固相萃取/超高效液相色谱-串联质谱测定水果中5种植物生长调节剂残留量

仲伶俐，胡　莉，郭灵安，雷绍荣，毛建霏，李　曦，欧阳华学

(四川省农业科学院分析测试中心，四川　成都　610066)

固相萃取/超高效液相色谱-串联质谱测定水果中5种植物生长调节剂残留量

仲伶俐，胡莉，郭灵安*，雷绍荣，毛建霏，李曦，欧阳华学

(四川省农业科学院分析测试中心，四川成都610066)

摘要：建立了固相萃取/超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)同时测定水果中6-苄基腺嘌呤(6-BA)、噻苯隆、氯吡脲、多效唑和烯效唑5种植物生长调节剂残留量的分析方法。水果样品经乙腈提取，NH2固相萃取小柱进行富集、净化，以二氯甲烷-甲醇(92∶8)为洗脱溶液，浓缩定容后，用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)色谱柱分离，流速0.3 mL/min，以水-甲醇为流动相梯度洗脱，于UPLC-MS/MS仪多反应监测(MRM)模式测定，基质匹配标准溶液外标法定量。结果表明，5种植物生长调节剂在5～500 ng/mL浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数(r2)为0.996 1～0.999 6。在0.004，0.02，0.1 mg/kg加标水平下，方法的回收率为75.6%～110.5%，相对标准偏差(RSD)为1.2%～12.8%，方法检出限(LOD,S/N≥3)为0.001～0.002 mg/kg，定量下限(LOQ,S/N≥10)为0.003～0.006 mg/kg。该方法操作简便、灵敏度高、准确可靠，适用于水果中5种植物生长调节剂残留量的同时测定。

关键词：固相萃取;超高效液相色谱-串联质谱;水果;植物生长调节剂

植物生长调节剂(Plant growth regulator，PGR) 又称外源植物激素，是人工合成的与内源激素有相似生理作用的生长物质。6-苄基腺嘌呤(6-BA)、噻苯隆、氯吡脲、多效唑和烯效唑均为植物生长调节剂，对果树休眠、生根、生长、花芽分化、着果、果实发育、成熟期、果实品质及抗逆性方面有调节作用，已被广泛应用于果树生长过程[1-4]。日本对水果中植物生长调节剂残留限量的规定最为详细，其对多种水果中6-苄基腺嘌呤、氯吡脲和多效唑均有限量要求，分别为0.02～0.1 mg/kg,0.01～0.1 mg/kg和0.01～1 mg/kg;烯效唑在草莓和鳄梨中的最大残留限量为0.1，0.5 mg/kg[2,5]。而我国规定噻苯隆在葡萄和甜瓜中的最大残留限量为0.05 mg/kg;氯吡脲在橙、枇杷、猕猴桃、葡萄中的最大残留限量为0.05 mg/kg;多效唑在苹果、荔枝中的最大残留限量为0.5 mg/kg;6-苄基腺嘌呤和烯效唑尚无限量要求[6]。

目前植物生长调节剂残留的测定方法有衍生化气相色谱法[7]、高效液相色谱法[8-10]和液相色谱-质谱联用法[11-16]。由于植物生长调节剂的化学性质差异较大，残留量低，液相色谱-质谱联用仪以其高选择性和高灵敏度在多种植物生长调节剂残留同时测定中颇具优势[17]，样品前处理通常采用QuEChERS法[11-12]或固相萃取(SPE)法[13-16]，虽然QuEChERS法简单、快速，但SPE法在除杂质能力和稳定性上更加优越。本文采用氨基固相萃取小柱净化样品，UPLC-MS/MS同时测定水果中6-苄基腺嘌呤、噻苯隆、氯吡脲、多效唑和烯效唑残留量，前处理净化时只使用1种淋洗液，相比于文献中使用多种淋洗液或洗脱液的SPE法，更加简便、快捷，操作时间短，净化效果好，准确度和灵敏度能够满足国内外限量标准的要求。

1实验部分

1.1仪器、试剂与材料

Waters Xevo TQ超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Waters公司);IKA T18高速匀质机(德国IKA公司)，R-210旋转蒸发仪(德国Buchi公司)，LD5-2A高速离心机(北京京立离心机有限公司)，WH-3微型涡旋混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)，DT-1002A电子天平(常熟市金羊砝码仪器有限公司)，0.22 μm微孔滤膜(天津津腾实验设备有限公司)。

