基于DNA银铂双金属纳米簇的电化学传感器用于Hg2+的检测

傅贤明，刘智晶，蔡淑贤，李　萍，李云腾，陈敬华*

(1.莆田学院　药学与医学技术学院，福建　莆田　351100；2.福建医科大学　药学院

药物分析学系，福建　福州　350108)

研究简报

基于DNA银铂双金属纳米簇的电化学传感器用于Hg2+的检测

傅贤明1，刘智晶2，蔡淑贤2，李萍1，李云腾1，陈敬华2*

(1.莆田学院药学与医学技术学院，福建莆田351100；2.福建医科大学药学院

药物分析学系，福建福州350108)

摘要：以DNA为模板，通过一步法合成了一种银铂双金属纳米簇(DNA-Ag/Pt NCs)，其粒径为2～4 nm，并表现出较强的过氧化物模拟酶活性，能催化H2O2氧化TMB使溶液变蓝色。基于此特性，结合Hg2+可与胸腺嘧啶碱基形成T-Hg2+-T结构，设计研制了一种非标记的电化学传感器，用于Hg2+的灵敏特异性检测。实验结果表明，在最佳条件下，该传感器的检测范围为0.65～3.5 nmol/L，检出限达0.17 nmol/L，能较好地识别Hg2+。该传感器有望用于实际水样中痕量汞的检测。

关键词：DNA模板；双金属纳米簇；模拟酶；汞离子；电化学传感器

随着我国生产技术的发展、工业化进程的加快及城市人口的迅猛增长，环境污染日益严重，逐渐演变为一个重大的社会问题，成为人们关注的焦点。环境中的重金属污染，严重威胁着人类的健康。汞是对人类健康和环境最具危害性的剧毒重金属元素之一。汞进入生物体中很容易被吸收，难降解，易在体内积累，并可通过食物链不断富集，当达到一定浓度时，会引发一系列精神和神经系统方面的疾病[1-3]。生活中急性或慢性汞中毒并不少见，因此如何方便快速地检测环境中的Hg2+显得格外重要。目前，传统的测定痕量汞的方法主要有电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)[4]、石墨炉原子吸收光谱法[5]、冷蒸气原子吸收光谱法[6]、荧光光谱法[7]、电化学发光法[8-9]等。这些方法虽然可以有效地测定Hg2+，但由于需要昂贵的仪器、复杂的处理过程或较长的分析周期，不可避免地限制了其实际应用。

近年来，Ono团队[10-11]研究发现，Hg2+可选择性地与胸腺嘧啶(T碱基)结合，形成T-Hg2+-T发卡结构。受其启发，人们设计研制了许多基于DNA的Hg2+传感器，用于分析检测溶液中的Hg2+，如比色传感器[12-13]、荧光传感器[14]、电化学传感器[15-16]等。在这些检测法中，电化学方法因具有所需仪器成本低、操作方便快速、灵敏度高等优点而受到关注。但痕量汞的电化学检测策略和方法往往需要通过一些标记措施，如在一端标记电化学活性物质二茂铁Fc[15]或亚甲基蓝MB[16]等，通过测定电活性物质的氧化还原电流，构建“Turn-on”或“Turn-off”型检测方法。这些标记措施，使得操作流程变得复杂或昂贵，并影响了传感器的稳定性和实用性。因此，简单易用、价廉、灵敏度高的非标记型的电化学传感器正成为研究方向。而值得注意的是，人造模拟酶因可用于非标记型传感器的制作正逐渐引起人们的兴趣。与天然酶相比，人造酶具有合成简单、价格低廉、性能稳定等优点。目前，已发现一些贵金属纳米粒子[17-19]、金属氧化物纳米材料[20]、碳纳米材料[21]及复合材料[22-23]具有过氧化物模拟酶活性，能催化H2O2氧化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)。但因模拟酶活性较低，使用时产生的电化学信号较弱，限制了传感器的灵敏度。本文以DNA为模板，通过一步法合成了一种DNA银铂双金属纳米簇，这种双金属纳米簇具有较强的过氧化物模拟酶活性。利用这一特性，设计研制了一种简单、无标记的电化学传感器，并将其用于Hg2+的高灵敏检测。

