化合物分析时间长的缺点[6,12-13]，分析检测满足更高效、更灵敏的需求。本文采用液下单液滴微萃取技术萃取和富集蔬菜中的有机磷农药，结合快速气相色谱-质谱法同时测定了治螟磷、甲拌磷、异稻瘟净、甲基对硫磷、皮蝇磷、马拉硫磷、毒死蜱、水胺硫磷、喹硫磷9种有机磷农药残留。该方法较国标法分析时间大大缩短，灵敏度有较大提高，可实现有机磷农药痕量残留的快速同时测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

日本岛津GCMS-QP2010气质联用仪；日本岛津GCMS-Solution工作站；美国Restek RTX-5(10 m×0.1 mm×0.1 μm)石英毛细管色谱柱，美国DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)石英毛细管色谱柱；20 mL顶空瓶；美国Hamilton 10 μL微量进样针；德国IKA磁力搅拌器；美国Alltech Milli-Q纯水机。

农药标准品(治螟磷、甲拌磷、异稻瘟净、甲基对硫磷、皮蝇磷、马拉硫磷、毒死蜱、水胺硫磷、喹硫磷)浓度均为100 μg/mL，均购自农业部环境保护科研监测所；D10-毒死蜱(Dr.Ehrenstorfer公司，纯度为97.0 %)；乙腈(色谱纯，美国Tedia公司)，甲苯、氯仿、四氯化碳、十六烷、正辛醇(优质纯，国药集团化学试剂有限公司)；盐酸、氯化钠(分析纯，上海化学试剂公司)；实验用水为超纯水，电阻率为18.2 MΩ·cm(25 ℃)。

1.2 实验方法

1.2.1 仪器条件 色谱条件A：DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)石英毛细管色谱柱；柱前压140.4 kPa；柱温采用程序升温：初始温度82 ℃，保持5 min，再以9 ℃/min升至280 ℃，保持15 min。初始状态为不分流进样，1 min后打开分流阀，分流比30∶1；溶剂延迟9.0 min，9.1 min后采集信号。

色谱条件B：Rtx-5(10 m×0.1 mm×0.1 μm) 石英毛细管色谱柱；柱前压409.6 kPa；柱温采用程序升温：初始温度82 ℃，保持1.3 min，以35 ℃/min至280 ℃，保持4 min。初始状态为不分流进样，1 min后打开分流阀，分流比30∶1；溶剂延迟2.5 min，2.6 min后采集信号。

进样口温度均为180 ℃；离子源温度220 ℃；接口温度280 ℃；载气为He(99.999%)。

质谱条件：电子轰击离子源(EI)，电子能量70 eV，电子倍增器电压1.0 kV，采用选择离子方式(SIM)检测。各分析物的监测离子见表1。

1.2.2 标准储备液 分别准确吸取各有机磷农药标准品0.5 mL于10 mL容量瓶中，以乙腈定容至刻度，得各标准储备液浓度为5 μg/mL；内标物储备液：称取D10-毒死蜱5.0 mg于100 mL 容量瓶中，以乙腈定容至刻度，得内标物的浓度为50 μg/mL。

1.2.3 样品前处理 蔬菜洗净后，取可食部分，称取20.0 g样品，加入40 mL乙腈匀浆，加5 g氯化钠，匀浆1 min，得到提取液，于3 000 r/min离心5 min，取0.75 mL上清液于含搅拌子的顶空瓶中，同时加浓度为50 μg/mL的内标D10-毒死蜱40 μL，用超纯水定容至10 mL，压盖，置于磁力搅拌器上。

微量进样针吸取一定量的萃取剂，插入顶空瓶液面以下，将萃取剂慢慢推出，悬于针尖，开启搅拌器，萃取一定时间后，将萃取剂吸回微量进样针，进GC-MS联用仪分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

快速气相色谱的分离速度和分辨率通常受色谱柱的长度、内径、膜厚、填料颗粒大小以及载气、柱前压和程序升温等因素影响[13]。本实验采用传统的DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)石英毛细管色谱柱(色谱条件A)和Rtx-5(10 m×0.1 mm×0.1 μm) 石英毛细管色谱柱(色谱条件B)对9种农药混合标准以直接进行方式进行分离分析。在色谱条件A下分析得到的谱图见图1A，采用GC Method translation[14]软件将色谱条件A转换成色谱条件B进行分析得到的谱图见图1B。由图可见，在这两种色谱条件下，各有机磷农药分离良好，但分析时间由色谱条件A的25 min缩短至色谱条件B的6 min，显著节约了分析时间。因此，本文采用快速色谱条件，即色谱条件B进行样品检测，不需对色谱条件重新摸索[15]。

图1 有机磷混标(1.0 μg/mL)的GC-MS选择离子图

Fig.1 GC-MS(SIM) chromatograms of organophosphorous pesticides standards at 1.0 μg/mL

