北京女性两个相邻哺乳期体内p,p’-DDE排泄速度与富集速度研究

宋淑玲, 潘萌, 马晓东

(1.国家地质实验测试中心, 北京 100037;2.中国地质调查局自然资源综合调查指挥中心， 北京 100055；3.中国农业大学理学院, 北京 100193)

p,p’-DDT，即1,1,1-三氯-2-(4-氯苯)-2-(4-氯苯)乙烷,是一种有机氯农药和持久性有机污染物(POPs)。自20世纪40年代至80年代，p,p’-DDT被广泛用于防治植物虫害和一些传染性疾病[1-3]。p,p’-DDE(1,1-二氯-2-(4-氯苯)-2-(4-氯苯)乙烯)是p,p’-DDT在环境中的一级代谢物和主要降解产物[4-5]。一些研究结果表明，与p,p’-DDT相比，p,p’-DDE在环境中更稳定，能长期在各种介质中存留，已在土壤、大气、水和沉积物中被广泛检出[6-11]，可通过食物链转移并在生物体内积累[12-14]。自20世纪80年代p,p’-DDT被禁用以来，p,p’-DDE仍是人体中残留水平最高的POPs[7,15-16]。近年来一些研究表明，p,p’-DDE对婴儿和儿童表现出神经毒性[17]，对人体健康的负面影响更大，如结直肠癌、帕金森病风险和干扰孕妇同型半胱氨酸代谢[18-20]。

但是，2002年世界卫生组织(WHO)宣布，重新启用p,p’-DDT用于控制蚊子繁殖和预防疟疾、登革热和黄热病[21]。因此，p,p’-DDE将长期占据人体中可检测到POPs列表的首位。研究人员通过不同途径调查人类p,p’-DDE暴露水平，估算其积累水平。例如，一些研究调查了大气[22-23]、食物[24]和饮用水[25-26]中p,p’-DDE的残留水平，并估计了人体每日摄入量(estimated daily intake,EDI)或暴露水平。此外，母乳通常被作为理想的生物介质[27]用来监测人体p,p’-DDE残留水平或蓄积水平，估计哺乳期间的排泄速度(Ve)[28-30]，并评估哺乳期婴儿暴露风险[31]。

目前大多数研究者通过测定哺乳期母乳中p,p’-DDE浓度，估算母体中“静态”蓄积水平和婴幼儿的每日摄入量，但无法获取母体内p,p’-DDE的EDI和“动态”的富集速度(Va)以及长期变化趋势。本文连续收集了捐赠者第一次和第二次分娩后的母乳样品，并采用有机氯农药常用的气相色谱-电子捕获法(GC-ECD)[32]检测其中p,p’-DDE含量，用于：①调查当地女性体内p,p’-DDE的积累水平及变化趋势；②估计两个哺乳期内p,p’-DDE的月排泄速度及其影响因素；③估算北京女性体内p,p’-DDE的年富集速度。最终获取北京女性体内p,p’-DDE在哺乳期的排泄速度、长期富集速度和每日摄入量。

1 实验部分

1.1 样品收集

自2009年至2019年，项目组总计收集了61名志愿者的母乳样品。所有的志愿者都是北京市常住居民，均签订了知情同意书，并填写包括年龄、体重、职业和身高等信息的调查问卷。61名志愿者分娩后，每25～30天采集一个样品，连续采集六个月。在61名志愿者中，43名志愿者捐献了初次分娩后六个月哺乳期的母乳样品，另外18名志愿者捐献了第一次和第二次分娩后的母乳样品，两个哺乳期间隔6～7年。第一个哺乳期内采集的样品依次记作F1、F2、F3、F4、F5、F6，第二次分娩后采集的样品依次记作S1、S2、S3、S4、S5、S6。每个样品被采集到30mL洁净玻璃瓶中，并加具有聚四氟乙烯内衬的螺纹盖后冷冻保存在家用冰箱中，直至转移到实验室。

本研究中只采用F1、F6、S1和S6的数据，计算哺乳期内母乳中p,p’-DDE月平均排泄速度。志愿者及样品信息见表1。空白和空白加标基质为蒙牛纯牛奶，脂肪含量36.0g/L，购自超市。