1实验部分

1.1仪器与试剂

CHI660D电化学分析仪(上海辰华仪器公司),三电极系统：玻碳电极(GCE，Ф3 mm)为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极；UV-2450型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；Cary Eclipse荧光分光光度计(安捷伦科技有限公司)；KQ116型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；VS-100H型恒温混匀仪(无锡沃信仪器有限公司)；H1650-W型台式微量高速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；pHS-3B型精密酸度计(上海雷磁仪器厂)；BS110S电子分析天平(德国 Sartorius公司)。

硝酸银(AgNO3)、30%过氧化氢(H2O2)、柠檬酸三钠(C6H5Na3O7·2H2O)、二水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)、十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、硼氢化钠(NaBH4)、氯化汞(HgCl2)均购自国药集团化学试剂有限公司；四氯铂酸钾(K2PtCl4，Adamas 试剂有限公司)；3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB，Aladdin工业公司)；3-吗啉丙磺酸(MOPS，Sigma-Aldrich化学有限公司)；其它试剂均为分析纯。实验用水为Millipore Milli-Q系统净化的超纯水(18.2 MΩ·cm)。

相关DNA序列均由生工生物工程(上海)有限公司合成，碱基序列如下：用于合成Ag/Pt NCs的富含C碱基的模板DNA序列(T1)：5′-CCC CCT AAC TCC CCC-3′；含C碱基较少的任意DNA系列(T2)：5′-GCG ACA TGG TAA TGG-3′；富含T碱基的DNA序列(T3)：5′-GGT TGT TTG TT-3′；5′-端氨基标记富含T碱基的DNA探针序列(AP)：5′-CCC CCT TCT TTC TTC C-3′；由T1和T3序列相连接的DNA探针序列(TP)：5′-CCC CCT AAC TCC CCC AAA AAG GTT GTT TGT T-3′，TP序列中间插入了一段含有5个A碱基的连接序列。

1.2银铂双金属纳米簇的制备

将10 μL AgNO3(1 mmol/L)溶液、10 μL DNA(100 μmol/L，T1或TP)溶液和20 μL K2PtCl4(3 mmol/L)溶液混合后，加入60 μL柠檬酸三钠(10 mmol/L)溶液，暗处反应10 min后加入100 μL NaBH4(200 μmol/L)溶液，45 ℃金属浴5 min，冷却至室温后得到DNA-Ag/Pt NCs，置于4 ℃冰箱中保存。

1.3银铂双金属纳米簇的米氏实验

将10 μL DNA-Ag/Pt NCs(5 μmol/L)溶液和20 μL H2O2(500 mmol/L)溶液加入到130 μL HAc-NaAc(200 mmol/L，pH 4.0)缓冲溶液中，向上述混合液中加入40 μL新鲜配制的不同浓度的TMB溶液，在紫外可见分光光度计上固定波长为652 nm，以时间扫描方式进行动力学实验测定。由Michaelis-Menten双倒数方程1/v=(Km/Vmax)(1/[S])+1/Vmax(式中v为初始反应速率，Km为表观米氏常数，Vmax为最大反应速率，[S]为底物浓度)，分别计算出酶催化反应的Km和Vmax。

1.4探针修饰电极的制备

将玻碳电极(GCE)依次用直径为0.3，0.05 μm的Al2O3和水的混合物抛光至镜面，并先后用无水乙醇、水超声清洗5 min，以除去吸附在电极表面上的杂质，用水冲洗，氮气吹干。

将处理后的GCE置于0.01 mol/L多聚赖氨酸(PLLy)溶液中，用循环伏安法电聚合修饰PLLy膜，再用水冲洗电极后于室温下干燥，得到PLLy修饰电极(PLLy/GCE)。将电极倒置，在电极表面滴加5 μL偶联活化剂(内含5 mmol/L EDC和8 mmol/L NHS的pH 7.4磷酸缓冲液)，室温自然蒸干，用水冲洗，除掉未结合在修饰电极表面的偶联活化剂，氮气吹干。然后在电极表面滴加5 μL的AP溶液，一定时间后用水冲洗电极并氮气吹干，最后滴加含不同浓度Hg2+的TP-Ag/Pt NCs溶液，结合一定时间后再次清洗吹干，得到探针修饰电极(TP-Ag/Pt NCs/Hg2+/AP/PLLy/GCE)。

