超高效液相色谱-串联质谱法测定斑马鱼性腺中13种类固醇激素

马有宁，桂文君，程敬丽，朱国念

(浙江大学　农药与环境毒理研究所，浙江　杭州　310058)

超高效液相色谱-串联质谱法测定斑马鱼性腺中13种类固醇激素

马有宁，桂文君，程敬丽，朱国念*

(浙江大学农药与环境毒理研究所，浙江杭州310058)

摘要：建立了超高效液相色谱-串联质谱测定雌性斑马鱼性腺中13种类固醇激素的分析方法。雌鱼性腺分别经预冷的乙腈、乙酸乙酯浸提后，氨基(NH2)、亲水-亲脂平衡介质(HLB)固相萃取柱富集净化，ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱进行梯度分离。采用多反应监测模式扫描，基质匹配外标法定量。研究了不同提取溶剂对13种类固醇激素的提取效果，考察了固相萃取柱的净化效果，并对斑马鱼性腺进行类固醇激素加标回收率实验，结果表明，13种分析物的平均加标回收率为74.8%～127.0%，相对标准偏差为3.9%～15.8%，方法检出限为0.006～0.300 μg/kg。该方法简便、准确、灵敏，可应用于斑马鱼性腺类固醇激素生理水平的检测。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱；NH2；HLB柱；斑马鱼性腺；类固醇激素

环境内分泌干扰物(Endocrine disrupting chemicals,EDCs)是指环境中存在的能够干扰生物体内源激素的合成、释放、转运、结合、作用或清除，从而影响机体的内环境稳定、生殖、发育及行为的外源性物质[1-2]。性激素在鱼类生殖系统发育中起着决定性的作用[3]。而许多环境内分泌干扰物如双酚A(Bisphenol A,BSA)[4]、乙烯雌酚(Diethylstilbestrol,DES)[5-6]、17α-炔雌醇(EE2)[7]等可以通过性激素受体介导或非受体介导途径发挥内分泌干扰效应，影响性激素的合成、代谢而改变生物体内性激素的利用度。其中斑马鱼作为生物学研究的一种新型模式生物已广泛应用于环境毒理学的研究[8]。

在斑马鱼体内，类固醇激素的合成主要发生在外周组织，其中具有生物活性的性腺固醇类激素包括孕激素(Progestins)、皮质激素(Corticosteroids)、雌激素(Estrogens)和雄激素(Androgens)等[9]。放射免疫分析法(RIA)主要应用于测定斑马鱼血浆类固醇激素(主要是T、E2、11-KT)[10-11]。由于微量浓度的性激素即会产生明显的生理学作用，因此需要高灵敏度的仪器分析检测[12]。虽然传统的RIA灵敏度高，但由于存在方法重复性差、交叉反应率高、动态范围窄、无法同时检测多种激素物质等缺陷而使其应用受限[13-15]。随着固相萃取柱的广泛使用，使用气相色谱(GC-MS)和超高效液相色谱-串联质谱(UPLC -MS/MS)测定类固醇激素得到了革命性的应用[16]。虽然气相色谱-串联质谱技术可以提高灵敏度，但无法避免繁琐的衍生化操作，增加了提取过程的复杂性[17-18]。UPLC-MS/MS可避免气相色谱法复杂的前处理步骤，且可通过MRM提高方法的选择性和检出限[19]。目前应用GC-MS[20]和UPLC-MS/MS测定动物组织[21-24]、液体样品(尿液[25-26]、血浆[12，27])中的类固醇激素已有报道，但对斑马鱼性腺中类固醇激素的检测鲜有报道[28]。本文采用不同模式的固相萃取柱(HLB和NH2柱)分别净化，结合UPLC-MS/MS分析斑马鱼性腺中的13种内源类固醇激素，以期提高方法灵敏度，减少基质效应。该方法灵敏度高，能够满足斑马鱼体内13种类固醇激素生理水平的测定要求。

1实验部分

1.1仪器与设备

超高效液相色谱仪Acquity Ultra Performance LC(Waters,Milford,MA,USA)，Applied Biosystems Triple Quad 5500质谱仪器(ESI-MS/MS;Foster,CA,USA)，FRESCO 21台式离心机(美国 Thermo Fisher 公司)。

