化妆品中己脒定与氯己定及其盐类的超高效液相色谱法测定及质谱确证

孟宪双，马 强，白 桦，张 庆，郭项雨，吕 庆

(中国检验检疫科学研究院，北京 100176)



化妆品中己脒定与氯己定及其盐类的超高效液相色谱法测定及质谱确证

孟宪双，马 强*，白 桦，张 庆，郭项雨，吕 庆

(中国检验检疫科学研究院，北京 100176)

建立了化妆品中己脒定和氯己定及其盐类的超高效液相色谱测定及质谱确证分析方法。化妆水、香波、散粉及膏霜等试样经饱和氯化钠溶液破乳，唇膏等蜡质类试样经四氢呋喃分散后，依次加入水和甲醇，涡旋振荡混匀，进行超声辅助提取，固相萃取净化，采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱分离，以0.1%三氟乙酸-水和0.1%三氟乙酸-乙腈为流动相梯度洗脱，二极管阵列检测器(DAD)检测，外标法定量，采用高效液相色谱-串联质谱进行确证。在优化实验条件下，己脒定(羟乙基磺酸)盐和氯己定在一定浓度范围内线性关系良好(r2≥0.999 6)；方法检出限和定量下限分别为10 mg/kg和20 mg/kg；在20～3 000 mg/kg加标水平下，方法的平均回收率为81.9%～97.6%，相对标准偏差(RSDs)为0.9%～7.8%。该方法快速、准确、灵敏度高、特异性好，可用于化妆品的实际检验工作。

己脒定；氯己定；固相萃取；超高效液相色谱；质谱确证；化妆品

己脒定及其盐类物质具有广谱抗菌和杀菌性能，对皮肤刺激性低，与日化产品常用原料具有优良的配伍性，目前已广泛应用于化妆品行业[1-2]；氯己定及其盐类(如盐酸氯己定、醋酸氯己定及葡萄糖酸氯己定)是一类常用的皮肤黏膜消毒剂，因具有腐蚀性低、杀菌效果好、使用方便等优点，被广泛用于含漱液、皮肤消毒剂和化妆品配方中[3-4]。综上，由于己脒定二(羟乙基磺酸)盐和氯己定及其盐类在化妆品中良好的防腐或杀菌效果，我国《化妆品安全技术规范》(2015年版)[5]规定己脒定和氯己定及其盐类，包括己脒定二(羟乙基磺酸)盐、己脒定对羟基苯甲酸盐、氯己定二盐酸盐、氯己定二醋酸盐和氯己定二葡萄糖酸盐均可作为化妆品中的防腐剂，但鉴于其对人体健康潜在的危害作用，同时规定了其限量值:氯己定及其盐类总量为0.3%(以氯己定计)，己脒定及其盐类总量为0.1%。因此，开展化妆品中该类防腐剂的定量检测对于确保化妆品质量安全及保障消费者使用安全具有重要意义。

氯己定及其盐类的测定方法主要包括高效液相色谱法[6-10]、毛细管电泳法[11]及紫外分光光度法[12]，但研究对象多为含漱液、动物血浆和乳膏等，极少涉及化妆品；针对己脒定类防腐剂，Taylor等[13]建立了药物制剂中己脒定二(羟乙基磺酸)盐的高效液相色谱测定方法，但目前尚未见化妆品中该类化合物检测方法的报道。在已有高效液相色谱分析方法中，研究人员多利用三乙胺-十二烷基苯磺酸钠-磷酸盐、含三乙胺的磷酸盐缓冲液等洗脱己脒定二(羟乙基磺酸)盐、氯己定及醋酸氯己定，该流动相体系组成复杂、操作繁琐且结果重现性差。本研究采用超声辅助提取和固相萃取技术对化妆品中的己脒定和氯己定及其盐类物质进行高效提取和净化，采用三氟乙酸-水和三氟乙酸-乙腈流动相体系进行洗脱，建立了超高效液相色谱分析方法，并以串联质谱对实验结果进行确证，避免了假阳性结果。该方法快速、准确、灵敏、特异性强，可用于化妆品的检验工作。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色谱仪、Xevo TQ三重四极杆质谱仪、MassLynx数据处理系统(美国Waters公司)；XS105型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)；Elmasonic P300H超声波清洗器(德国Elma公司)；固相萃取装置(美国Supelco公司)；N-EVP 112氮吹仪(美国Organomation公司)；CR 21G型高速冷冻离心机(日本Hitachi公司)。

甲醇、乙腈、四氢呋喃和三氟乙酸(色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司)；氯化钠、氨水(分析纯，北京化工厂)；Oasis MCX固相萃取柱(6 mL/150 mg，美国Waters公司)；微孔滤膜(0.22 μm，有机系，美国Pall公司)；己脒定二(羟乙基磺酸)盐(分子式C20H26N4O2·2C2H6O4S)和氯己定(分子式C22H30Cl2N10)标准品购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度均大于99%。

