番茄中类胡萝卜素及其顺式异构体的HPLC分析

张　颖，陈华翰，李春美,2*

(1.华中农业大学　食品科学与技术学院，湖北　武汉　430070;2.华中农业大学

教育部环境食品学重点实验室，湖北　武汉　430070)

番茄中类胡萝卜素及其顺式异构体的HPLC分析

张颖1，陈华翰1，李春美1,2*

(1.华中农业大学食品科学与技术学院，湖北武汉430070;2.华中农业大学

教育部环境食品学重点实验室，湖北武汉430070)

摘要：建立了一种能同时快速分离、定性番茄中3种类胡萝卜素及其异构体的高效液相色谱(HPLC)方法。采用正己烷-乙醇(3∶4)对样品进行提取，甲基叔丁基醚+0.05%三乙胺-乙腈+0.05%三乙胺为流动相梯度洗脱，以Carotenoid C30柱(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)进行分离，检测波长为475 nm。结果表明，在优化实验条件下，番茄中有11种类胡萝卜素得到了良好分离，包括3种全反式异构体和8种顺式异构体。叶黄素、β-胡萝卜素、番茄红素分别在0.1～5.0，0.1～20，0.1～100 μg/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数均在0.99以上，检出限(LOD)分别为0.13，0.12，0.56 μg/g，定量下限(LOQ)分别为0.43，0.41，1.88 μg/g;日内相对标准偏差(RSD)为1.2%～5.3%，日间RSD为1.9%～7.5%，回收率分别为(88.9±6.1)%～(91.7±3.6)%,(92.3±4.3)%～(94.1±6.3)%，(102.6±4.2)%～(107.1±3.4)%。该方法具有分析时间短、灵敏度高、分离完全等优点，适用于番茄中类胡萝卜素及其顺式异构体的分析测定。

关键词：高效液相色谱法;类胡萝卜素;顺式异构体;番茄

番茄由于富含类胡萝卜素、抗坏血酸、酚类物质等多种抗氧化成分而深受世人喜爱。番茄及其制品对身体健康有诸多益处，尤其是对癌症、心血管疾病、动脉粥样硬化等疾病具有明显的抑制作用[1-3]。在番茄含有的所有抗氧化物质中，类胡萝卜素最受关注。类胡萝卜素不仅是维生素A合成的前体物质，还是番茄抗氧化能力的主要贡献物质。番茄中的类胡萝卜素主要以番茄红素、β-胡萝卜素、叶黄素的形式存在，三者在番茄中的含量依次减少。番茄红素分子中有11个共轭双键，1个番茄红素分子可清除数千个单线态氧，在类胡萝卜素中抗氧化性最高[4]。

由于类胡萝卜素对光、氧气和温度非常敏感，易发生异构化，加之在植物中的存在形式具有多样性，给其纯化分析带来很大困难，因此，发展更精确、快速的分析技术具有重要意义。食品中类胡萝卜素的常用分析方法有高效液相色谱法[5-6]、分光光度法[7]、薄层色谱法[8]等。分光光度法仅适用于测定单一类胡萝卜素的量或估算混合物中总类胡萝卜素含量，不能对混合物中各类胡萝卜素分别定性定量;薄层色谱法可对混合物中的类胡萝卜素进行分离，但定量很不准确，且分析时间长，重复性差;相比而言，高效液相色谱法具有分离效果好、选择性高、检测灵敏度高、分离速度快等[9-10]非常明显的优点。高灵敏度的HPLC可以测出样品中极少量的杂质、痕量类胡萝卜素和几何异构体[11]。高效液相色谱法通常配合使用C18柱，但C18柱对类胡萝卜素顺式异构体的分离效果较差。有文献报道指出用C30柱代替C18柱对类胡萝卜素顺反异构体具有更好的分离效果[12]。但现有的方法存在基线漂移、洗脱不完全、耗费时间和试剂[4,6,13]等诸多缺陷。因此，建立一种能使番茄中类胡萝卜素及其顺反异构体快速完全分离、定量准确的方法十分必要。