表1 志愿者及样品信息Table 1 Information of donors and samples

1.2 主要试剂和材料

正己烷、丙酮、乙醇、乙醚、氨水和二氯甲烷：均为农残级，购自美国J&K Science公司、美国Honeywell和美国Fisher公司。

无水硫酸钠：分析纯，购自北京化学试剂厂。使用前在600℃马弗炉中烘6h，放置干燥器中备用。

填充柱用净化硅胶(60～100目)：购自青岛海洋化学试剂公司。使用前在500℃马弗炉中烘16h，然后在130℃下平衡16h，放置干燥器中备用。

含有p,p’-DDE的混合有机氯农药标准溶液(50.0μg/mL)和替代物(含有2,4,5,6-四氯间二甲苯和二丁基氯菌酸酯)标准溶液 (EPA8081农药混合替代物)：分别购自国家标准研究所和美国Sigma公司。

1.3 仪器及测试条件

2010GC System气相色谱-电子捕获仪(GC-ECD，日本Shimadzu公司)：配有Ai自动进样器。进样口250℃，不分流进样；进样体积1.0μL；ECD温度305℃。配有DM-5MS (50m×0.25mm×0.25μm)石英毛细管分析柱。升温条件为：初始温度120℃，以6℃/min升至220℃，继续以2℃/min升至265℃，然后以20℃/min升至280℃保持8min，最后以50℃/min升至300℃并保持10min。

1.4 样品提取与净化

用移液器准确量取10.0mL样品，并称量样品质量。将样品转移到150mL分液漏斗中，加入替代物、摇匀。向样品中依次加入约5mL氨水、10mL乙醇和15mL乙醚，每次加入不同溶剂前都充分振摇、放气、散热。最后向样品中加入25mL正己烷，充分振摇3min，静置分层后，接收上层有机相。重复以上步骤一次，合并两次有机相提取液，并用无水硫酸钠除水后，将提取液旋转浓缩至约10mL小体积，并转移到恒重后的称量瓶中，然后采用质量恒重法计算脂肪的质量和含量。用正己烷和少量的丙酮将脂肪复溶、定容至4.0mL，并保存到棕色、具盖、密封性好的玻璃瓶中。

准确分取2.0mL提取浓缩液，用硅胶填充柱净化(30cm×8mm内径,填充6g硅胶)。首先将2.0mL样品转移到柱头，先用10mL正己烷预淋洗硅胶柱，然后再依次用10mL正己烷和25mL二氯甲烷洗脱液洗脱目标物，并接收洗脱液。将洗脱液浓缩，并用环己烷定容至1.0mL，等待分析。

1.5 质量保证

在进行实际样品分析前，采用本方法分析了三个浓度水平(0.40、4.00和10.0ng/mL)、五次重复的新鲜牛奶的添加样品模拟实验，以目标物平均回收率(R)和相对标准偏差(RSD)评估分析方法的准确度和精密度。实验结果表明p,p’-DDE的检出限为6.0μg/kg lipids，p,p’-DDE和替代物二丁基氯菌酸酯回收率令人满意，平均回收率分别分布在59.8%～120.5%区间(平均值为81.3%)和40.2%～119.3%区间(平均值为68.9%)，RSD平均值分别为19%和22%。

1.6 数据统计分析

采用SPSS statistic 22.0(IBM)对数据进行统计分析。采用SPSS 软件中的双变量相关性，对母乳中p,p’-DDE浓度与母乳脂肪含量、志愿者年龄、志愿者体重指数进行相关性分析。两者是否具有相关性的判别标准为：当相关系数r>0.5和皮尔森参数p<0.05时，认为具有典型相关性。

2 结果与讨论

2.1 两个相邻哺乳期母乳中p,p’-DDE残留水平

本研究中，18名母亲连续两次分娩间隔时间为6～7年。采集18名母亲两个哺乳期的样品后，假设哺乳期中排泄速度不变，根据第一个哺乳期F1和F6样品中p,p’-DDE检测浓度，计算了哺乳期母乳中p,p’-DDE排泄速度，并估算F10(第一个哺乳期内第10个月)中p,p’-DDE的浓度。将两个哺乳期的F1、F6、F10、S1、S6中p,p’-DDE的浓度进行比较，如图1所示。

