离子液体作流动相添加剂高效液相色谱法分离莨菪类生物碱

方海红,朱益雷，魏惠珍,金浩鑫,殷文静,饶 毅*

(1.江西科技师范大学 药学院，江西 南昌 330013；2.江西中医药大学 药学院，江西 南昌 330006；3.中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌 330006)



离子液体作流动相添加剂高效液相色谱法分离莨菪类生物碱

方海红1,2,朱益雷2,3，魏惠珍3,金浩鑫3,殷文静2,饶 毅2*

(1.江西科技师范大学 药学院，江西 南昌 330013；2.江西中医药大学 药学院，江西 南昌 330006；3.中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌 330006)

建立了以离子液体1-辛基-甲基咪唑六氟磷酸盐(OminPF6)为高效液相色谱流动相添加剂分离莨菪类生物碱的方法，探讨了离子液体的保留模型及机理。采用高效液相色谱法，考察了检测波长、有机相种类和比例、离子液体的种类、pH值和浓度、缓冲盐体系等因素对莨菪类生物碱色谱行为的影响。结果显示，当离子液体作为流动相添加剂时，可明显改善此类生物碱的分离效果，减少色谱峰的拖尾，提高分离效率。研究显示，OminPF6浓度与容量因子的变化符合溶质计量置换保留模型(SDM-R)，且保留过程以竞争吸附为主。

离子液体；高效液相色谱法；莨菪类生物碱；色谱行为；保留机理

莨菪类生物碱主要来源于颠茄和天仙子等茄科植物，包括消旋山莨菪碱(Raceanisodamine，RADM1,2)、东莨菪碱(Scopolamine，SCOP)和阿托品(Atropine，ATP)等。莨菪类药物主要作为M胆碱能受体阻滞剂，临床一般用于感染性休克、有机磷脂类农药中毒、眩晕症、胃肠绞痛等。随着该类药物在临床上的应用越来越广泛，对莨菪类化合物的分离测定研究有着重要的实际意义。4种化合物的结构式见图1(消旋山莨菪碱由于6位上羟基空间位置关系有2种同分异构体RADM1和RADM2)。

图1 消旋山莨菪碱(RADM)、东莨菪碱(SCOP)和阿托品(ATP)的化学结构式

Fig.1 Chemical structures of raceanisodamine(RADM)，scopolamine(SCOP) and atropine(ATP)

目前，文献报道测定莨菪类生物碱的方法有高效液相色谱法、毛细管电泳法、分光光度法以及比色法等[1-3]。然而，目前采用高效液相法分离此类生物碱大多只限于其中1～2种成分，同时分离这4种化合物较难得到理想的效果。近年来，将离子液体(RTILs)作为流动相添加剂用于反相液相色谱的研究日益增多并取得了一定成果[4-12]。目前以咪唑类离子液体的应用最广泛[13-14]。本实验将咪唑类离子液体作为高效液相色谱流动相添加剂，考察了分离条件对4种莨菪碱类生物碱色谱行为的影响，根据溶质计量置换保留模型(SDM-R)以及相关的色谱参数，初步探讨了分离机理，为此类生物碱的分离测定提供了新的思路。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters 2695 型高效液相色谱仪(Waters 公司)；Milli-Q 超纯水仪(Milipore 公司) ；AUW2200 十万分之一天平(岛津公司) ；AB104-N万分之一天平(梅特勒-托利多公司) ；KQ3200 超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司) ；PB-10 pH计(Sartorius公司)。

乙腈(色谱纯，美国 Fisher 公司)；甲醇、磷酸、磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、醋酸钠、三乙胺(TEA)，均为分析纯；离子液体CnminPF4(n=2,4,6,8，纯度不低于 99%)，1-乙基-3-甲基咪唑氯盐(EmimCl，纯度不低于99%)，1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(EmimBF4，纯度不低于99%)，均购于兰州中科凯特科工贸有限公司；消旋山莨菪碱、氢溴酸东莨菪碱、硫酸阿托品对照品购于中国药品生物制品检定所。

1.2 溶液的配制

取适量消旋山莨菪碱、氢溴酸东莨菪碱、硫酸阿托品对照品，精密称定，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得3种对照品储备液，各取5 mL至100 mL容量瓶中，甲醇稀释定容，摇匀得混合液。将混合液保存于冰箱，使用前放置至室温后过0.45 μm 滤膜。

1.3 色谱条件

色谱柱:菲罗门C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流动相为乙腈-30 mmol/L磷酸钠溶液(15∶85)，磷酸调至pH 7.0，流速1.0 mL/min，进样体积10 μL，检测波长210 nm，柱温为室温。