本文通过对HPLC流动相、洗脱程序等条件的筛选优化，建立了一种能快速同时分离番茄中3种类胡萝卜素及其异构体的HPLC方法。

1实验部分

1.1试剂与仪器

全反式叶黄素、全反式β-胡萝卜素和全反式番茄红素(纯度>90%，95%和98%)购自上海源叶生物技术公司;甲醇、乙腈、三乙胺(TEA)和甲基叔丁基醚(MTBE)均为色谱纯,购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;正己烷、丙酮、乙醇、乙酸乙酯和二氯甲烷等其余试剂均为分析纯。

Carotenoid C30色谱柱(250 mm×4.6 mm i.d.，粒度5 μm) ;Waters e2695型高效液相色谱仪;Waters 2998型PDA检测器;DLSB-5PO型低温冷却循环泵;SBS-100型旋转蒸发器;HJ-3型磁力搅拌器;HJS 880型打浆机。

1.2实验方法

1.2.1类胡萝卜素的提取新鲜番茄打浆，取10 g 番茄匀浆于容器中，加入100 mL提取溶剂，用铝箔避光。磁力搅拌30 min，加入15 mL双蒸水以加速不同极性溶剂分层。取上层有机相溶液旋干，残渣用10 mL二氯甲烷-正己烷(1∶9)复溶。过0.2 μm有机滤膜，进行液相色谱分析。

1.2.2类胡萝卜素的HPLC分析流动相：A为MTBE+0.05% TEA，B为乙腈+0.05% TEA。梯度洗脱条件：0～8 min，0%～55%A;8～25 min，55%A;25～30 min，55%～0%A。流速为1 mL/min，进样量为20 μL，检测波长为475 nm。

样品中类胡萝卜素全反式异构体的定性主要通过与相应标准品的保留时间和UV吸收光谱进行对比来鉴别。顺式异构体主要基于文献报道中各类顺式异构体的特征吸收光谱和Q值(Q值=A顺式峰/A最大吸收峰)进行定性[5,14]。

1.2.3标准储备溶液配制与标准曲线绘制将全反式β-胡萝卜素、叶黄素和全反式番茄红素标准品分别配成浓度为20，20，100 μg/mL的标准储备溶液，前两者用二氯甲烷-正己烷(1∶9)溶解，后者用二氯甲烷溶解。再分别用正己烷将全反式叶黄素标准储备液稀释至0.1，0.3，0.5，1.0，3.0，5.0 μg/mL，全反式β-胡萝卜素标准储备液稀释至0.1，0.5，2.0，5.0，10，20 μg/mL，由于番茄中番茄红素全反式异构体和顺式异构体在含量上有很大差别[4]，因此将全反式番茄红素标准储备液稀释成两种浓度梯度的标准工作液，分别为0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2 μg/mL和10，20，40，60，80，100 μg/mL。

1.2.4统计学分析实验数据以平均数±标准差表示，用IBM SPSS Statistics 19软件进行统计学分析，显著性采用单因素方差分析。P<0.05表示具有显著性差异。

2结果与讨论

2.1番茄中类胡萝卜素的提取

番茄中的类胡萝卜素主要以番茄红素、β-胡萝卜素、叶黄素的形式存在，由于它们具有不同的极性、溶解性，因此，对番茄红素有较高提取效率的溶剂可能不适用于对β-胡萝卜素和叶黄素的提取。另外，不同空间结构的类胡萝卜素在同一溶剂系统中的溶解性也不同，如顺式叶黄素溶于乙醇中，但全反式叶黄素则不溶解;顺式番茄红素异构体的极性比全反式番茄红素异构体强[6,13,15]。因此，本实验参照文献[4，12-13，16-17]，对比了正己烷-丙酮-乙醇(2∶1∶1)、正己烷-乙醇(3∶4)、正己烷-丙酮(3∶2) 、正己烷-丙酮-甲醇(1∶1∶1)、乙酸乙酯5种溶剂系统对番茄中类胡萝卜素的提取效率。以类胡萝卜素的提取量为指标来衡量各个溶剂系统的提取效率。

图1　不同溶剂对番茄中叶黄素、β-胡萝卜素、番茄红素的提取效率Fig.1　Extraction efficiencies of different solvent systems on lutein，β-carotene and lycopene from tomatoesdifferent letters in a group indicated the difference was statistically significant(P<0.05);same letters in a group indicated non-significance of difference(P>0.05)

