有机双光子线粒体内活性小分子荧光探针研究进展

杨志广，李运林，陈亚红，郭 雷，张建夫，彭 鹏

(周口师范学院 化学化工学院，河南 周口 466001)



有机双光子线粒体内活性小分子荧光探针研究进展

杨志广*，李运林，陈亚红，郭 雷，张建夫，彭 鹏

(周口师范学院 化学化工学院，河南 周口 466001)

线粒体在细胞的能量代谢中发挥着关键作用，其内部环境的微小变化会影响细胞的正常生命活动。同时线粒体内许多活性小分子在细胞的许多生理过程中也起着关键作用。因此，可视化监测线粒体自身及内部微环境的变化对于生命现象的研究和疾病的诊断与治疗具有非常重要的意义。荧光分析法因具有操作简便、灵敏度高、选择性好、实时检测以及损伤小等优点而得到了广泛的研究和应用。双光子荧光探针技术相对于单光子荧光技术具有长波吸收短波发射、高度的三维空间选择性、大的穿透深度、避免荧光漂白和光致毒以及降低组织自发荧光干扰等特点，在生命科学领域具有广阔的应用前景。该文介绍了有机双光子吸收基本原理以及有机双光子线粒体内活性小分子荧光探针的研究现状，同时对有机线粒体内活性小分子荧光探针今后的发展趋势进行了展望。

线粒体；活性小分子；双光子；荧光探针；检测；综述

生命体中存在着各种各样的活性小分子物种，它们在生命体内的种类和浓度不尽相同，其生物学功能也完全不同，而且外界环境的变化(例如：受到环境污染或者其它刺激)会直接改变内源性物质的分布，从而导致疾病的发生。因此，深入了解这些活性物种的产生、分布及含量的变化等对于调节细胞正常的生理功能具有极其重要的科学意义。线粒体是细胞中非常重要的一个动态细胞器，是细胞中制造能量的结构，被誉为细胞的“动力工厂”，在细胞的生命活动中扮演着多种重要的角色，如在调节细胞氧化还原电位和信号转导、调节细胞分化与凋亡、基因表达、细胞内多种离子的跨膜转运以及控制细胞周期和生长等方面发挥着重要作用[1-6]。许多研究表明，线粒体与人的线粒体疾病、心脏功能障碍、动脉硬化、阿尔茨海默病、神经细胞死亡、癌症以及机体衰老等疾病相关[7-11]。另外，线粒体内许多活性小分子，活性氧、活性氮、还原态谷胱甘肽(GSH)等也与许多重大疾病相关，如阿尔茨海默病、帕金森病、神经细胞死亡和癌症等[12-15]。因此，探索能够及时准确地对线粒体以及线粒体内各种功能性物种进行区域定位与检测的分析方法对于线粒体生命现象的研究和疾病诊断具有十分重要的生物学意义。

荧光分析法具有简单易行、灵敏度高、选择性好、检出限低、不破坏样品和易于实现在线检测等特点，在生物体内各种活性物种的检测方面得到了广泛应用。近年来，双光子荧光探针技术在生命科学、医学诊断、信息科学等领域中的应用正迅速扩展，这是因为双光子荧光探针技术相对于单光子荧光探针技术具有更独特的优势，如近红外光激发、对生物样品穿透深度大、自发荧光低、光毒性小、对细胞和组织损伤小、漂白区域小、能够延长活细胞和组织的观测时间等[16-18]，为生命科学的研究提供了更为锐利的工具。本文主要介绍了有机双光子吸收基本原理和双光子线粒体内活性小分子荧光探针的研究现状，同时对有机线粒体内活性小分子荧光探针未来的发展趋势进行了展望。

