土壤中多环芳烃单体碳同位素分析的分离净化方法研究

谢曼曼， 刘美美， 王淑贤*， 凌媛， 孙青*

(1.国家地质实验测试中心， 北京 100037；2.中国地质科学院地质研究所， 北京 100037)

多环芳烃(PAHs)是有机碳氢化合物在温度高于400℃时，不完全燃烧以及在还原条件下经热解环化、聚合作用生成的产物，其分子结构中至少含有两个或以上苯环。森林、草原等天然火灾、火山爆发、天然石油渗漏以及生物成因前驱物的后期沉积改造都能产生PAHs，这构成了其天然本底。人为活动包括化石燃料、植物秸秆的不完全燃烧和溢油污染等也会生成PAHs。进入环境中的PAHs很难生物降解，会广泛分布于水体、沉积物、土壤、大气和生物体中，长期积累并通过食物链富集浓缩，其致癌和致突变的组分能够对人体健康产生危害[1-5]。中国不同功能区土壤中PAHs含量差异明显，即使是在一个相对较小的区域内，PAHs也可以表现出长距离迁移能力的差异，故来源复杂。而PAHs的单体碳同位素组成不易受环境因素的影响，较好地保留了母源信息，可以比较准确地指示这类污染物的来源[6-12]。

PAHs含量分析中，样品前处理一般仅要求对有机提取物进行族组分分离，之后利用荧光法[13-14]、高效液相色谱法(HPLC)[15-16]或气相色谱-质谱联用技术[17-18]进行分析。未达到基线分离的共流出峰和一些未分峰(UCM)对目标化合物含量分析的影响较小。但适用于PAHs含量分析的前处理方法，不能满足其单体碳同位素分析的要求。首先，同位素分析要求的PAHs净化效果较含量分析要高得多，共流出和UCM会造成分析结果出现巨大差异[19-20]。其次，PAHs在环境中的丰度并不高，而单体碳同位素分析的仪器检出限比同类物质含量分析至少高出一个数量级，进样量增加以及单体同位素分析中固有的质量歧视效应使得共流出和UCM的干扰更加突出。为了达到PAHs单体碳同位素分析要求，已报道的分离净化方式一般至少需要两步[6,21-28]。如采用硅胶柱色谱-薄层色谱法，分离富集3环以上的PAHs，标准品的多次分析精度(SD)在0.3‰以内，净化处理后气溶胶样品的多次分析精度(SD)在0.6‰以内[25]。Yan等[27]采用氧化铝柱-硅胶柱-薄层色谱法分离富集PAHs，单标(芘)的仪器分析精度(SD)在0.2‰以内，沉积物样品净化分离后多次进样的相对百分比在15%以内。也有研究尝试将PAHs按照环数分离富集，如Okuda等[21]利用硅胶柱、氨基柱色谱结合，将PAHs按照环数分开，PAHs标准净化分离前后同位素差值在0.8‰以内，多次分析精度(SD)在1.7‰以内，净化后的气溶胶样品的多次分析精度(SD)可以达到0.2‰～1.2‰。该方法无法分离低分子量的PAHs和UCM，中分子量的PAHs馏分(3环和部分4环)也含有明显的UCM。Mazeas等[26]通过三步分离净化(氧化铝柱色谱-硅胶柱色谱-HPLC)，获得7个馏分，分别收集到不同环数的PAHs并进行碳同位素分析，分离净化前后4种甲基菲异构体的碳同位素不确定度在0.5‰以内(n=3)，仪器分析精度(SD)在0.5‰以内，海洋沉积物中PAHs只有菲的仪器分析精度略差。O’Malley等[22]采用凝胶色谱-硅胶柱色谱法，对3环PAHs的回收率约50%，4～5环PAHs的回收率为85%，PAHs标准品(单标)的仪器分析精度为0.09‰～0.59‰，沉积物样品为0.17‰～1.16‰。但净化步骤越多，造成的目标物的损失也必然越多。

已有分离净化方法对低分子量(环数小于3)的PAHs关注不多，对环境样品的PAHs碳同位素仪器分析精度往往比标准品差，可能是分离净化过程没有消除共流出和UCM等造成的。前处理过程联合HPLC对PAHs分环分离净化的效果较好[26]，也有研究将HPLC与气体同位素质谱联合使用[7]，但两种方式均需要配备高压液相设备，对实验室条件要求较高。也有报道曾提出经过合适的固相萃取技术分离后，也可以达到HPLC的分离净化效果[27]。Okuda等[21]不使用HPLC，仅用柱色谱分离法能够将PAHs按照环数分离，但除杂效果并不理想，首先不能消除中低环数PAHs馏分中的UCM，其次一部分中环PAHs在高环PAHs的馏分中出现。