另向缓冲液中加入1.0 mmol/L的离子液体(OminPF6)为添加剂。

2 结果与讨论

2.1 检测波长及有机相的选择

通过光谱全波长扫描发现，本文研究的4种生物碱在210 nm处有较大的紫外吸收，由于常用的有机相甲醇和乙腈在210 nm附近也有吸收，因此分别考察了相同有机相比例下甲醇和乙腈对基线的干扰情况。结果发现，当采用乙腈作流动相时，基线相比甲醇噪音更小，灵敏度明显高于甲醇，因此选择乙腈作为有机相在210 nm波长处对生物碱进行分离测定。

2.2 离子液体种类的选择

2.3 离子液体OminPF6溶液pH值的影响

在其他色谱条件相同的情况下，考察了离子液体 OminPF6溶液的pH值分别为3.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0时对莨菪类生物碱分离的影响。结果发现当pH值小于6.0时，RADM和SCOP的峰形较差，会产生峰的裂解，这可能和生物碱以及离子液体的解离常数(pKa)有关[16]。当pH值为7.0，8.0，9.0时能获得较好的峰形，然而随着pH值的增大，保留时间明显增大，且碱性条件易损伤色谱柱[16]。当pH值为7.0时，4种生物碱的保留时间在5～20 min范围内，且分离度良好，故确定pH值为7.0。

2.4 离子液体OminPF6浓度的影响

考察了离子液体OminPF6的浓度(0.8～5.0 mmol/L)对各组分分离的影响，结果见表1(αD,k,N,R分别表示离子液体浓度、容量因子、理论塔板数、分离度)。

表1 不同离子液体浓度时分离莨菪类生物碱组分的色谱参数

Table 1 Chromatographic parameters of four tropane alkaloids with different concentrations of ionic liquids

αD(mmol·L-1)RADM1kNR12RADM2kNR23SCOPkNR34ATPkN086064255402730499013921292111681198193910511165994312402717487813681258932411111914104063059038334047024025132412218962110318811097340584272241369636931306119076431078181711036505793015430689362112111176616196917649588

由表1可见，从各组分的选择性来看，随着离子液体浓度的增加，RADM2与SCOP之间的分离度以及SCOP与ATP之间的分离度呈减小趋势，而由于消旋体之间结构差异较小，RADM1与RADM2的分离度略微增加。各组分的理论塔板数大致呈先增大后减小的趋势，且以浓度为0.8～1.6 mmol/L时，各组分的理论塔板数相对较高。此外，当离子液体达到一定浓度时，随着离子液体浓度的增加，4种生物碱的保留时间呈减小趋势，主要原因是其电离产生的咪唑阳离子会和生物碱上的极性基团竞争固定相的硅羟基，导致保留降低。

根据溶质计量置换保留模型(SDM-R)，考察了离子液体浓度对数与容量因子对数之间的关系，探讨了离子液体作用机理。其中SDM-R的简化数学表达式为[17]:lgk′=lgI-ZlgαD，式中，k′表示容量因子，αD表示置换剂的活度(将离子液体设为置换剂时，即用离子液体浓度表示)，lgI和Z均为常数。

实验结果表明，lgk′～lgαD的线性关系良好，4种组分保留值的对数与离子液体浓度对数均呈线性关系，RADM1，RADM2,SCOP和ATP的相关系数(R2)分别为0.947 8，0.947 8，0.968 6，0.941 4。由此可见，该离子液体在分离莨菪类生物碱时，存在一定溶剂化作用，并且参与组分与固定相的竞争吸附[9]。

2.5 缓冲盐的选择

分别考察了4种不同缓冲盐(磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、醋酸钠)对莨菪类生物碱的影响。缓冲盐加入量为30 mmol/L，醋酸钠用冰醋酸调至pH 7.0，其他缓冲盐用磷酸和氢氧化钠调至pH 7.0。结果表明，当采用醋酸盐体系时，基线不稳定，噪音较大，严重影响分离效果，这与醋酸钠本身在210 nm处有较大吸收有关。其他3种缓冲盐均能得到较好的分离效果，而加入钠盐时的灵敏度略优于钾盐，这可能与钠离子和钾离子本身的离子强度有关，钾离子的离子半径大于钠离子，半径越大的阳离子色谱峰基线噪音越大。因此，本实验选择磷酸钠作为最佳缓冲盐。

图2 4种生物碱的液相色谱图Fig.2 Chromatogram of four tropane alkaloids acetonitrile-30 mmol/L phosphate buffer(15∶85,pH 7.0)；1.RADM1,2.RADM2,3.SCOP,4.ATP

3 结 论

本文首次以离子液体1-辛基-甲基咪唑六氟磷酸盐(OminPF6)为反向高效液相色谱流动相添加剂，建立了消旋山莨菪碱、东莨菪碱与阿托品等莨菪类生物碱的分离分析方法，并考察了各种影响因素，建立了相关的色谱分离模型，初步探讨了其分离机理。实验结果表明，以离子液体作为流动相添加剂时，4种生物碱的色谱峰形得到了较好改善，保留时间减小，分离效率提高。并且在分离过程中离子液体浓度与容量因子在SDM-R模型中线性拟合较好，其主要作为置换剂，与被分离组分的作用以竞争吸附为主。

[1] Zhu M,Hu M S.Chin.J.Mod.Appl.Pharm.(祝明，胡梅素.中国现代应用药学杂志 )，2001,18(1):51-53.