1 双光子吸收基本原理及在生物应用中的优势

单光子吸收是指利用紫外或可见光激发荧光分子时，只有吸收光子的能量与荧光分子的基态和激发态之间的能带隙相匹配时才会发生电子跃迁。双光子吸收现象由Göppert-Mayer[16]于1931年首次提出，60年代初激光器出现后，Kaiser等[17]利用红宝石激光器为激发光源，首先从实验上证实了双光子吸收过程。双光子吸收是指物质分子在脉冲激光等强光的激发下，在较短的时间内，同时或先后吸收两个相同或者不同频率的光子，物质分子中的电子由基态通过一个中间虚拟态(Virtual state)直接吸收两个光子跃迁至一个较高能态的过程。双光子吸收过程完全不同于单光子吸收过程，而是荧光团与激发光相互作用的过程。与单光子吸收相比，双光子吸收是非线性吸收过程，属于三阶非线性效应的一种；在双光子吸收过程中，物质分子的吸收强度、电子跃迁几率与激发光强度的平方成正比；双光子吸收发生在焦点处λ3(λ为激发波长)的空间范围内，而单光子吸收发生在整个聚焦光路范围内。因此，双光子吸收激发光穿透作用强，瑞利散射小，具有更高的空间分辨率和选择性；减少了对被测生物标本样品的光致毒性以及对荧光的光漂白，增加了有效观测时间；长波吸收短波发射，波长处于生物光学窗口(700～1 100 nm)范围内，有效避免了紫外-可见光损伤，有利于生物样品的实时动态观测。双光子技术在信息、材料、生物荧光识别、医学荧光诊断等领域正显示出广阔的应用前景[18-22]。

2 有机双光子线粒体内活性小分子荧光探针研究现状

目前用于活细胞线粒体特异性荧光成像的荧光探针主要有两种，一种是商品化线粒体荧光探针；另一种是具有与线粒体定位功能的亲脂性的阳离子基团。商品化线粒体荧光探针主要有两大类[23]：一类是罗丹明类，如罗丹明123(Rh23)、四甲基罗丹明甲酯(TMRM)以及Invitrogen公司开发的MitoTracker Orange/Red CM系列等；另一类是菁染料，如MitoTracker Green/Red/Deep Red FM系列。三苯基季磷盐是一种高效的线粒体定位功能的阳离子基团，具有较强的疏水性，能够有效穿透疏水性膜，连接在活性小分子荧光团上可实现对细胞中线粒体内活性物质的检测和荧光成像[24-25]。研究人员将对细胞内活性小分子或金属离子具有识别作用的荧光基团与具有线粒体靶向作用的亲脂性阳离子相连接，可实现对线粒体内这些物质的检测与成像。目前报道的大部分有机线粒体内活性小分子荧光探针均为单光子荧光探针，虽然这些探针也能用双光子进行激发，但其双光子吸收截面小，荧光量子产率较低，还存在背景干扰大、光稳定性差、毒性大、选择性差、斯托克斯(Stokes)位移小等缺点。而对于有机双光子线粒体内活性小分子荧光探针的报道则相对较少，对其生物学机制的研究尚不够深入，其研究也刚刚起步。下文就近年来有机双光子线粒体内活性小分子荧光探针的研究进展作了比较系统的评述 ,并展望了此类探针未来的发展趋势。