1.2 标准溶液的配制

精密称取己脒定二(羟乙基磺酸)盐和氯己定标准品10 mg(精确至0.1 mg)于10 mL容量瓶中，分别以水和甲醇为溶剂，溶解、混匀并定容至刻度，制成质量浓度为1 mg/mL 的标准储备溶液；分别量取1 mL标准储备溶液至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成100 μg/mL的混合标准储备液，用甲醇逐级稀释成适宜浓度的混合标准工作溶液，于4 ℃避光保存。

1.3 样品前处理

1.3.1 提 取 化妆水、膏霜、香波及散粉类试样:称取0.5 g(精确至0.001 g)试样于50 mL具塞聚四氟乙烯离心管中，加入1 mL 饱和氯化钠溶液，涡旋30 s，加入10 mL水，涡旋10 s，10 000 r/min离心10 min，上清液转移至另一50 mL聚四氟乙烯离心管中；试样残渣继续加入9 mL甲醇，涡旋振荡混匀，超声提取20 min，10 000 r/min离心10 min，合并上清液，取上清液过0.45 μm微孔滤膜后，滤液待净化。

唇膏等蜡质类试样:称取0.5 g(精确至0.001 g)试样于50 mL具塞聚四氟乙烯离心管中，加入2 mL 四氢呋喃，涡旋30 s，加入10 mL水，涡旋10 s，10 000 r/min离心10 min，上清液转移至另一50 mL聚四氟乙烯离心管中；试样残渣继续加入8 mL甲醇，以下处理步骤同化妆水、膏霜、香波、散粉类试样。

1.3.2 净 化 Oasis MCX固相萃取柱(6 mL/150 mg)依次经5 mL甲醇活化和5 mL水平衡后，取5 mL提取液以5倍体积的4%甲酸-水稀释后过柱，先以4 mL甲醇淋洗，再用5 mL 5%氨水-甲醇洗脱目标化合物，收集洗脱液至氮吹管中，以氮气流缓慢吹扫至近干，最后用1 mL初始流动相溶解残渣，过0.22 μm微孔滤膜后供测定。

1.4 色谱分离条件

色谱柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm × 50 mm，1.7 μm)；流动相:0.1%三氟乙酸-水(A)和0.1%三氟乙酸-乙腈(B)；流速:0.4 mL/min；柱温:30 ℃；检测波长:260 nm；进样量:5 μL；梯度洗脱条件:0～1.0 min:80%A；1.0～2.5 min:80%～10%A；2.5～3.5 min:10%A；3.5～3.6 min:10%～80%A；3.6～5.0 min:80%A。

1.5 高效液相色谱-串联质谱确证条件

色谱柱:Waters XBridge C18(2.1 mm × 150 mm，3.5 μm)；流动相:0.1%三氟乙酸-水(A)和0.1%三氟乙酸-乙腈(B)；流速:0.3 mL/min；柱温:30 ℃；进样量:5 μL；梯度洗脱条件:0～1.0 min:60%A；1.0～2.0 min:60%～40%A；2.0～3.0 min:40%A；3.0～3.1 min:40%～60%A；3.1～5.0 min:60%A。

电喷雾源正离子模式(ESI+)；离子源温度:150 ℃；毛细管电压:3.0 kV；萃取电压:3.0 V；射频透镜电压:0.1 V；脱溶剂气:氮气，500 ℃，1 000 L/h；锥孔气:氮气，50 L/h；碰撞气:氩气；碰撞室压力:3.2×10-3mbar；数据采集模式:多反应监测(MRM)；己脒定二(羟乙基磺酸)盐和氯己定的质谱分析参数见表1。

表1 己脒定二(羟乙基磺酸)盐和氯己定的质谱分析参数

Table 1 MS/MS analysis parameters for hexamidine diisethionate and chlorhexidine

AnalyteRetentiontime(min)Precursorion(m/z)Production(m/z)Conevoltage(V)Collisionenergy(eV)Ionabundanceratio(%)Hexamidinediisethionate(己脒定二(羟乙基磺酸)盐)13935503382∗，12024521，21100，83Chlorhexidine(氯己定)23850503532，3362∗3816，2084，100