1.5电化学检测

将探针修饰电极(TP-Ag/Pt NCs/Hg2+/AP/PLLy/GCE)插入含有0.8 mmol/L TMB、15 mmol/L H2O2的PB(100 mmol/L，pH 5.0)缓冲溶液中，测量其CV曲线和I～t曲线。CV法的初始电位为-0.20 V，扫描速率为0.10 V/s，采样间隔为0.001 V，静置时间为2 s。I～t法的初始电位为-0.10 V，采样间隔为0.10 s，实验时间100 s，静置时间为0 s。

2结果与讨论

2.1电化学传感器检测机理

传感策略如图1所示，富含C碱基的T1序列可作为DNA模板用来合成银铂双金属纳米簇，该纳米簇具有过氧化物模拟酶活性，能催化H2O2氧化TMB使溶液显蓝色。为了将其催化性能应用于电化学传感器，进行如下设计：利用Hg2+可与胸腺嘧啶(T碱基)形成T-Hg2+-T发卡结构，选用两条富含T碱基的DNA序列，一条经5′-端氨基标记后(AP)通过酰胺键连接于玻碳电极上，另一条与T1序列相连接(TP)，用来合成银铂双金属纳米簇(TP-Ag/Pt NCs)，当目标物Hg2+存在时，两条序列通过T-Hg2+-T发卡结构杂交起来，从而完成电极的组装。

将此电极插入含有TMB和H2O2的溶液中扫描I～t曲线，对比无Hg2+存在的情况，可观察到电流明显增大，同时溶液的颜色由无色变为蓝色。电流的大小与Hg2+的浓度成正比，因此可用于Hg2+的定量检测。

图2　DNA-Ag/Pt NCs的透射电子显微镜图Fig.2　TEM image of DNA-Ag/Pt NCs

2.2银铂双金属纳米簇的合成表征

Dickson等[24]首次采用短的核苷酸链合成银纳米簇。Ag+与胞嘧啶(C碱基)之间存在较强的亲合力，通过化学还原的方法，用NaBH4还原结合在胞嘧啶周围的Ag+，被还原的Ag原子位于寡核苷酸的胞嘧啶上。当还原出的纳米簇的尺寸足够小时，DNA-Ag NCs会展示出强烈的吸收和发射性能，具有较好的荧光性质。本实验选用富含C碱基的DNA序列(T1)作为合成模板，并在合成过程中同时加入了Ag+和Pt2+。在NaBH4的还原作用下，Ag+首先与富含C碱基的T1序列生成Ag NCs，而后通过Ag原子和Pt2+离子间的置换反应，在Ag NCs的表面上生成Pt NCs，生成的Ag+同时又被NaBH4还原为Ag NCs，如此持续反应，最终生成银铂双金属纳米簇(DNA-Ag/Pt NCs)[25]。

图2为DNA-Ag/Pt NCs的透射电子显微镜图，从图中可以看出，银铂双金属纳米簇的直径为2～4 nm，形状近似球形且分布较均匀，如此小的粒径归功于DNA模板提供了一个狭窄的纳米级的生长空间。DNA-Ag NCs具有显著的荧光特性，而DNA-Ag/Pt NCs却观察不到任何荧光现象，这可能是因为生成双金属簇时铂簇覆盖在银簇的表面，从而导致了银簇的荧光猝灭。

2.3银铂双金属纳米簇的模拟酶活性

DNA-Ag/Pt NCs具有过氧化物模拟酶活性，能催化H2O2氧化底物TMB，使溶液显蓝色。而相同反应条件下合成的DNA-Ag NCs却没有模拟酶活性。因此，DNA-Ag/Pt NCs的过氧化物酶活性应该来源于堆积在Ag NCs表面上的Pt NCs，而Ag NCs对Pt NCs的生成起到了协同促进作用[25]。为了验证这一结论，做了如下两个实验：①在相同反应条件、不加AgNO3情况下进行合成，所得产物并不能使H2O2/TMB体系变色，说明产物并非Pt NCs；②在相同的实验条件下，将DNA模板T1系列更换为含C碱基较少的T2系列和含T碱基较多的T3系列进行同样合成，所得产物也不能使H2O2/TMB体系变色，说明T2和T3系列并不能作为Ag/Pt NCs的合成模板。这两个实验结果证明了Pt NCs的生成有赖于Ag NCs的存在作为支持，而选择一条有利于Ag NCs生成的富含C碱基的DNA系列作为合成模板是DNA-Ag/Pt NCs合成成功的关键。同时，这也说明对于TP系列(由T1和T3相连接而成)，T3序列的存在并不影响T1序列作为合成的模板，符合上述传感策略设计的思想。