[2] Zhang L P,Liu M,Shou Y Y,Zhou L Y.StraitPharm.J.(张丽萍，刘萌，寿钥莺，周丽燕.海峡药学)，2005,17(2):76-77.

[3] Xu J Y,Zhu P C,Zhou G Y,Chen G C.Nat.Prod.Res.Dev.(许璟瑛,朱鹏程,周国英,陈桂琛.天然产物研究与开发)，2010,22(8):90-92.

[4] Dong Y J，Yu H，Huang X，Wang J F.J.Instrum.Anal.(董影杰，于泓，黄旭，王婧菲.分析测试学报)，2011，30(3):302-306.

[5] Bian M，Yang Y，Zhou H.J.Instrum.Anal.( 边敏，杨勇，周昊.分析测试学报)，2013,32(2):174-178.

[6] Wang J F，Yu H，Bu W.J.Instrum.Anal.(王婧菲，于泓，卜文.分析测试学报)，2014,33(5):533-538.

[7] Ruiz-Angel M J,Carda-Broch S,Berthod A.J.Chromatogr.A，2006，1119(1/2):202-208.

[9] Bian M,Zhang Z J,Yin H.J.Pharm.Biomed．,2012,58:163-167.

[10] He L J,Zhang W Z,Zhao L,Liu X,Jiang S X.J.Chromatogr.A,2003，1007(1/2):39-45.

[11] Petruczynik A.J.Chromatogr.Sci.,2012,50:287-293.

[12] Li S N,Tian M L,Row K H.Int.J.Mol.Sci.,2010,11：2229-2240.

[13] Gao W，Yu H，Zhou S.Chin.J.Chromatogr．(高微，于泓，周爽．色谱)，2010，28(1):14-22.

[14] Huang Y,Yao S,Hang S.J.Chromatogr.Sci.,2013,51:739-752.

[15] Hashem H,Jira T.J.Chromatogr.A,2006，1133:69-75.

[16] Snyder L R.PracticalHPLCMethodDevelopment.2nd ed.Zhang Y K,transl.Beijing:Hua Wen Press(L.R.森德尔.实用高效液相色谱法的建立.2版.张玉奎,译.北京:华文出版社)，2001.

[17] Geng X D,Regnier F E.J.Chromatogr.,1984,296:15-30.

Separation of Tropane Alkaloids by HPLC with Ionic Liquid as Mobile Phase Additive

FANG Hai-hong1,2，ZHU Yi-lei2,3，WEI Hui-zhen3，JIN Hao-xin3，YIN Wen-jing2，RAO Yi2*

(1.School of Pharmacy，Jiangxi Science & Technology Normal University,Nanchang 330013，China；2.School of Pharmacy，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330006，China；3.National Pharmaceutical Engineering Center for Solid Preparation in Chinese Herbal Medicine,Nanchang 330006,China)

A novel analytical method was developed for the separation of tropane alkaloids by high performance liquid chromatography(HPLC) using ionic liquid(OminPF6) as mobile phase additive.The retention model and mechanism for the ionic liquid were also illustrated.The effect factors,including wavelength of detection,type and proportion of organic phase,pH value,type and concentration of ionic liquid and buffer salt system on retention behavior of components were investigated.The results showed that,the ionic liquid as mobile phase additive could significantly improve the separation effect on tropane alkaloids,and also increase the symmetry of peak and the relative separation.The results also showed that the relationship between capacity factor and concentrations of ionic liquid preferably complied with the stoichiometric displacement model for retention(SDM-R)，and the retention process of alkaloids was mainly based on competitive adsorption function.

ionic liquid； high performance liquid chromatography(HPLC)；tropane alkaloids；retention behavior；retention mechanism

2015-11-04；

2015-11-18

江西省科技厅青年科学基金项目(20132BAB215024)；江西省研究生创新专项资金项目(YC2015-S348)；江西中医药大学校级硕士研究生创新专项资金项目(JZYC15S2)；江西省教育厅科研项目(GJJ13580);江西科技师范大学科研项目(2013XJZD004)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.05.021

O657.72;TQ460.72

A

1004-4957(2016)05-0614-04

*通讯作者：饶 毅，教授，研究方向:中药分析，Tel:0791-7119609,E-mail:fxs_ry021228@126.com