结合前人研究经验，本研究不采用分环分离PAHs的思路，期望可以在避免使用HPLC的前提下，通过对固相萃取柱色谱方法进一步优化，实现PAHs尤其是较低环数PAHs的分离净化，消除共流出和未分峰对其单体碳同位素准确分析的干扰。优化内容包括选择柱色谱填料、淋洗溶剂配比及其用量。研究中使用气相色谱(GC)对分离净化效果进行初步检验，气体同位素质谱(GC-IRMS)进行单体碳同位素分析。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

气体同位素质谱仪(GC-IRMS，Trace 2000气相色谱仪-GC/CIII接口-MAT253质谱仪，美国ThermoFisher公司)。加速溶剂萃取仪(ASE200型，美国Dionex公司)；超声波清洗器(KQ-500DB型，江苏昆山超声仪器有限公司)；固相萃取装置(24位型，美国Supelco公司)；气相色谱仪(GC-2010型，配有氢火焰离子化检测器，日本岛津公司)。

DB-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm，美国J&W公司)。

载气包括高纯氮气、高纯氦气、高纯二氧化碳、高纯氧气(纯度≥99.999%，北京市北温气体制造厂)。

1.2 材料与主要试剂

氨基SPE小柱(500mg/3mL，美国Alltech公司)；硅胶SPE小柱(500mg/3mL，美国Alltech公司)；硅胶SPE小柱(1000mg/6mL，美国Alltech公司)。

内标2,2’-二氟联苯(纯度≥98%，Aldrich)；内标三联苯(纯度≥99.5%，德国Aldrich公司)。

正己烷、环己烷、正戊烷、二氯甲烷、氯仿、丙酮(农残级，美国TEDIA公司)。

1.3 实验方法

1.3.1样品制备

实验中的模拟样品由杂质和EPA 16种PAHs混合组成。杂质来自土壤(ASE萃取)和植物叶片(超声仪提取)的有机提取物：经过硅胶柱色谱族组分分离，分别淋洗出烷烃、芳烃和极性组分(EPA标准方法)，其中芳烃组分弃去，烷烃组分和极性组分合并后在氮气下吹干备用，即为杂质。

已有研究认为土壤中有机组分主要包括直链或环烷烃化合物、酸类、醇类、石蜡、萜类、酰胺、甾类、蜡、醛、酮和酯类化合物等[29-33]。石油醚、异丙醇和甲醇等有机溶剂为萃取剂时，土壤提取物以直链或环烷烃化合物为主，含量占总提取物的95%以上；萃取溶剂中加入30%的乙酸或氨水之后，酯、酰胺和甾类物质才被大量萃取，烃类化合物仍占到70%左右[29]。植物的有机组成包括烃、酯、醇、酸、酮、烯等以及大量色素类物质[34-35]。本研究中添加的杂质为正己烷-丙酮(1∶1，V/V)萃取获得(见1.3.3节)，其主要成分应为烷烃类化合物、酯、醇、酸类和色素类物质。

杂质在添加前均经过称重，根据添加杂质的质量，模拟样品分为3种：模拟样A(3000ng添加样品)，含30000ng杂质和3000ng EPA 16种PAHs；模拟样B(2000ng添加样品)，含30000ng杂质和2000ng EPA 16种PAHs；模拟样C(多杂质高浓度样品)，含90000ng杂质和3000ng EPA 16种PAHs。

1.3.2SPE小柱净化

在前人研究方法[21,36]的基础上，本文对比了氨基和硅胶两种填料类型的固相萃取小柱，以更好地分离烷烃、芳烃和极性组分，消除共流出和未分峰，同时希望尽量减少分离净化步骤。

500mg/3mL的SPE小柱(硅胶和氨基)淋洗流程：首先用3个柱体积二氯甲烷和5个柱体积正戊烷对SPE小柱进行预淋洗，待正戊烷将要流干时，将预先配制好的模拟样A(3000ng添加样品)加入SPE小柱中，分别加入4mL正戊烷和12mL正己烷作淋洗液。其中正戊烷平分2次加入，获得2个馏分F1和F2。正己烷平分6次加入，淋洗液分别按序收集，记为F3、F4、F5、F6、F7、F8。各馏分均浓缩至0.5mL，待GC测定。