2.1 有机线粒体小分子荧光探针

线粒体不仅是细胞的能量工厂，而且是细胞生存与死亡的调控中心、与细胞凋亡、氧自由基产生、心血管病、神经性疾病、机体衰老、癌症等疾病密切相关[26-27]。因此，构建性能优越，且能全面、准确检测细胞内线粒体的荧光探针对于研究线粒体内复杂的生物学过程具有重要的科学意义。Zhang等[28]以氟化硼络合二吡咯甲川类染料(BODIPY)为母体，开发了一种不受膜电位干扰的能够准确定位线粒体的荧光探针1(图1),实现了活细胞内线粒体的单光子荧光成像，是一例非常优质的线粒体定位染料。Miao等[29]以咔唑为母体环结构，吡啶阳离子为识别基团，设计合成了1对定位活细胞内线粒体的双光子荧光探针2和3(图1)。这对探针具有较大的双光子活性吸收截面和Stokes位移、良好的膜透性、较长的保留时间、较高的光稳定性以及优异的复染相容性等特性，是一类有较好应用价值的双光子线粒体荧光探针。Dai等[30]以萘二甲酰亚胺为母体环结构，三苯基季磷盐阳离子为识别基团，设计合成了一个双光子线粒体荧光探针4(图1)。该探针透膜性好、选择性好、对线粒体极性敏感，实现了活细胞内线粒体的双光子光子荧光成像，有望发展成为一种新型的检测线粒体微环境变化的双光子荧光探针。

图1 探针1～4的化学结构式Fig.1 Chemical structures of probes 1～4

2.2 有机线粒体过氧化氢(H2O2)小分子荧光探针

H2O2是生物体内主要的活性氧之一，在生物学功能和许多病理生理学过程中发挥着重要作用。线粒体产生活性氧会形成H2O2和过氧亚硝酸盐等超氧化物和过氧化物，体内适量水平的H2O2有益于生物正常的生理过程，然而体内过量的H2O2则会导致细胞氧化性损伤、糖尿病、心血管疾病、神经系统性疾病、癌症等疾病[31-33]。因此，适时准确地对细胞线粒体内H2O2含量的动态监测对于某些疾病的预防、诊断具有十分重要的意义。Dickinson等[34]首次报道了一种新型的利用双官能团选择性检测活细胞线粒体内H2O2的单光子荧光探针5(图2)。该探针利用H2O2对硼酸酯的选择性氧化作用和三苯基季磷盐阳离子对线粒体的靶向作用成功实现了对线粒体内H2O2的专一性检测。共焦荧光成像和流式细胞术实验表明，该探针可以成像各种哺乳类动物细胞系内的线粒体H2O2含量的变化以及帕金森病氧化应激模型引起的H2O2浓度增加效应。

Masanta等[35]也利用H2O2对硼酸酯的选择性氧化作用和三苯基季磷盐阳离子对线粒体的靶向作用报道了一个对线粒体内H2O2专一性识别的荧光探针6(图2)，但该探针为双光子比率荧光探针。当探针与H2O2作用后，该探针的发射光颜色由蓝色变为黄色，具有选择性好、双光子吸收截面大、毒性低、不受pH值干扰等特点，实现了活细胞和活组织(成像深度达100～180 μm)中线粒体内H2O2的双光子荧光比率成像。

图2 探针5和6的化学结构式以及与H2O2的作用机理Fig.2 Chemical structures of probes 5 and 6 and their response mechanisms to H2O2