1.2试剂与材料

乙腈、甲醇(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸(色谱纯)、乙酸乙酯(分析纯)购自美国Sigma-Aldrich公司；Waters OASIS HLB(200 mg×6 mL，美国Waters公司)；Bond Elut-NH2(500 mg×6 mL，美国Agilent Technologies公司)；实验用水为Milli-Q超纯水。

13种类固醇激素标准品：孕激素：孕酮、羟基孕烯醇酮、羟孕酮；皮质激素：脱氧皮质酮、脱氧皮质醇、氢化可的松、皮质酮；雄激素：去氢表雄酮、雄烯二酮、睾丸酮；雌激素：雌酮、雌二醇、雌三醇均购自美国Sigma-Aldrich公司，纯度均大于95%。

1.3标准溶液的配制

标准储备液：称取10 mg(精确至0.01 mg)标准品，用甲醇定容至10 mL，配成质量浓度为1 000 mg/L的标准储备液，于-20 ℃避光保存。使用时用甲醇逐级稀释成所需浓度的工作液。

混合标准工作液：分别吸取适量的类固醇标准储备液，用甲醇配成1 mg/L的混合标准储备液，于-20 ℃避光保存。

1.4样品前处理

1.4.1样品制备使用过量的间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(300 mg/L)长时间麻醉斑马鱼至停止鳃盖运动，收集雌鱼性腺组织样品保存于-80 ℃，待测。根据中国国家食品和药物控制研究所实验动物保护和应用指南实施实验。

1.4.2提取称取0.3 g样品(5尾鱼)于2 mL离心管中，加入1 mL预冷(4 ℃)的乙腈。样品匀浆后超声提取30 min，于4 ℃ 12 000 r/min 离心10 min，收集上清液。残渣中加入1 mL预冷(4 ℃)的乙酸乙酯，匀浆后超声提取30 min，于4 ℃ 12 000 r/min 离心10 min，将两次提取液合并，混匀，上清液于40 ℃氮吹近干，加入1 mL甲醇，混匀，获得样品粗提取液待净化。

1.4.3净化HLB固相萃取柱用5 mL甲醇活化，再用5 mL超纯水平衡。取0.6 mL样品粗提取液，加入2.4 mL超纯水，混匀，过HLB固相萃取柱。用3 mL 30% 的甲醇水溶液洗涤萃取柱。用3 mL 纯甲醇洗脱，洗脱液收集于10 mL试管中，于40 ℃氮吹近干，甲醇定容至300 μL，混匀，过0.22 μm滤膜(聚四氟乙烯，PTFE，美国Millipore公司)，待测定ESI(-)目标化合物。

NH2固相萃取柱用5 mL甲醇活化，再用5 mL甲醇-乙酸乙酯(20∶80)溶液平衡。取0.4 mL样品粗提取液，加入1.6 mL乙酸乙酯，混匀，过NH2固相萃取柱，再用2 mL甲醇-乙酸乙酯(20∶80)洗脱，共4 mL均收集于10 mL试管中，于40 ℃氮吹近干，甲醇定容至300 μL，混匀，过0.22 μm滤膜，待测定ESI(+)目标化合物。

1.5UPLC-MS/MS

分析柱：ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm;美国Waters公司)。流动相：A为0.1% 甲酸水溶液(ESI+)或0.1%氨水(ESI-)，B为乙腈溶液。梯度洗脱：ESI(+)，0～8 min，5%～95% B，8～9 min，95% B，9～9.1 min，95%～5% B；ESI(-)，0～7 min，10%～85% B，7～9 min，85%～95% B，9～9.1 min，95%～10% B。流速：300 μL/min，柱温：40 ℃；进样量：5 μL。

优化的质谱参数如下：正离子模式，气帘气(CUR) 20 psi，碰撞气(CAD) 8 psi，喷雾电压(IS)5 500 V，离子化温度(TEM) 550 ℃，雾化气(GS1) 30 psi，涡轮增压气(GS2) 30 psi；此模式下分析的类固醇激素有8种：孕酮、脱氧皮质酮、脱氧皮质醇、氢化可的松、皮质酮、去氢表雄酮、雄烯二酮、睾丸酮。

负离子模式，气帘气(CUR) 10 psi，碰撞气(CAD) 8 psi，喷雾电压(IS) -4 500 V，离子化温度(TEM) 550 ℃，雾化气(GS1) 40 psi，涡轮增压气(GS2) 40 psi。此模式下分析的类固醇激素有5种：羟基孕烯醇酮、羟孕酮、雌酮、雌二醇、雌三醇。采用动态多反应监测(Dynamic SRM)模式扫描，其他参数见表1。