A：conventional narrow bore column,B：micro diameter column；1.sulfotep,2.phorate,3.iprobenfos,4.methyl parathion,5.ronnel,6.malathion,7.D10-chlorpyrifos,8.chlorpyrifos,9.isocarbophos,10.quinalphos

2.2 微萃取条件的优化

2.2.1 萃取溶剂的选择 合适的萃取剂在单液滴微萃取中起着重要作用。萃取剂的选择应符合化学稳定性好、与水不互溶、蒸汽压低以及黏度大等要求。考察了甲苯、四氯化碳、氯仿、十六烷和正辛醇对9种有机磷农药的萃取效率。结果显示，十六烷和正辛醇几乎不能提取这9种农药，甲苯、四氯化碳和氯仿对这些有机磷农药有一定的提取效率，但在相同条件下，氯仿的提取效率最高。因此，本实验选择氯仿作为萃取剂。

2.2.2 单液滴体积的选择 液滴体积的大小对目标物的萃取效率影响很大。一般来说，体积越大，萃取效率越高。实验考察了0.5，1.0，2.0 μL的氯仿对9种有机磷农药的萃取效率。结果表明，萃取体积由0.5 μL增至1.0 μL时，萃取效率明显提高。然而，当液滴体积为2.0 μL时，液滴不稳定，且由于本文采用微口径的毛细管柱，液滴体积的增大可能会使色谱柱容量达到饱和。故本实验选用1.0 μL为最佳液滴体积。

2.2.3 萃取时间的选择 单液滴微萃取过程是有机相与水相的动态平衡过程，萃取时间的长短直接影响萃取效率[16]。比较了搅拌时间分别为5，10，15，20 min时对萃取效率的影响。结果表明，随着萃取时间由5 min增至15 min，各有机磷农药的萃取效率明显提高，但继续增至20 min时，治螟磷、马拉硫磷和喹硫磷的萃取基本达到平衡；甲拌磷和甲基对硫磷的萃取效率有所下降；其它有机磷农药的萃取效率则提高。这可能是随着提取时间的延长，各有机磷之间存在着不同竞争吸附作用所致。此外，延长萃取时间，会使液滴中产生大的气泡，影响其稳定性。因此本实验最终选取15 min作为最佳萃取时间。

2.2.4 搅拌速率的选择 搅拌速率是影响两相平衡的重要因素[17]。搅拌速率过快可使得平衡时间缩短，但同时液滴的稳定性减小。考察了搅拌速率为0，150，200，250，300 r/min时的影响。结果显示，各有机磷农药的萃取效率随着搅拌速率的增大而增加，当搅拌速率增大到300 r/min时，甲拌磷、甲基对硫磷和马拉硫磷的萃取效率有所下降，毒死蜱的萃取效率增加，其它农药几乎不变。但液滴不稳定，重现性差。因此，选择250 r/min为最佳搅拌速率。

2.2.5 盐效应的影响 盐的加入能减少目标物在水中的溶解性，从而有利于目标物的萃取。考察了0%，10%，20%，30%和36%(饱和)氯化钠对萃取效率的影响。由实验结果可知，随着盐用量的加大，萃取效率无明显变化，但气泡更易从水相析出，使液滴不稳定，从而引起分析结果的不可靠性。故实验最终选择不加氯化钠。

2.2.6 乙腈比例的选择 按照GB/T 19648-2006[18]对样品采用乙腈提取，吸取一定量的提取液于20 mL顶空瓶中，用水稀释至10 mL。因此，乙腈的量对有机磷的溶出效果可能有一定影响，从而影响萃取效果。考察了乙腈比例为2.5%，5.0%和7.5%时的萃取效果。结果显示，乙腈比例越大，萃取效果越好，同时液滴的稳定性也越差。综合考虑，本实验选择7.5%的乙腈比例进行实验。

2.3 方法的线性及检出限

分别取300，150，37.5，15.0，7.5，3.8 μL标准储备液，及分别移取40 μL内标物储备液于100 mL容量瓶中，用水定容，得浓度分别为15.0，7.5，1.9，0.75，0.38，0.19 ng/mL的系列各标准溶液，内标浓度为20 ng/mL。在优化条件下,以待测物峰面积与内标峰面积比(Y)为纵坐标，对应化合物质量浓度(X，ng/mL)为横坐标进行线性回归分析；以3倍信噪比计算检出限(LOD)，结果见表1。由表1可见，在一定浓度范围内，各农药均有较好的线性相关性，相关系数(r)均不低于0.995 8，检出限为0.32～0.91 μg/kg。

表1 9种农药的线性范围、线性方程、相关系数(r)及检出限

Table 1 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients and limits of detection of 9 pesticides