图1 志愿者连续两个哺乳期母乳中p,p’-DDE浓度比较(六个月哺乳期内)Fig.1 Residue levels of p,p’-DDE in breast milks from same donors within two consecutive lactations

图1展示了每个哺乳期内母乳中p,p’-DDE的浓度变化趋势，以及两个哺乳期间母体内p,p’-DDE浓度的蓄积或富集特征。首先，对于每个哺乳期，首个样品F1(或S1)中p,p’-DDE的残留水平均高于F6(或S6)。这表明，在哺乳期内母乳中的p,p’-DDE浓度表现出持续下降的特点，即母体内p,p’-DDE不断排出体内，体内p,p’-DDE蓄积浓度呈现出下降趋势。这一研究结果与其他研究者一致[28-30]。其次，大多数志愿者第二个哺乳期S1中p,p’-DDE的浓度普遍高于F10中的值，而一些志愿者S1中p,p’-DDE的浓度甚至高于F6中的值。S1高于F10或F6则表明在分娩间隔期内，志愿者体内的p,p’-DDE是一种浓度净增加过程，即富集和累积过程。志愿者体内p,p’-DDE浓度的增加，应该与饮食、空气、环境和接触性暴露相关[26,33-35]。

2.2 分娩次数对母乳中p,p’-DDE 残留水平的影响

一般来说，研究者认为分娩次数对母乳中p,p’-DDE的残留水平有影响。许多研究已经证明，母乳单位脂肪中p,p’-DDE浓度与分娩次数之间存在负相关性[36]，即分娩次数越多，母体内p,p’-DDE浓度越低。在目前的研究中，本工作给出了最新的研究结果。尽管对于18名志愿者，S1中p,p’-DDE浓度并不总是低于F6(第一个哺乳期内采集的最后一个样本)，但明显低于F1中p,p’-DDE的浓度(如图1所示)。同时比较了相同年龄的初次分娩和二次分娩志愿者，在哺乳期内母乳中p,p’-DDE的平均值。例如，本研究中，61名志愿者大多数初次分娩年龄在26～31岁之间，其中18名志愿者在6年或7年后，即在32～36岁第二次分娩。分析结果表明，32～36岁初次分娩志愿者F1中的p,p’-DDE均高于同年龄二次分娩母亲的S1中p,p’-DDE浓度(图2)。这表明，当母亲年龄相同时，母乳单位脂肪中p,p’-DDE浓度与分娩的次数有关。

P0、P25、P50、P75和P100分别表示最小值、最小四分位值、中值、较大四分位值和最大值。图2 初次分娩和二次分娩志愿者(32～36岁)F1和S1中p,p’-DDE浓度的箱式分布图Fig.2 Comparison of average residue levels of p,p’-DDE in F1 samples and S1 samples from mothers at age of 32-36 years old (Each box shows the median as a square, P25 and P75 as a box, and the lowest P0 and highest P100 values as whiskers)

2.3 两个哺乳期内p,p’-DDE排泄速度的比较

本研究中，计算了18名母亲第一个和第二个哺乳期p,p’-DDE的排泄速度(Ve，μg/kg lipids/month)。分析结果的平均值列于表2。当分别去除F1和F6的最大值和最小值后，第一个哺乳期排泄速度为18.9μg/kg lipids/month，第二个哺乳期排泄速度为16.8μg/kg lipids/month。因此，母乳中的p,p’-DDE在这两个哺乳期内排泄速度不同，第一个哺乳期内排泄速度大于第二个哺乳期内。