表1　13种类固醇激素的母离子、子离子、去簇电压及碰撞能量

图1　不同提取溶剂对13种类固醇激素回收率的影响(5 μg/kg)Fig.1　Effects of different extraction solvents on recoveries of 13 steroids(5 μg/kg)

2结果与讨论

2.1提取溶剂的优化

为了获得较好的回收率和除杂效果，实验考察了甲醇[29]、乙腈[30]、乙酸乙酯[31]、乙腈-乙酸乙酯[32]5种溶剂的提取效果，选用雌鱼性腺，预先添加13种混合标准溶液，使其含量为5 μg/kg，各组提取液均采用基质匹配校准法测定。结果表明(图1)，甲醇作为提取溶剂时，除F外，类固醇激素的回收率均不足70%，且提取液中杂质较多，背景噪音大；而分别单独使用乙腈、乙酸乙酯时，孕激素、皮质激素及雄激素的提取回收率可满足要求，但对雌激素的提取回收率较小，分别小于40%和65%，其中乙腈提取物更为纯净，背景噪声小。而结合两种提取溶剂分次提取，可明显增加雌激素的回收率，回收率均达到74%以上。因此选择乙腈结合乙酸乙酯作为提取溶剂进行分次提取。

2.2净化方法的优化

本研究对固相萃取柱HLB的上样溶剂组成和洗脱条件进行优化。固相萃取柱依次用5 mL甲醇、5 mL 水活化，将混合标准溶液溶于初始上样液10%甲醇-水溶液中，则上样液中类固醇的质量浓度为5 μg/L，并依次用20%，40%，60%，80%，100%甲醇-水溶液淋洗，设定淋洗体积为3 mL，收集淋洗液。结果表明，当淋洗液中甲醇含量超过40%时，可检出10.1%的E和16.8%的F，而当甲醇含量达80%时，所有目标化合物的回收率均在95%以上。为此，方法选择3 mL 20%甲醇水溶液作为上柱前的溶剂，3 mL 30%甲醇水溶液作为淋洗液，3 mL 100%甲醇作为洗脱溶剂。

本研究采用NH2[21]、HLB固相萃取柱净化，以基质效应评价方法的纯化效果。选用雌鱼性腺，按照“1.4.2”方法处理得到样品粗提液，将粗提液分成两份，其中一份经HLB柱净化，另一份经NH2柱净化得到样品纯化液。为了考察基质效应，相同量的激素(5 μg/kg) 分别配在性腺组织纯化液和甲醇中，扣除提取液中本底后，比较两者峰面积，观察是否有离子增强或抑制效应。结果显示，样品粗提液经HLB净化后，雄激素、P4、皮质激素均表现出明显的基质增强效应，回收率高达412%(F)；而样品粗提液经NH2柱净化后，雌激素、17P4和17P5表现出明显的基质抑制效应。因此，为了获取更好的纯化效果并降低目标化合物的基质效应，本文将样品粗提液分成2份，分别采用HLB固相萃取柱净化雄激素、P4和皮质激素，而NH2固相萃取柱用于净化雌激素、17P4和17P5。

2.3UPLC-MS/MS条件优化

在UPLC-MS/MS分析中，流动相主要对分析物的离子化效率产生影响，从而引起灵敏度的变化。实验结果表明，正离子模式下，以0.1%甲酸水溶液为流动相可以获得较高的灵敏度，而负离子模式下，以0.1%氨水为流动相可以获得最佳的灵敏度和色谱分离度。图2为13种分析物在最佳色谱条件下的提取离子流图(TIC)。

2.4线性关系、检出限、回收率与精密度

采用基质匹配外标法定量。将13种类固醇激素混合标准工作液用空白组织液依次稀释成0.1～50 μg/L的系列浓度，在最佳实验条件下进行测定，用色谱峰面积和浓度绘制标准曲线。结果表明，13种分析物在此浓度范围内的线性关系良好，相关系数(r)不低于0.998 3。以各目标物色谱峰的3倍信噪比(S/N=3)计算得13种目标化合物的检出限(LOD)为0.006～0.300 μg/kg(表2)。

表2　13种内源类固醇激素的线性关系、检出限、平均回收率及相对标准偏差(n=3)

(续表2)