Compoundm/zLinearranges(ng/mL)LinearequationrLOD(μg/kg)Sulfotep(治螟磷)322∗202，238019～150Y=00014X+0003709993035Phorate(甲拌磷)260∗121，231019～150Y=00061X+0000409989053Iprobenfos(异稻瘟净)204∗246，288038～150Y=00036X+0000909964072Methylparathion(甲基对硫磷)263∗233，246019～150Y=00087X+0003609970032Ronnel(皮蝇磷)285∗287，125019～150Y=00150X+0000809993037Malathion(马拉硫磷)173∗158，143038～150Y=00018X+0001509958091Chlorpyrifos(毒死蜱)314∗258，286019～150Y=00034X+0002409993051Isocarbophos(水胺硫磷)136∗230，289038～150Y=00033X+0001609975085Quinalphos(喹硫磷)146∗298，157019～150Y=00099X+0002609965072

Y:ratio of standard peak area and internal standard peak area;X:concentration of pesticide;*：quantitative ion

2.4 实际样品的检测及回收率实验

图2 加标样品(加标浓度130 ng/g)的GC-MS选择离子图Fig.2 GC-MS(SIM) chromatogram of a spiked sample(spiked 130 ng/g) peak number(1-10) was the same as that in Fig.1

将随机购于南昌各超市和农贸市场的蔬菜样品洗净后，取可食部分，采用“1.2.3”方法进行样品前处理，在优化条件下对样品进样分析，同时进行加标回收率实验，每个样品进行5次平行实验，结果见表2。由表2可知，各农药的加标回收率为83.2%～134.5%，相对标准偏差为3.4%～16.5%。图2为一蔬菜加标样品(加标浓度为130 ng/g)的GC-MS选择离子图。

表2 实际样品的测定及加标回收率

Table 2 The determination of real samples and its spiked recoveries

PesticideFound(mg/kg)∗Spiked(mg/kg)Recovery/%RSD/%CabbageCucumberCabbageCucumberSulfotep-，-0013，013908，951931，95754，79103，89Phorate-，-0013，013853，9251105，106449，4469，76Iprobenfos-，-0013，013926，918936，899115，8883，83Methylparathion-，-0013，0131124，1021907，94858，8797，62Ronnel-，-0013，013895，967969，104267，34102，56Malathion-，-0013，013957，863884，97194，7543，51Chlorpyrifos-，0000680013，013923，906975，93740，35115，80Isocarbophos-，-0013，013921，8841345，1128100，85129，137Quinalphos-，-0013，013832，8651252，849143，125151，165

*no detected

3 结 论

通过GC方法转换软件，将常规色谱条件转换为快速色谱条件，结合单液滴微萃取前处理技术，建立了同时测定蔬菜中多种有机磷农药残留的快速气相色谱-质谱联用法。并对单液滴微萃取技术中萃取剂的选择及用量、乙腈的体积、萃取时间、搅拌速率和盐效应等进行了优化。采用本方法测定治螟磷9种有机磷农药的保留时间仅需6 min，与国标法相比，分析时间缩短，且大大提高了方法灵敏度。应用此法能够实现蔬菜中治螟磷、甲拌磷、异稻瘟净、甲基对硫磷、皮蝇磷、马拉硫磷、毒死蜱、水胺硫磷和喹硫磷的同时快速测定。

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Determination of Organophosphorus Pesticides Residues in Vegetables by Rapid GC-MS Coupled with Direct Single-drop Microextraction

HU Mei-hua*,ZHU Hui-fang,MA Li-fang

(Nanchang Center for Disease Control and Prevention,Nanchang 330038,China)

A rapid method was developed for the determination of organophosphorus pesticides residues in vegetables using GC-MS coupled with direct single-drop microextraction(SDME).The samples were extracted and enriched by direct SDME,then the target compounds were analyzed by GC-MS under selected-ion monitering(SIM) mode,and quantified by the internal standard.Under the optimized conditions,9 kinds of organophosphorus pesticides,including sulfotep,phorate,iprobenfos,methyl parathion,ronnel,malathion,chlorpyrifos,isocarbophos and quinalphos,were successfully separated.The correlation coefficients were not less than 0.995 8,and the detection limits ranged from 0.32 μg/kg to 0.91 μg/kg.The recoveries were in the range of 83.2%-134.5% with RSDs(n=5) of 3.4%-16.5%.The developed method was simple,rapid and sensitive,and could be applied in the determination of 9 kinds of organophosphorus pesticides residues in vegetables.Key words：direct single-drop microextraction;organophosphorus;rapid;gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS);vegetables

2015-10-07；

2015-11-13

南昌市科技局项目(洪财企[2012]80号 社发-7-1)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.05.012

O657.63；F767.2

A

1004-4957(2016)05-0569-05

*通讯作者：胡美华，硕士，主管技师，研究方向：理化检验，Tel:0791-86363387,E-mail:cycle110@163.com