为了获得最佳的催化活性，在相同实验条件下比较了一系列不同银铂比的双金属纳米簇催化氧化TMB后在652 nm处的吸收峰强度。发现当c(AgNO3)∶c(K2PtCl4)= 1∶6时，652 nm处具有最强的吸收峰，故合成实验中AgNO3和K2PtCl4的浓度比固定为1∶6。

为了更进一步明确DNA-Ag/Pt NCs的催化性能，利用动力学方法求得其酶促反应的米氏方程，得到DNA-Ag/Pt NCs的表观米氏常数Km=136 μmol/L。与同样具有过氧化物模拟酶活性的其它物质(如：DNA-Pt NPs的Km=4.88 mmol/L[26]；Pd NPs的Km=650 μmol/L[27]；PtPdNAs/GNs的Km=0.33 mmol/L[28]；H-GNs的Km=5.1 mmol/L[29]；Hemin的Km=4.84 mmol/L[29]；Fe0.5Co0.5NPs的Km=1.79 mmol/L[30]。底物均为TMB)相比，DNA-Ag/Pt NCs的Km值更小，说明DNA-Ag/Pt NCs与底物TMB的亲合性更强。同时DNA-Ag/Pt NCs具有易合成、价廉、易标记、稳定性好等优点，有望应用于不同的生物传感器，用于对小分子、蛋白质或DNA的比色法分析。

图3　不同电极的CV图Fig.3　Cyclic voltammograms(CVs)of different electrodesa.bare electrode,b.PLLy membrane electrode,c.blank electrode(without Hg2+),d.modified electrode(Hg2+3.5 nmol/L)；insert:photographs of TMB oxidation catalyzed by blank electrode(colorless) and modified electrode(blue)

2.4电化学传感器测定Hg2+

2.4.1CV图表征通过扫描裸电极(GCE)、膜电极(PLLy/GCE)、空白电极(不含Hg2+)和修饰电极(TP-Ag/Pt NCs/Hg2+/AP/PLLy/GCE)在含有H2O2/TMB的PB缓冲溶液(以下简称显色液)中的CV图，对传感过程进行表征。图3中观察到TMB的两组特征氧化还原峰。图3曲线a为裸电极的CV图，峰电流很小。曲线b和曲线c为膜电极和空白电极的CV图，峰电流有所增大，但相对较小。曲线d为修饰电极的CV图，峰电流明显增大，这是因为当目标物Hg2+存在时，电极连接上TP-Ag/Pt NCs，可催化氧化显色液中的TMB，从而产生放大的氧化还原峰电流，并可使显色液变蓝。以上研究结果与实验设想一致。

2.4.2实验条件的优化为了获得相对较大的电流，对实验条件进行了一系列的优化。在不同起始电位条件下扫描I～t曲线，确定最佳起始电位为-0.1 V；固定Hg2+的浓度不变，对电极的组装浓度比进行优化，确定AP和TP-Ag/Pt NCs的最佳浓度比为0.1 μmol/L∶0.1 μmol/L；在最佳浓度比条件下，对Hg2+的结合时间进行优化，确定结合时间为60 min。

图4　传感器对不同离子的电流响应Fig.4　Specificity investigation of the sensor for Hg2+against other ions(3 nmol/L for each)

Added(nmol/L)Detected(nmol/L)Recovery(%)RSD(%)0-*1.21.1696.75.72.22.31105.06.53.23.27102.26.9

* no detected

2.4.3Hg2+的定量检测在选定的最佳实验条件下，将结合不同浓度Hg2+的修饰电极插入显色液中，扫描I～t曲线。结果显示，随着Hg2+浓度(c)的增加，电流(I)逐渐增大，且ΔI与c在0.65～3.5 nmol/L范围内呈较好的线性关系。线性回归方程为：ΔI(nA)=239.86c(nmol/L)+2.99(r2=0.991 6)，检出限(3σ/n)为0.17 nmol/L。Lee等[12]和Kanayama等[13]分别报道了一种基于金纳米粒子的比色法检测Hg2+，检出限分别为100 nmol/L和0.5 μmol/L；Xia等[14]报道了一种标记型的荧光方法检测Hg2+，检出限为100 nmol/L；Liu等[15]报道了一种二茂铁Fc标记的电化学传感器用来检测Hg2+，检出限为0.5 nmol/L；Jiang等[16]报道了一种MB标记的检测Hg2+的电化学传感器，检出限为8.2 nmol/L。与上述文献方法对比，本实验研制的新型传感器对Hg2+具有更高的分析灵敏度。另外，用浓度为1.5 nmol/L的Hg2+重复8次实验，相对标准偏差(RSD)为6.5%，说明该传感器具有较好的重现性。