5种植物生长调节剂标准品：6-苄基腺嘌呤、噻苯隆、氯吡脲、多效唑、烯效唑(纯度≥98%，德国Dr.Ehrenstorfer公司);甲醇、乙腈、二氯甲烷(色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司);氯化钠(分析纯，西陇化工有限公司);NH2固相萃取小柱(500 mg/6 mL，美国Thermo公司);Florisil固相萃取小柱(500 mg/6 mL，美国Agilent公司);实验用水均由优普超纯水系统制备。

1.2试样制备

取不少于1 000 g样品，取可食部分，用干净纱布轻轻擦去样品表面的附着物，将样品缩分至250 g，粉碎后密封，制成试样备用，剩余试样于-18 ℃保存。

1.3样品前处理

称取10 g粉碎好的试样于100 mL具塞离心管中，加入20.0 mL乙腈，高速匀浆2 min，加入10 g氯化钠，盖上盖子，剧烈振摇1 min，静置30 min，4 000 r/min离心5 min，使乙腈和水相分层。移取10.0 mL上层乙腈溶液至100 mL梨形瓶中，40 ℃水浴中旋转浓缩至干，加入4 mL二氯甲烷-甲醇(92∶8)淋洗液溶解残渣，并将该样品溶液移入用淋洗液活化好的NH2固相萃取小柱中，收集流出液于50 mL鸡心瓶中，用3.0 mL淋洗液洗涤梨形瓶2次，移入NH2固相萃取小柱，合并洗脱液，在30 ℃水浴中旋转浓缩至干，用2.0 mL甲醇-水(1∶1)溶解残渣，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，供高效液相色谱测定。

1.4色谱与质谱条件

色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm);流速：0.3 mL/min;柱温40 ℃;进样量5 μL;流动相：A为水，B为甲醇;洗脱程序：0～1.0 min，60% A;1.0～3.0 min，60%～30% A;3.0～4.0 min，30%～10% A;4.0～4.2 min，10%～60% A;4.2～5.2 min，60%A。

电喷雾离子源(ESI)，扫描方式为多反应监测(MRM)，毛细管电压：3.0 kV，离子源温度：150 ℃，脱溶剂气(N2)温度：350 ℃，脱溶剂气流速：700 L/h，锥孔气流速：50 L/h，碰撞气(Ar)流速：2.5 L/h。5种植物生长调节剂的定性、 定量离子对等质谱分析参数见表1。

表1　5种植物生长调节剂的保留时间及质谱分析参数

*quantitative ion

2结果与讨论

2.1色谱条件的选择

5种植物生长调节剂在C18色谱柱上均有很好的保留，实验选择1.7 μm C18色谱柱，采用梯度洗脱，提高了单位样品的分析效率并减少了强保留杂质在色谱柱的累积。考察了水-甲醇、0.1%甲酸-甲醇、1 mmol/L醋酸铵-甲醇、0.1%甲酸-10 mmol/L甲酸铵4种流动相的分离效果，最终确定以水-甲醇为流动相，在“1.4”梯度洗脱条件下，5种植物生长调节剂均能获得较好的色谱峰形和稳定的信号强度。

2.2质谱条件的确定

5种植物生长调节剂均易离子化，适合采用ESI源。实验首先采用直接进样方式，分别在ESI+/ESI-模式下找到母离子，然后通过调节碰撞能量选择2个相对丰度较高的特征离子作为定量离子和定性离子，分析时再结合化合物的保留时间等信息，进行定性、定量分析。5种植物生长调节剂的离子对及其对应的质谱参数见表1。

2.3净化方法的选择

水果样品经乙腈提取，盐析分层，目标物连同杂质被萃取至乙腈溶液中。本研究通过对Florisil和NH2净化柱，以及丙酮-正己烷、乙酸乙酯-乙醇、二氯甲烷-甲醇3种洗脱溶剂采用正交试验进行回收率效果测试，最终确定以NH2小柱净化，10 mL二氯甲烷-甲醇(92∶8)为洗脱液。此净化条件下，5种植物生长调节剂的特征离子在水果样品中具有很好的特异性，草莓加标样品的MRM图谱见图1。

2.4线性范围、检出限与定量下限

配制5种植物生长调节剂质量浓度分别为5，10，50，100，500 ng/mL的混合标准溶液，在优化实验条件下测定，以标准溶液的质量浓度(x，ng/mL)为横坐标，对应峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线，5种待测物的回归方程和相关系数见表2。结果显示，5种植物生长调节剂在5～500 ng/mL浓度范围内均呈良好的线性关系，相关系数(r2)为0.996 1～0.999 6。通过加标回收实验，根据信噪比(S/N)≥3和信噪比(S/N)≥10的峰响应值与样品前处理的稀释倍数，得出各化合物的方法检出限(LOD)和定量下限(LOQ)，结果见表2。5种植物生长调节剂的方法LOD为0.001～0.002 mg/kg，LOQ为0.003～0.006 mg/kg，均满足国内外限量标准的要求。