2.3 有机线粒体硫化氢(H2S)小分子荧光探针

图3 探针7～11的化学结构式Fig.3 Chemical structures of probes 7～11

H2S是继NO和CO之后的第3种气体信号分子，具有调节细胞生长、传递调控神经信号、保护心血管系统、抑制发炎以及抗氧化等多种生理作用，其含量水平发生异常还与阿尔兹海默氏症、唐氏综合症、糖尿病和肝硬化等多种疾病密切相关[36-38]。 因此，发展快速、准确检测生物体内H2S浓度变化的荧光探针对于生命科学、分析科学和医学具有重要意义。Wang等[39]以菁染料为荧光团，利用H2S对硝基的还原性质，开发出一种利用硝基功能团检测H2S的近红外荧光探针7(图3)。在水溶液和活细胞中均得到了积极的近红外荧光信号响应，实现了活细胞内H2S浓度变化的实时荧光成像，可望应用于生物体系中H2S的原位分析。Mao等[40]以萘为荧光团，叠氮基为识别基团，报道了一种新型的检测活细胞内H2S的双光子荧光探针8(图3)，可实现活细胞内H2S的双光子荧光成像，在生物体系中具有潜在的应用价值。探针7和8只是检测细胞内H2S的单、双光子荧光探针，而没有涉及到线粒体内H2S的检测。Chen等[41]设计合成了一种由混合荧光团(部花箐和香豆素结构)组成的检测线粒体内H2S的单光子比率荧光探针9(图3)。该探针在中性pH值条件下，实现了对H2S的快速、专一性响应，同时该探针水溶性好、透膜性好，可实现对活细胞中线粒体内H2S的单光子荧光成像。Liu等[42]以1,8-萘二甲酰亚胺为荧光团，4-叠氮基苯-氨基甲酸酯为识别位点，设计合成了两个比率型的识别H2S的单、双光子探针10和11(图3)。两个探针均具有选择性好、检出限低、毒性低、稳定性好、pH值干扰小等特点，实现了活细胞中H2S的单、双光子荧光成像。细胞成像实验证明，探针11是一个新型的专一识别线粒体内H2S的双光子荧光探针，在生物学领域具有广泛的应用价值。

图4 探针12的化学结构式以及与的反应机理Fig.

2.5 有机线粒体金属离子小分子荧光探针

生物体内存在着各种各样的金属离子，它们对生命过程起着至关重要的作用，如Ca2+，Mg2+，Zn2+和Pb2+等在细胞的生长生存、功能调节、电子传递以及体内生物活性酶的催化等方面均扮演着重要角色[46-47]。另外，人体细胞中金属离子含量过高或过低都将导致人体生理功能发生紊乱，从而引发各种疾病，甚至致癌和致畸[48-50]。因此，实时定点监测金属离子在生命科学、环境科学和医学研究领域有着极为重要的意义。Shindo等[51]基于罗丹明开发了一个能够检测线粒体内Mg2+浓度变化的单光子荧光探针13(图5)。在生理条件下，该探针的荧光性质伴随线粒体内Mg2+浓度的变化而变化，且能够检测线粒体膜Mg2+的运输变化，实现了线粒体内Mg2+的荧光成像。Masanta等[52]结合Zn2+螯合基团和三苯基季磷盐阳离子合成了测定线粒体内Zn2+含量的双光子探针14(图5)。该探针与Zn2+作用后，双光子荧光强度增强7倍，双光子活性吸收截面达75 GM，其选择性好、灵敏度高、不受pH值干扰，实现了大鼠海马切片100～200 μm深处线粒体内Zn2+的双光子荧光成像。Baek等[53]设计合成了一个与探针14结构相似的用于测定线粒体内Zn2+含量的双光子探针15(图5)。该探针与Zn2+作用后，双光子荧光强度增强70倍，双光子活性吸收截面达155 GM，具有吸收截面大、选择性好、灵敏度高、对pH值不敏感等特点，同样实现了大鼠海马切片100～200 μm深处线粒体内Zn2+的双光子荧光成像。

图5 探针13～15的化学结构式Fig.5 Chemical structures of probes 13～15

2.6 有机线粒体次氯酸(HClO)小分子荧光探针

次氯酸根(ClO-)是生物体内重要的活性氧组分之一，在生物体内发挥着重要的生理作用,其水平过量或发生紊乱，会引发动脉硬化、关节炎、心血管疾病、肺部损伤以及某些癌症等一系列疾病[54-57]。因此，研究开发新型、高效的ClO-荧光探针对于研究ClO-的生理功能具有重要的生物学意义。Hou等[58]基于三苯基季磷盐和吡啶盐双阳离子，合成了两个比色检测线粒体内次氯酸盐的单光子荧光探针16和17(图6)。两个探针具有水溶性好、响应时间快、检测灵敏度及选择性高、透膜性好等特征，实现了活细胞和活体老鼠中线粒体内次氯酸盐的荧光成像，有望作为分子工具在化学和生物上得到广泛应用。Yuan等[59]报道了一个新型的识别线粒体内HClO的双光子探针18(图6)。该探针的灵敏度高、选择性好、响应时间快、膜透性好，具有较强的线粒体定位能力，可实现活细胞中线粒体内HClO的双光子荧光成像，为进一步阐明亚细胞中HClO的分布以及研究亚细胞或组织中HClO潜在的生物功能提供了有力的工具。