1000mg/6mL的硅胶SPE小柱淋洗流程：首先用3个柱体积二氯甲烷和5个柱体积正戊烷对SPE小柱进行预淋洗，待正戊烷将要流干时，将预先配制好的模拟样加入SPE小柱，分别加入6mL正戊烷和若干不同配比的溶剂作淋洗液。2个馏分均浓缩至0.5mL，待GC和GC-IRMS测定。

1.3.3仪器工作条件

加速溶剂萃取仪萃取土壤样品中有机质。仪器工作参数为：温度150℃，压力1200psi，静态加热5min，循环2次，提取溶剂为正己烷-丙酮(1∶1，V/V)。

超声提取植物叶片有机质。参数为：功率100%，温度30℃，提取溶剂为二氯甲烷，每次提取时间10min，提取5次。

气相色谱法(GC)分析PAHs含量。仪器工作参数为：进样口温度280℃，不分流进样，进样体积1.0μL，载气为高纯氮气，FID检测器，检测器温度330℃。DB-5MS色谱柱，柱箱初始温度60℃，以3℃/min升至320℃。

气体同位素质谱法(GC-IRMS)分析PAHs单体碳同位素比值。仪器工作参数为：PTV进样口，进样口温度55℃，蒸发温度55℃，传输温度320℃，溶剂蒸发时间2.5min，样品传输时间1.5min，进样口梯度压力为40psi—60psi—70psi；不分流进样，分流时间1.5min；进样体积5.0μL，载气为高纯氦气，恒流流速2.0mL/min。DB-5MS色谱柱，柱箱初始温度为60℃，保持5min，以4℃/min升至320℃，恒温10min。氧化炉温度950℃；还原炉温度640℃。

2 结果与讨论

2.1 仪器稳定性检验

2.2 填料的选择

Wise等[36]以正戊烷或正己烷为淋洗液，烷烃组分均先于芳烃组分流出，且正戊烷对二者分离效果更佳(详见以下2.3节)。因此SPE小柱填料优化中，选择以正戊烷为淋洗液分离烷烃馏分，正己烷淋洗PAHs馏分。实验对比了500mg/3mL的氨基和硅胶SPE小柱，尝试利用正戊烷和正己烷将模拟样品A中的芳烃与烷烃、UCM峰、醇类等物质分离(步骤见1.3.2节)，各馏分淋洗结果如图1所示。硅胶SPE小柱对16种PAHs的回收率为90%～129%，氨基柱的回收率为81%～105%，硅胶SPE小柱的回收效果更优。氨基柱对芘等前8种PAHs的保留能力明显弱于硅胶柱：氨基柱的F1馏分中有20%以上的萘和苊流出(图1a，图2a)，而硅胶柱F1馏分中没有PAHs流出(图1b，图2b)；氨基柱中芘等前8种PAHs基本在F2馏分中，而硅胶柱中只有萘、苊烯和苊大量在F2馏分流出。两种填料条件下，烷烃组分、UCM均基本存在于F1馏分中。硅胶柱中多环芳烃均在F2馏分及之后流出，但氨基柱中有20%以上的萘和苊在F1馏分中流出，不能与烷烃和未分峰完全分离。因此，硅胶柱分离烷烃和芳烃的能力优于氨基柱，本文选择硅胶SPE小柱继续完成淋洗溶剂选择实验。

图1 (a)氨基SPE小柱和(b)硅胶SPE小柱净化中各馏分中PAHs回收率Fig.1 Purification recoveries of PAHs in each fraction by (a) amino and (b) silica gel SPE column

a—500mg/3mL氨基柱净化F1馏分色谱图； b—500mg/3mL硅胶柱净化F1馏分色谱图； c—1000mg/6mL硅胶柱，正戊烷分离净化的第2馏分色谱图； d—1000mg/6mL硅胶柱，正戊烷-二氯甲烷(70∶30，V/V)净化的第2馏分色谱图。图2 不同条件SPE小柱分离净化结果Fig.2 Chromatograms of different types of SPE column purification. a—Chromatogram of F1 by 500mg/3mL amino SPE column purification; b—Chromatogram of F1 by 500mg/3mL silica gel SPE column purification; c—Chromatogram of elution with pentane by 1000mg/6mL silica gel SPE column; d—Chromatogram of elution with n-hexane-DCM(70∶30, V/V) by 1000mg/6mL silica gel SPE column