图1　草莓加标样品中5种植物生长调节剂的MRM图谱(0.004 mg/kg)

CompoundRegressionequationr2LOD(mg/kg)LOQ(mg/kg)6-BAy=898.59x+822.060.99920.0010.003Thidiazurony=505.46x+1826.250.99960.0020.006Forchlorfenurony=644.44x+455.960.99860.0010.003Paclobutrazoly=27.10x-22.050.99950.0020.006Uniconazoley=204.70x+3959.230.99610.0010.003

2.5方法的准确度与精密度

选择苹果、葡萄、李子、芒果、猕猴桃、草莓6种水果样品进行基质加标回收实验，加标浓度为0.004，0.02，0.1 mg/kg，回收率和相对标准偏差(RSD)见表3。结果显示，6-苄基腺嘌呤、噻苯隆、氯吡脲、多效唑和烯效唑在水果样品中的平均回收率为75.6%～110.5%，RSD为1.2%～12.8%，本方法下5种植物生长调节剂具有良好的准确度与精密度，符合多农残分析要求。

表3　5种植物生长调节剂在水果中的加标回收率和RSD(n=6)

2.6实际样品的测定

采用本方法对30个草莓样品进行测定，其中噻苯隆未检出，6-苄基腺嘌呤、氯吡脲、多效唑和烯效唑均有检出，其残留量分别为0.001～0.048 mg/kg，0.011～0.043 mg/kg，0.006～0.064 mg/kg和0.008 1～0.023 mg/kg。

3结论

本文建立了氨基固相萃取小柱净化，超高效液相色谱-串联质谱同时测定水果中6-苄基腺嘌呤、噻苯隆、氯吡脲、多效唑和烯效唑残留量的方法。5种植物生长调节剂的检出限为0.001～0.002 mg/kg，定量下限为0.003～0.006 mg/kg，在0.004，0.02，0.1 mg/kg加标水平下，回收率为75.6%～110.5%，相对标准偏差为1.2%～12.8%。该方法灵敏度高，准确度好，能够满足国内外限量标准要求，可用于单个或同时分析水果中5种植物生长调节剂残留量。

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Determination of 5 Plant Growth Regulator Residues in Fruits by Solid Phase Extraction and Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHONG Ling-li，HU Li，GUO Ling-an*，LEI Shao-rong，MAO Jian-fei，LI Xi，OUYANG Hua-xue

(Analysis and Testing Center of Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu610066，China)

Abstract：A method for the simultaneous determination of 5 plant growth regulator residues,including 6-benzyl adenine(6-BA)，thidiazuron，forchlorfenuron，paclobutrazol and uniconazole in fruits was developed by using ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS) with solid phase extraction(SPE).Samples were extracted with acetonitrile，then the extracts were concentrated and cleaned up on a NH2 solid phase extraction cartridge with dichloromethane-methanol(92∶8) as elution solution.Sample preparation was accomplished after concentrated and redissoved.The UPLC-MS/MS method was performed with Waters ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm) column using water-methanol as mobile phase by gradient elution，at a flow rate of 0.3 mL/min.The target compounds were determined by UPLC-MS/MS under multi reaction monitoring(MRM) mode，and then quantitatively analyzed by external standard method using the matrix-matched standard solution.The results showed that there were good linearities for 5 plant growth regulators between peak areas and concentrations in the range of 5-500 ng/mL under the optimal conditions，with correlation coefficients(r2) of 0.996 1-0.999 6.The spiked recoveries of 5 plant growth regulators in fruits at three spiked levels of 0.004，0.02，0.1 mg/kg ranged from 75.6% to 110.5% with relative standard deviations(RSDs) of 1.2%-12.8%.The limits of detection of this method(LOD) were in the range of 0.001-0.002 mg/kg，and the limits of quantitation(LOQ) were 0.003-0.006 mg/kg.The established method was simple，sensitive，accurate and reliable，and could meet the requirements of multi pesticide residues analysis in fruits.

Key words：solid phase extraction(SPE);ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);fruits;plant growth regulators

收稿日期：2015-08-27;修回日期：2015-09-23

基金项目：四川省财政基因工程专项资金项目(2012QNJJ-026);四川省农业科学院新兴学科(2013XXXK-023)

*通讯作者：郭灵安，副研究员，研究方向：食品质量与安全，Tel:028-84504149，E-mail：gla028@163.com

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.04.016

中图分类号：O657.63;TQ314.254

文献标识码:A

文章编号：1004-4957(2016)04-0466-05