图6 探针16～18的化学结构式Fig.6 Chemical structures of probes 16-18

2.7 有机线粒体巯基小分子荧光探针

生物体内存在着多种重要的巯基小分子，如半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)以及还原型谷胱甘肽(GSH)等均在细胞生理和病理过程中发挥着重要作用。它们结构相似，生理功能各异，且不可或缺，机体内这些巯基小分子水平的异常，往往诱发多种疾病，如生长缓慢、水肿、心血管疾病、老年痴呆症、组织癌变等[60-63]。目前检测线粒体内Cys，Hcy和GSH的荧光探针鲜见报道，因此，开发高选择性地识别线粒体内Cys，Hcy和GSH的荧光探针，并实现其在活细胞中的双光子荧光成像对于研究巯基小分子的产生、分布及水平波动有着重要的科学意义。Lim等[64]利用巯基和二硫键发生作用，报道了一个比率型的识别线粒体内巯基小分子的双光子探针19(图7)。在巯基存在的情况下，该探针的发射光由蓝色变为黄色，且毒性低、选择性好、膜透性好、对pH值不灵敏、双光子吸收截面大，可实现活细胞和活组织中线粒体内巯基小分子的双光子荧光成像。但专一性识别线粒体内巯基分子的双光子荧光探针还未见报道。

图7 探针19的化学结构式以及与GSH的反应机理Fig.7 Chemical structure of probe 19 and its reaction mechanism to GSH

图8 探针20的化学结构式Fig.8 Chemical structure of probe 20

图9 探针21的化学结构式Fig.9 Chemical structure of probe 21

2.8 有机线粒体粘度小分子荧光探针

生物细胞内不同区域的粘度值也存在很大差别，细胞粘度值的变化会引起细胞内很多生理疾病或机体生理功能的改变。研究表明，细胞内粘度的变化可以改变线粒体膜的流动性，线粒体粘度的增加可能会导致许多疾病，如阿尔茨海默病、糖尿病、帕金森病、癌症等[65-67]。因此，准确检测细胞内微环境粘度含量的变化具有非常重要的意义。Liu等[68]基于菁染料分子内自旋会受到粘度的影响，成功设计合成了一种双光子线粒体内比色粘度荧光探针20(图8)。该探针可以检测线粒体内粘度(粘度值范围在1～950 cp)的变化，从而实现活细胞和活组织(成像深度达60～130 μm)线粒体内粘度的双光子荧光成像。

2.9 有机线粒体pH值小分子荧光探针

细胞内pH值在多种细胞活动中起着重要作用，研究发现，pH值异常变化与人体多种疾病相关，如癌症、肾衰竭、肺病、老年痴呆症等[69-71]。因此，实时动态监测细胞内pH值的变化对于研究细胞生理和病理过程具有重要意义。Wu等[72]基于香豆素吡啶盐阳离子合成了一种实时检测活细胞线粒体内pH值变化的荧光探针21(图9)。该探针水溶性好，具有优异的pH值敏感特性和抗干扰能力，与商用线粒体示踪器相比，对活细胞线粒体具有较高的专一定位能力以及良好的生物相容性。共焦成像实验证实，该探针可以实时监控线粒体酸度、细胞凋亡和应激反应时的pH值变化。但该探针为单光子线粒体pH值荧光探针，有关双光子线粒体内pH值荧光探针尚未见报道。