如图1所示，正己烷-乙醇(3∶4)对番茄红素和β-胡萝卜素的提取效率最高，其次是正己烷-丙酮-甲醇(1∶1∶1)和正己烷-丙酮-乙醇(2∶1∶1)。正己烷-丙酮(3∶2)和乙酸乙酯则表现出比较相近的低提取率。然而，正己烷-丙酮(3∶2)对叶黄素的提取效率最高，其次是乙酸乙酯，其他3种溶剂的提取率相对较低。由于叶黄素等含氧类胡萝卜素的极性强于番茄红素和β-胡萝卜素等不含氧类胡萝卜素，因此正己烷-丙酮(3∶2)和乙酸乙酯这类极性较强的溶剂系统对叶黄素表现出较高的提取效率。由于番茄中番茄红素和β-胡萝卜素的含量远高于叶黄素，因此选择正己烷-乙醇(3∶4)作为最优溶剂系统。

2.2液相洗脱条件

由于C30色谱柱的固定相具有更强的疏水性，因此对番茄红素等类胡萝卜素的空间异构体截留能力更强，所以在反相液相色谱分析中常用的极性洗脱液会导致洗脱时间延长。通过在流动相中加入二氯甲烷等非极性溶剂，可以缩短保留时间。Lee等[18]应用正丁醇-乙腈-二氯甲烷(30∶70∶10)洗脱系统将全反式番茄红素的保留时间从250 min缩短至33 min。甲基叔丁基醚(MTBE)是一种比二氯甲烷具有更强疏水性的洗脱液，Huang等[13]使用MTBE-甲醇洗脱液系统使得番茄红素、β-胡萝卜素和叶黄素得到了良好的分离，但有些番茄红素异构体未被完全分离。

本实验选用MTBE作为流动相A，不同比例的甲醇-乙腈(100∶0，50∶50，25∶75，0∶100)作为流动相B，来筛选对类胡萝卜素顺式异构体分离效果最好的洗脱系统。结果显示，不同比例的甲醇-乙腈对类胡萝卜素异构体的分离效果有显著差异。100%甲醇为流动相时，12～25 min峰的分离效果很差;乙腈比例为50%时，洗脱时间有所缩短，但分离效果并未明显改善;提高乙腈的比例至75%和100%时，分离效果明显提高，且洗脱时间从32 min缩短至20 min。尽管甲醇-乙腈(25∶75)和乙腈(100%)的分离效果类似，但前者存在轻微的基线漂移，可能会导致定量准确性下降。因此，流动相B选用乙腈(100%)。另外，由于TEA能加强类胡萝卜素的响应值，减少其在色谱柱中的降解[12]，因此，流动相A和B中均加入0.05%的TEA。

综上所述，用于同时分离和测定类胡萝卜素顺反异构体的HPLC分析条件如“1.2.2”所示。

2.3HPLC方法学验证

将“1.2.3”中配制的不同浓度梯度的全反式叶黄素标准溶液、全反式β-胡萝卜素标准溶液和全反式番茄红素标准溶液进行HPLC分析，以浓度(X，μg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，得到回归方程如表1所示。结果表明，叶黄素、β-胡萝卜素、番茄红素的浓度分别在0.1～5.0，0.1～20，0.1～100 μg/mL范围内线性关系良好，三者的检出限(LOD，S/N=3，n=11)分别为0.13，0.12，0.56 μg/g，定量下限(LOQ，S/N=10，n=11)分别为0.43，0.41，1.88 μg/g。类胡萝卜素的反式与顺式异构体消光系数几乎相同[4]，因此全反式异构体的标准曲线也适用于顺式异构体。

表1　HPLC方法对番茄中类胡萝卜素的线性关系、检出限、定量下限及精密度

a.low concentration of all-trans-lycopene(0.1-3.2 μg/mL,6-point);b.high concentration of all-trans-lycopene(10-100 μg/mL,6-point)

分别对3 μg/mL叶黄素，10 μg/mLβ-胡萝卜素，1.5 μg/mL和50 μg/mL番茄红素进行日内(Intra-)与日间(Inter-)精密度测定。日内精密度采用同一浓度的样品在一天内连续进样6次，以6次峰面积的值计算相对标准偏差(RSD);日间精密度采用同一浓度的样品每天进样6次，连续3 d，以18次峰面积的值计算RSD。 3种类胡萝卜素的日内RSD分别为5.3%，4.2%，1.2%，3.7%，日间RSD分别为7.5%，6.5%，1.9%，5.2%，说明本方法有较高的精密度。