2.4.4传感器的特异性在相同实验条件下考察了该传感器对其它离子的选择性(图4)。结果显示，当目标离子为K+,Ca2+，Na+，Mg2+，Bi3+，Cu2+，Pb2+，Zn2+，Cr3+时，传感器的电流响应值较小，而当目标离子为Hg2+时，电流响应值则大大增加，净电流强度为其它离子的4.4～54.3倍，说明该传感器对Hg2+具有很好的选择性，这主要归功于传感策略设计中使用了富含T碱基的AP和TP序列，它们能特异性识别Hg2+形成T-Hg2+-T发卡结构，而对其它离子不响应。因此，本实验研制的传感器能够实现对Hg2+的特异性识别和检测。2.4.5水样的检测最佳实验条件下，在自来水中添加Hg2+，用该传感器进行分析检测，结果如表1所示。对相同浓度的水样进行5次重复检测，回收率为96.7%～105.0%，RSD为5.7% ～6.9%，结果令人满意。该新型传感器有望用于实际样本中痕量Hg2+的测定。

3结论

本实验合成了一种DNA银铂双金属纳米簇，这种双金属纳米簇具有过氧化物模拟酶活性，利用这一特性，结合Hg2+可与T碱基形成T-Hg2+-T发卡结构，设计研制了一种简单、无标记的电化学传感器，用于Hg2+的高灵敏、高特异性检测。实验结果表明，该新型传感器的检出限可达0.17 nmol/L，并能特异性识别Hg2+。该传感器有望用于实际水样中痕量汞的测定。

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Electrochemical Sensor for Detection of Mercury(Ⅱ)Based on DNA-templated Ag/Pt Bimetallic Nanoclusters

FU Xian-ming1,LIU Zhi-jing2,CAI Shu-xian2,LI Ping1,LI Yun-teng1,CHEN Jing-hua2*

(1.College of Pharmacy and Medical Technology,Putian University,Putian351100,China；2.Department of Pharmaceutical Analysis,School of Pharmacy,Fujian Medical University,Fuzhou350108,China)

Abstract：In this paper, a facile one-step approach to synthesize DNA-templated Ag/Pt bimetallic nanoclusters was developed.The obtained DNA-templated Ag/Pt bimetallic nanoclusters(DNA-Ag/Pt NCs) with diameters about 2-4 nm display a high efficient peroxidase-like catalytic activity,which can catalyze hydrogen peroxide(H2O2)-mediated oxidation of the substrate,3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine(TMB),to produce a blue color reaction.Based on this,the hairpin structure of thymine-Hg2+-thymine(T-Hg2+-T) interaction was utilized to design an unlabeled DNA electrochemical sensor for the Hg2+detection with high sensitivity and selectivity.Under the optimum conditions,the sensor showed a good linear relationship in the range of 0.65-3.5 nmol/L with a detection limit as low as 0.17 nmol/L and also exhibited an ultra high discrimination ability for Hg2+.All above properties make the sensor a promising candidate for Hg2+trace detection in real water samples.Key words：DNA template；bimetallic nanoclusters；mimic enzyme；mercury(Ⅱ)；electrochemical sensor

收稿日期：2015-08-14；修回日期：2015-10-15

基金项目：国家自然科学基金资助项目(21375017,21105012)；福建省自然科学基金杰出青年人才项目(2013J06003)；福建省科技厅重点项目(2013Y0045)；福建省高等学校新世纪优秀人才支持计划资助(JAl3130)；福建省卫生系统中青年骨干人才培养项目(2014-ZQN-ZD-26)；福建省大学生创新创业训练计划项目(莆田学院201511498053)

*通讯作者：陈敬华，博士，教授，研究方向：电化学生物传感器，Tel:0591-22862016，E-mail:cjh_huaxue@126.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.04.009

中图分类号：O657.1；Q524

文献标识码:A

文章编号:1004-4957(2016)04-0426-06