* the ions with higher responses

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法的优化

化妆品基质较为复杂，本研究将其分为化妆水、香波、散粉、膏霜和唇膏等类型。为充分提取和灵敏检测化妆品中的己脒定二(羟乙基磺酸)盐和氯己定，实验采用超声辅助提取和固相萃取相结合的前处理方式。根据目标分析物的理化性质及其在不同溶剂中的溶解性差异，将具有“油包水”类型基质的试样首先以饱和氯化钠溶液破乳(唇膏等蜡质类试样以四氢呋喃分散)，然后用水提取试样中的己脒定二(羟乙基磺酸)盐；由于氯己定及其盐易溶于甲醇，以甲醇对其进行提取后，合并提取液，两种化合物的回收率均在80%以上。鉴于目标物质分子结构式中均存在多个氨基或亚氨基，判定其为弱碱性化合物，因此，在固相萃取过程中选择具有阳离子交换作用的Oasis MCX柱，其基质填料为聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，且具有双重保留模式(离子交换和反相保留)，对弱碱性化合物具有较好的选择性。分别比较了不同体积分数的甲酸-水溶液对目标物质与固相萃取柱间离子作用力的影响，实验结果表明，4%甲酸-水可将目标物质牢固结合在填料上；在淋洗步骤比较了不同体积分数的甲醇-水溶液和甲醇对样品基质的淋洗效果，发现4 mL甲醇既可洗脱大部分样品的基质成分，又能最大限度保留目标分析物；在洗脱阶段，采用5%氨水-甲醇洗脱目标分析物，当用量为5 mL时，全部目标组分均被洗脱。综上，实验最终确定依次采用水和甲醇进行超声辅助提取，提取液经Oasis MCX固相萃取柱净化，净化液经氮吹浓缩后上机测定。

图1 己脒定二(羟乙基磺酸)盐(a)和氯己定(b)混合标准溶液的超高效液相色谱图Fig.1 UPLC chromatogram of hexamidine diisethionate(a) and chlorhexidine(b) at 260 nm

2.2 色谱分离条件的选择

己脒定和氯己定及其盐类分子结构中的氨基或亚氨基与色谱柱固定相中的硅羟基存在较强的氢键作用，因此，若仅以甲醇-水或乙腈-水作为流动相，色谱峰严重拖尾。有研究人员以三乙胺-十二烷基苯磺酸钠-磷酸盐等为流动相，考虑到该体系复杂，操作繁琐，且结果重现性差，本实验采用乙酸或三氟乙酸等常见的酸性改性剂，以降低或消除目标化合物与色谱柱硅羟基间的次级相互作用，从而减少吸附作用，降低目标物的峰形拖尾及展宽现象。实验比较了乙酸及三氟乙酸两种酸性改性剂对目标物保留及色谱峰形的影响。实验结果表明，当流动相中乙酸添加浓度为0.1%，0.2%，0.3%时，己脒定和氯己定的色谱峰形分别表现为前延和拖尾，而以三氟乙酸为酸性改性剂，添加浓度为0.1%时，目标物的色谱峰形对称，出峰时间也较合理。因此，本实验选用0.1%三氟乙酸-水和0.1%三氟乙酸-乙腈流动相体系对目标物进行梯度洗脱。在优化条件下，己脒定二(羟乙基磺酸)盐和氯己定的超高效液相色谱图见图1。

2.3 方法的特异性

本实验通过优化色谱分离条件，使得在己脒定二(羟乙基磺酸)盐和氯己定的出峰时间范围内，空白试样基质中无干扰峰出现，目标分析物出峰时间合理，可有效避免化妆品中基质干扰，从而使定量结果更加准确可靠。

2.4 线性关系、检出限及定量下限

在优化条件下，将甲醇逐级稀释的标准工作液(0.5，1，2，5，10，20，50，100 μg/mL)分别进样5 μL，以目标物的峰面积(y)为纵坐标，质量浓度为横坐标(ρ，μg/mL)进行线性回归。结果表明，己脒定二(羟乙基磺酸)盐和氯己定的峰面积与浓度均在0.5～100 μg/mL范围内呈良好线性关系，相关系数(r2)分别为0.999 6和0.999 9。采用空白样品加标实验，分别以信噪比(S/N)为3和10时目标物的浓度确立方法的检出限(LOD)和定量下限(LOQ)，实验结果表明，将加标水平为10 mg/kg和20 mg/kg的样品进行处理分析后，得到的色谱峰信噪比分别近似为3和10，因此，本实验确定己脒定二(羟乙基磺酸)盐及氯己定的LOD均为10 mg/kg，LOQ为20 mg/kg。

2.5 日内及日间精密度

为考察目标物的稳定性，分别制备0.5 μg/mL和10 μg/mL的空白化妆水、香波、膏霜、散粉和唇膏基质匹配混合标准溶液，日内伴随标准曲线进行测定(0,3,9,12，15 h)，得到日内精密度；连续测量5 d，计算得日间精密度。0.5 μg/mL时，目标物的日内精密度为0.5%～3.1%，日间精密度为1.2 %～6.0%；10 μg/mL时，日内精密度为0.7%～2.3%，日间精密度为1.2%～4.4%，方法的精密度良好，符合化妆品中限用物质的检测要求。