分别将不同剂量的番茄红素标准品(0.400，0.800 mg)、β-胡萝卜素标准品(0.032，0.064 mg)、叶黄素标准品(0.004，0.008 mg)加入番茄样品中，所有样品均采用相同的提取方法，之后用HPLC进行加标回收率检验。如表2所示，番茄红素的回收率为(102.6±4.2)%～(107.1±3.4)%，β-胡萝卜素为(92.3±4.3)%～(94.1±6.3)%，叶黄素为(88.9±6.1)%～(91.7±3.6)%，表明该方法具有较高的准确度。

表2　HPLC方法对番茄红素、β-胡萝卜素、叶黄素的加标回收率

2.4番茄中类胡萝卜素异构体的分析

番茄中类胡萝卜素及其异构体的液相色谱图如图2所示，共检测出11种类胡萝卜素，色谱数据见表3。所有色谱峰的k值(容量因子)均在10以内，表明流动相的溶剂强度在合适范围内[6]。所有色谱峰的α值(分离因子)大于1，说明流动相对样品中目标物质具有良好的选择性[5]。

图2　番茄中类胡萝卜素的液相色谱图Fig.2　HPLC chromatogram of carotenoids of tomatoesthe peak number denoted is the same as that in Table 3

PeakNo.CompoundRetentiontime(min)Kαλ(nm)in-lineaλ(nm)reportedQ-ratiofoundQ-ratioreported1All-trans-lutein(全反式叶黄素)9.591.311.31(1,2)g420,443,475444,470213,15-cis-β-Carotene(13,15-顺式-β-胡萝卜素)11.321.721.31(1,2)342,436,465437,4580.140.16b313-cis-β-Carotene(13-顺式-β-胡萝卜素)11.471.761.02(2,3)337,454,4474770.300.32b,c4All-trans-β-carotene(全反式β-胡萝卜素)11.961.881.06(3,4)453,479453,47759-cis-β-Carotene(9-顺式-β-胡萝卜素)12.391.981.05(4,5)346,447,475344,444,4700.090.10b,d613-cis-Lycopene(13-顺式-番茄红素)13.252.191.10(5,6)359,472360,437,463,4940.550.55e715-cis-Lycopene(15-顺式-番茄红素)13.712.301.05(6,7)359,441,466,496360,437,466,4940.600.61d,f85,5'-cis-Lycopene(5,5'-顺式-番茄红素)14.332.451.06(7,8)337,444,470362,444,470,5020.060.06e95-cis-Lycopene(5-顺式-番茄红素)15.482.731.11(8,9)360,445,472,504362,444,470,5020.060.06e109-cis-Lycopene(9-顺式-番茄红素)16.212.901.06(9,10)359,442,467,499360,438,464,4940.130.12e11All-trans-lycopene(全反式番茄红素)20.133.851.32(10,11)361,447,472,504362,444,470,5020.060.06e

a.a gradient mobile phase of methyl tert-butyl ether containing 0.05% of TEA and acetonitrile containing 0.05% of TEA;b.a mobile phase of methanol-methylene chloride(99∶1);c.a gradient mobile phase of methanol-isopropanol(99∶1) and methylene chloride;d.a gradient mobile phase of 1-butanol-acetonitrile(30∶70) and methylene chloride;e.a mobile phase ofn-hexane-n-ethyl diisopropylamine(99.85∶0.15);f.a gradient mobile phase of methanol∶water methyl tert-butyl ether∶water(83∶15∶2) and methanol∶methyl tert-butyl ether∶water(8∶90∶2);g.numbers in parentheses represented values between two peaks