假设F1和S1中p,p’-DDE浓度代表哺乳期开始时母体中p,p’-DDE的原始蓄积水平，由于F1中p,p’-DDE浓度明显高于S1中浓度，则第一个哺乳期中p,p’-DDE的排泄速度大于第二个哺乳期的研究结果初步表明，哺乳期母乳中的排泄速度和人体内的原始蓄积水平之间可能存在相关性。本文统计分析结果也进一步证实了这一结论。在这里，SPSS被用于分析排泄速度和原始蓄积水平之间的相关性(假设它等于F1中的值)，统计分析结果为r=0.709和p=0.01，即两者有显著的正相关性。

2.4 北京女性体内p,p’-DDE的富集速度

尽管许多学者将母乳中的p,p’-DDE浓度用于研究人体中的暴露或蓄积水平，或计算哺乳期母体中p,p’-DDE的排泄速度，但鲜有学者以母乳中p,p’-DDE估算和评价人体中p,p’-DDE的富集速率。本研究通过测试间隔时间为t年的两个连续哺乳期母乳中p,p’-DDE浓度，以公式(1)估算人体中p,p’-DDE在两个哺乳期间的富集速度或蓄积速度。

(1)

式中：Va代表蓄积速度；C0代表前一个哺乳期结束时母乳中p,p’-DDE的浓度；C1是第二个哺乳期开始时母乳中p,p’-DDE的浓度；t代表两个哺乳期的间隔时间(年)，本研究中t取均值6年。

为了估算Va，将S1中的p,p’-DDE作为C1的最佳值。与此同时，研究中所有母亲都坚持母乳喂养10～12个月，故取F10中p,p’-DDE的浓度设为C0。根据表2所示的平均排泄速度来估计F10中的p,p’-DDE。考虑到样本数量有限，用表2中描述的三种方法(取所有值计算、去极值计算、取P25～P75

表2 p,p’-DDE的排泄速度和富集速度Table 2 Excretion speed and accumulating speed of p,p’-DDE

区间值计算)分别计算出三组F1、F6、F10和Ve值，然后给出Va的范围。计算结果表明，Va区间范围为10.9～14.9μg/kg lipids/year。同时我们假设，母体每日p,p’-DEE所有摄入量都蓄积或富集在体内，即忽略体内每日排出量，则可估计出EDI值的范围为29.8～40.8ng/day/kg.b.w.。

3 结论

p,p’-DDE是近年来北京市居民母乳中残留浓度最高的POPs。在本研究中，通过连续采集两次哺乳期母乳样品和检测p,p’-DDE浓度，并假设所有志愿者暴露水平和母乳分泌量无显著差异，探索性地研究不同哺乳期内母乳中p,p’-DDE排泄速度与影响因素，以及估算母体p,p’-DDE的每日摄入量和富集速度。研究结果初步表明，哺乳期内母乳中p,p’-DDE浓度总是持续下降；母乳中p,p’-DDE的排泄速度与原始蓄积水平有关，并且第一次哺乳期内排泄速度高于第二个哺乳期；北京女性体内p,p’-DDE仍然是一种净增加趋势，年富集速度范围为10.9～14.9μg/kg lipids/year，其值相当于哺乳期月排泄速度；北京女性p,p’-DDE每日摄入量(EDI)范围为29.8～40.8ng/day/kg b.w.，明显低于世界卫生组织(WHO)和联合国粮食及农业组织(FAO)对DDT的建议值，即20μg/day/kg b.w.。

随着全球人体中p,p’-DDE蓄积水平不断降低，准确监测p,p’-DDE在人体中的富集速度，预测人体中p,p’-DDE风险值的出现时间或窗口期，对人体p,p’-DDE暴露风险的评价、环境中p,p’-DDE管理和控制政策的制定与实施更具有指导意义。本研究尝试采用连续哺乳期母乳中p,p’-DDE浓度来估算母体中p,p’-DDE富集速度和每日摄入量，进一步拓展了母乳中p,p’-DDE浓度指示意义和范围。研究结果使母体中p,p’-DDE浓度不仅可以指示某个时间点或短期内母体p,p’-DDE暴露水平，同时可以指示某个时间段或长期内母体p,p’-DDE的富集速度和每日摄入量，而富集速度的正负值大小则能更直接反映人体p,p’-DDE的暴露或蓄积风险，以及发展趋势。