AnalyteLinearrange(μg/L)Linearequation*rLOD(μg/kg)Added(μg/kg)Meanrecovery(%)RSD(%)S0.1～50Y=13261X-1780.80.99980.0240.25,1.25,6.25104.0,115.2,127.013.2,5.2,11.9F0.1～50Y=5149X-165.50.99860.0350.25,1.25,6.2574.8,88.7,86.910.3,11.9,6.6E0.1～50Y=8508X+80.60.99960.0180.25,1.25,6.2580.3,91.2,89.610.2,6.8,7.8DHEA1.0～50Y=12320X-1617.41.00000.3002.5,6.25,15.62586.3,90.1,92.45.5,3.9,7.2AE0.1～50Y=44886X-1123.90.99940.0200.25,1.25,6.2583.8,89.8,100.610.7,6.1,4.9T0.1～50Y=55266X-6538.60.99830.0120.25,1.25,6.2598.2,95.4,106.010.4,8.4,3.9E10.1～50Y=53006X-7121.40.99990.0060.2,1.0,5.083.0,79.4,76.612.2,11.1,8.9E20.1～50Y=30708X+631.40.99990.0080.2,1.0,5.083.6,88.9,89.411.4,12.2,9.1E30.1～50Y=6924X+157.70.99980.0500.2,1.0,5.088.9,91.3,86.110.3,11.4,7.3

*Y：peak area;X:mass concentration(μg/L)

图3　斑马鱼性腺中类固醇激素的含量Fig.3　Contents of steroid hormones in ovaries of zebrafish

对斑马鱼性腺进行低、中、高3个浓度水平的加标回收实验，计算平均回收率和相对标准偏差(RSD，n=3)。结果表明，13种化合物的平均加标回收率为74.8%～127.0%，RSD为3.9%～15.8%。

2.5实际样品的检测

选用野生型斑马鱼，对雌性斑马鱼进行三唑锡农药(Azocyclotin,AZO,0.45 μg/L)暴露21 d，按优化的分析条件测定性腺类固醇激素的变化。结果表明，除E3、S和DOC外，其余10种类固醇激素均有检出(见图3)。由图3可以看出，雌性斑马鱼暴露于三唑锡21 d后，性腺中雄性激素明显增加(65.3%～199%)，而雌性激素、孕激素、皮质激素明显降低(16.9%～78.8%)。

3结论

本文建立了斑马鱼雌鱼性腺中13种内源类固醇激素的超高效液相色谱-串联质谱检测方法，分别对仪器条件、样品提取溶剂进行了优化，采用不同的固相萃取柱分别净化以提高分析方法的灵敏度和准确性。本方法准确、可靠，具有较高的实用性，可为环境污染物对斑马鱼类固醇激素干扰研究提供有力的技术支撑。

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Analysis of Steroid Hormones in Ovaries of Zebrafish(Danio rerio) by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

MA You-ning,GUI Wen-jun,CHENG Jing-li,ZHU Guo-nian*

(Institute of Pesticide and Environmental Toxicology,Zhejiang University,Hangzhou310058,China)

Abstract：An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(UPLC-MS/MS) method was developed for the simultaneous determination of steroid hormones in ovaries of zebrafish.Homogenized ovary samples were purified with NH2 and HLB solid phase extraction column after extracted with acetonitrile and ethyl acetate at 4 ℃.The samples were transported and eluted on an analytical column ACQUITY UPLC®BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm).All the analytes were detected in selected reaction monitoring(SRM) mode and quantified by the external matrix-matched standard method.The extraction efficiencies of different extraction solvents and cleanup effects of solid phase extraction columns for each analyte were further investigated.The average recoveries of 13 steroid hormones in spiked zebrafish ovary samples ranged from 74.8% to 127.0% with relative standard deviations(RSD) of 3.9%-15.8%.The results showed that the limits of detection(LODs,S/N=3) were in the range of 0.006-0.300 μg/kg.The method was sensitive and reliable,and could meet the requirements for the quantification of steroid hormones in zebrafish at physiological level.Key words：ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);NH2;HLB;zebrafish;steroid hormones

收稿日期：2015-10-08；修回日期：2016-02-16

基金项目：浙江省科技厅公益技术应用研究项目(2014C37050)

*通讯作者：朱国念，教授，研究方向:农药环境毒理学与农药污染治理，Tel：0571-86971220，E-mail:zhugn@zju.edu.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.04.015

中图分类号：O657.63；Q548.2

文献标识码:A

文章编号：1004-4957(2016)04-0460-06