通过与各自标准品的UV吸收光谱和保留时间进行对比，其中峰1,4,11被分别鉴定为全反式叶黄素、全反式β-胡萝卜素和全反式番茄红素。顺式异构体的判定遵循以下原则[4-5,14]：番茄红素的单顺式异构体与其全反式结构相比会发生约4 nm的蓝移效应，双键顺式异构体比单键顺式异构体的蓝移效应更强;居于链中间位置的顺式异构体，如13或15-顺式-β-胡萝卜素在340 nm左右会有强吸收峰;通过Q值鉴定异构体，不同的异构体具有特定的Q值。峰2与全反式-β-胡萝卜素相比，发生了一个18 nm的强烈蓝移，其Q值计算为0.14，与Chen等[14]鉴定的13,15-顺式-β-胡萝卜素Q值一致，因此初步判定峰2为13,15-顺式-β-胡萝卜素。峰3，5分别鉴定为13-顺式-β-胡萝卜素和9-顺式-β-胡萝卜素，因为主吸收峰的蓝移和Q值(0.30,0.09)与前人鉴定的这两种顺式异构体的Q值(0.32,0.10)一致[4-5,14]。同样，峰6，7，8，10与全反式番茄红素标准品相比，其主吸收峰均发生了一定程度的蓝移(2，6，2，5 nm)，Q值(0.55，0.6，0.06，0.13)也符合文献报道的13-顺式-番茄红素、15-顺式-番茄红素、5,5′-顺式-番茄红素和9-顺式-番茄红素的Q值(0.55，0.61，0.06，0.12)[4]，因此被分别判定为以上物质。峰9的吸收光谱和全反式番茄红素相似，因此其Q值与全反式番茄红素Q值均为0.06左右，但从峰9较低的含量及其液相保留时间推测该峰并不是全反式番茄红素，参照Lee等[6]与Chen等[14]对该峰的判定，初步判定该峰为5-顺式-番茄红素。

3结论

本文建立了一种可同时快速分析番茄中多种类胡萝卜素及其异构体的HPLC方法，以正己烷-乙醇(3∶4)作为最佳提取溶剂，甲基叔丁基醚+0.05%三乙胺为流动相A，乙腈+0.05%三乙胺为流动相B，C30柱进行分离。该方法具有较高的灵敏度和准确性，可将洗脱时间缩短至30 min，能够较好分离番茄中的11种类胡萝卜素(3种全反式异构体和8种顺式异构体)，从而为更加深入研究番茄中的类胡萝卜素及其异构体提供了一种可靠的基础方法。

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Analysis of Carotenoids and Their Isomers in Tomatoes by HPLC Method

ZHANG Ying1，CHEN Hua-han1，LI Chun-mei1,2*

(1.College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan430070，China;2.Key Laboratory of Environment Correlative Food Science，Huazhong Agricultural University，Ministry of Education，Wuhan430070，China)

Abstract：An analytical method was developed for the determination of carotenoids and their isomers in tomatoes by an improved high performance liquid chromatography(HPLC) method.Hexane-ethanol(3∶4) was chosen as the best solvent system for extracting carotenoids from tomatoes by stirring 30 min using a magnetic stirring apparatus.11 kinds of carotenoids including all-trans-forms of lycopene，β-carotene，lutein and 8 kinds of cis-isomers were completely separated in 30 min on a Carotenoid C30column(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm particle) using methyl tert-butyl ether(MTBE) containing 0.05% triethylamine(TEA) as mobile phase A and acetonitrile containing 0.05% TEA as mobile phase B by gradient elution.The flow rate was set at 1.0 mL/min，and the detection wavelength was 475 nm.For lutein，β-carotene and lycopene，the calibration curves were linear in the ranges of 0.1-5.0，0.1-20 and 0.1-100 μg/mL,respectively，with correlation coefficients more than 0.99.The limits of detection(LOD) were 0.13，0.12,0.56 μg/g，respectively，the limits of quantitation(LOQ) were 0.43，0.41,1.88 μg/g，respectively.The intra-day relative standard deviation(RSD) were in the range of 1.2%-5.3%，and the inter-day RSDs were 1.9%-7.5%.The recoveries were in the range of (88.9±6.1)%-(91.7±3.6)%，(92.3±4.3)%-(94.1±6.3)% and (102.6±4.2)%-(107.1±3.4)%，respectively.This HPLC method could be used to separate 11 types of carotenoids in tomatoes completely with a short time and high sensitivity.Key words：high performance liquid chromatography(HPLC);carotenoids;cis-isomers;tomato

收稿日期：2015-09-02;修回日期：2015-10-12

基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金资助(2013PY094)

*通讯作者：李春美，博士，教授，研究方向：天然产物化学，Tel:027-87282111，E-mail：lichmyl@mail.hzau.edu.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.04.013

中图分类号：O657.72;O629.4

文献标识码:A

文章编号：1004-4957(2016)04-0448-06