2.10 其它线粒体内活性小分子的荧光探针

除了上述报道的检测活细胞中线粒体内活性小分子荧光探针外，还包括诸如线粒体表面探针[73]、线粒体NO探针[74]、线粒体膜电位探针[75]等其它线粒体内活性小分子荧光探针。另外，除了利用荧光分析法检测线粒体内活性小分子外，还包括磷光分析法[74]、纳米粒子类[76]、配合物类[77]等其它类型的分析方法。

3 总结与展望

目前虽已报道了许多有机线粒体内活性小分子荧光探针，但关于有机双光子线粒体内活性小分子的荧光探针仍相对较少。因此，有机线粒体内活性小分子荧光探针仍存在着以下亟待解决的问题：①目前报道的大部分线粒体内活性小分子荧光探针的活性吸收截面较小，Stokes 位移较小，量子产率不高。因此，寻找具有大双光子活性吸收截面、大Stokes位移、高荧光量子产率和识别响应的线粒体内活性小分子荧光探针具有重要的科学价值和研究意义。②短波长光易受到生物体系自发荧光和散射光的干扰，红光具有光毒性低、光损伤小、背景荧光干扰小、样品穿透性强、检测灵敏度高和便于观测等优点。因此，设计、合成红光和近红外光发射的线粒体内活性小分子双光子荧光探针将会非常必要。③发展毒性很低甚至无毒，能够实现细胞特别是活细胞成像的双光子线粒体内活性小分子荧光探针已显得尤为重要。④比率型荧光探针能够消除探针的浓度差异及外界的干扰因素，从而提高方法的选择性、灵敏度和动态响应范围。因此，发展比率型双光子线粒体内活性小分子荧光探针将是未来研究的重要方向。⑤ 加大线粒体探针种类研究以满足线粒体内部复杂环境检测的要求，同时对探针分子的识别机理有待于深入研究和探讨。总之，随着人们对线粒体内活性小分子荧光探针研究的不断深入，发展具有高灵敏度、水溶性好、生物相容性好、光稳定性好、毒性低，能够快速成像线粒体内活性小分子的双光子荧光探针将是今后的主要方向。

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Research Progress in Organic Two-photon Fluorescent Probes for Active Small Molecules in Mitochondria

YANG Zhi-guang*,LI Yun-lin,CHEN Ya-hong,GUO Lei,ZHANG Jian-fu,PENG Peng

(College of Chemistry and Chemical Engineering,Zhoukou Normal University,Zhoukou 466001,China)

Mitochondria plays a key role in energy metabolism of cells,and the small changes of internal environment in mitochondria will affect the normal cell life activities.In the meanwhile,many active small molecules in mitochondria also play a key role in many physiological process.Therefore,visual monitoring of mitochondrial itself and its changes of the internal micro environment are of great importance for the research of biological phenomenon，disease diagnosis and treatment.Fluorescence method has been extensively used due to its advantages of simple operation,high sensitivity and selectivity,real-time detection and little damage to organisms.The two-photon fluorescent probe technique has shown a much broader application prospect in the field of life sciences compared to the one-photon fluorescent probe technique as it has many advantages,such as absorbing light of longer wavelength with lower energy but emitting shorter wavelength，high three-dimensional spatial selectivity，large penetration depth，avoidance of photodamage and photobleaching and lower tissue auto-fluorescence.The basic principle of organic two-photon absorption and the research status of organic two-photon fluorescent probes for active small molecules in mitochondria were introduced,as well as the trends of organic fluorescent probes for active small molecules in mitochondria in the future were prospected.Key words：mitochondria;active small molecules;two-photon;fluorescent probes;detection；review

2015-10-15；

2015-12-13

河南省高等学校重点科研项目计划资助(15A430055)；周口师范学院校本项目资助(ZKNUB115201)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.05.023

O622；TP212.2

A

1004-4957(2016)05-0627-08

*通讯作者：杨志广，博士，讲师，研究方向：有机功能材料及无机纳米材料，Tel：18238475979，E-mail：yangzhiguang2006420@126.com