2.6 回收率

称取空白化妆品样品0.5 g(精确至0.001 g)，分别添加定量下限浓度、中间浓度和限量浓度3个水平的混合标准溶液，按照本方法进行分析测定，以随行标准曲线进行定量，结果见表2。己脒定二(羟乙基磺酸)盐和氯己定的平均回收率为81.9%～97.6%，相对标准偏差(RSD)为0.9%～7.8%。

表2 方法的平均回收率与精密度(n=6)

Table 2 Average recoveries and pricisions of the method(n=6)

AnalyteSpiked(mg/kg)ToninglotionShampooCreamPowderLipstickRecovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Hexamidine208401497509936248951396142diisethionate200976309132497439915619226310009544591533935609453690078Chlorhexidine209542687626935398887781964200899378401097512936348954630009617097619913389742491536

2.7 质谱确证条件的优化

采用色谱法进行分析时，由于实际样品基质复杂，可能会对待测物的测定造成一定程度的干扰，为避免假阳性结果的出现，做到准确定性，本实验采用高效液相色谱-串联质谱法进行实验结果的进一步确证。结果表明，目标化合物均在ESI+电离方式下可获得较高丰度的[M+H]+前体离子，经二级质谱分析条件优化，均可获得两个较高响应强度的产物离子。己脒定二(羟乙基磺酸)盐和氯己定的MRM色谱图见图2。

Fig.2 MRM chromatograms of hexamidine diisethionate and chlorhexidine

1.hexamidine diisethionate；2.chlorhexidine

2.8 实际样品的测定

利用本方法对市售的13件化妆品(包括美容类、祛痘类及洁面类等不同类型的化妆水、膏霜和乳液等)进行测定，结果均未检出己脒定和氯己定及其盐类。

3 结 论

本研究采用超声辅助提取结合固相萃取的前处理方式，高效提取化妆品中的己脒定和氯己定及其盐类组分。通过优化色谱分离条件，使目标物质在5 min内实现完全基线分离，且能有效排除基质中其它成分的干扰。方法学参数表明，本方法的准确度和灵敏度均满足实际样品的检测要求；疑似阳性样品采用串联质谱法进一步进行确证，保证了实验结果的可靠性，因此本方法可为化妆品中己脒定和氯己定及其盐类的质量安全监控提供科学依据和技术支持。

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Determination of Hexamidine,Chlorhexidine and Their Salts in Cosmetics by Ultra Performance Liquid Chromatography and Their Verification by High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

MENG Xian-shuang,MA Qiang*,BAI Hua,ZHANG Qing,GUO Xiang-yu,LÜ Qing

(Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing 100176,China)

Analytical methods were developed for the determination of hexamidine,chlorhexidine and their salts in cosmetics by ultra performance liquid chromatography(UPLC) and verification by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).Cosmetic samples of toning lotion,shampoo,powder and cream were firstly demulsificated with saturated sodium chloride solution,and wax-type samples(e.g.lipstick) were dispersed with tetrahydrofuran.Water and methanol were then added successively,followed by thorough vortex oscillation.The extraction and clean-up procedures were performed using ultrasound-assisted extraction and solid-phase extraction separately.Afterwards,chromatographic separation was conducted on an ACQUITY UPLC BEH C18column(2.1 mm × 50 mm,1.7 μm) by a gradient elution of 0.1% aqueous trifluoroacetic acid solution and acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid.The detection was completed using a diode array detector(DAD).The external standard method was used for quantitation.Under the optimum conditions,good linearity(r2>0.999 6) was observed over a certain range of concentration.The limits of detection(LODs) and the limits of quantitation(LOQs) were 10 mg/kg and 20 mg/kg,respectively.The mean recoveries at three spiked levels ranged from 81.9% to 97.6%,with relative standard deviations(RSDs) of 0.9%-7.8%.This method was proved to be rapid,accurate,sensitive and high specified,and could be used in the practical determination of commercial cosmetics.

hexamidine；chlorhexidine；solid-phase extraction(SPE)；ultra performance liquid chromatography(UPLC)；mass spectrometric verification；cosmetics

2015-12-10；

2015-12-28

国家标准化管理委员会计划项目(20130971-T-607)；质检公益性行业科研专项项目(2012104013-4)；国家科技支撑计划项目(2013BAK04B03)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.05.013

O657.72；R978.24

A

1004-4957(2016)05-0574-05

*通讯作者：马 强，博士，副研究员，研究方向:消费品中化学危害物质检测技术及风险评估，Tel:010-53897463，E-mail:maqiang@caiq.gov.cn