2.3 淋洗溶剂的选择

考虑到环境样品中PAHs单体碳同位素分析时称样量较大，500mg/3mL的硅胶柱载样量有限，很容易穿透或饱和而影响分离效果。因此，淋洗溶剂优化过程中采用更大载样量的1000mg/6mL的硅胶SPE小柱。

Okuda等[21]曾利用硅胶-氨基柱色谱法，尝试按照环数对PAHs进行分离。该方法中硅胶柱第1馏分以2mL正己烷为淋洗溶剂，未能将烷烃和UCM全部淋洗出，UCM和PAHs共存于第2馏分中。本研究中利用硅胶SPE柱色谱法，以2mL正戊烷为淋洗溶剂，UCM基本与烷烃同时在第1馏分流出(图2b)，与PAHs分离效果较好(图2c，d)。Okuda等[21]的方法利用氨基柱对硅胶柱的第2馏分(含PAHs)进行了二次分离，但效果仍不理想：2环PAHs和75%的UCM存在于氨基柱第1馏分中；3环和部分4环PAHs与25%的UCM共存于氨基柱第2馏分中；只有4环及4环以上PAHs与UCM分离效果较好(氨基柱第3馏分)。相比较而言，硅胶固相萃取中，以正戊烷为淋洗溶剂分离烷烃、UCM与芳烃的效果优于正己烷，除杂效果更好。

对于1000mg/6mL的硅胶SPE小柱，6mL正戊烷可以实现烷烃、UCM和芳烃分离，但正戊烷对芳烃的洗脱能力较弱，需要继续加入～80mL正戊烷，16种多环芳烃的回收率才基本达到稳定，回收率约为74%～112%。该方法虽然可以实现PAHs的分离净化，但是溶剂使用量大、耗时长。更重要的是，分离净化后的PAHs馏分中出现一些杂峰(图2c)，这些杂峰在溶剂空白、自填玻璃硅胶柱空白和色谱柱流失中均未出现，推断可能来自SPE小柱聚丙烯柱管。高达80mL的溶剂长时间、大体积淋洗，可能导致柱管中某些物质释放，影响除杂效果。因此，本文对PAHs组分的淋洗溶剂进行了优化，期望用较少的淋洗液达到最好的分离净化效果。对比研究了10种不同配比淋洗液洗脱PAHs的效果，每种淋洗方式均经过6次平行实验。表1列出了不同配比淋洗液条件下16种PAHs的回收率范围及达到稳定值时各淋洗液的用量。

10种溶剂配比中，正戊烷-二氯甲烷(70∶30，V/V)和环己烷-二氯甲烷(90∶10，V/V)均能够实现较少量溶剂(5mL)高效洗脱16种多环芳烃。前者的回收率更高，可以达到84%～119%(表1)。这可能与后者洗脱溶剂中的环己烷黏度大、流动性差、浓缩蒸发速率慢、PAHs易挥发有关。综合来说，硅胶SPE小柱分离PAHs的最优淋洗方式为：6mL正戊烷和5mL正戊烷-二氯甲烷(70∶30，V/V)梯度洗脱，分别获得烷烃和芳烃馏分，其中PAHs存在于第2馏分。色谱图显示，该方法基本有效消除UCM和烷烃，目标物与烷烃以及醇、酯等极性略强的组分分离效果良好。由于第2馏分中UCM基本消除，获得了相对干净的多环芳烃组分(图2d)，有利于高精度、准确分析PAHs单体碳同位素。

表1 不同配比淋洗液溶剂用量及多环芳烃回收率Table 1 Elute volume and recoveries of PAHs eluting with different solvents

2.4 PAHs的回收率和精密度

在1000mg/6mL硅胶SPE小柱中加入模拟样品A或B，淋洗溶剂分别为6mL正戊烷和5mL正戊烷-二氯甲烷(70∶30，V/V)。每种模拟样品进行6个平行实验。样品经过硅胶SPE小柱分离净化后，共流出大幅度减少，UCM峰基本消除，基线低而平缓(图3)，对PAHs单体碳同位素分析非常有利。馏分中16种PAHs的回收率为79%～128%(RSD为2%～13%)。

a—模拟样品中添加的杂质； b—模拟样B(2000ng添加)净化后,各组分分别为：1—萘； 2—二氟联苯； 3—苊烯； 4—苊； 5—芴； 6—菲； 7—蒽； 8—荧蒽； 9—芘； 10—苯并(a)蒽； 11—； 12—苯并(b)荧蒽； 13—苯并(k)荧蒽； 14—苯并(a)芘； 15—茚并(1,2,3-cd)芘； 16—二苯并(a,h)蒽； 17—苯并(g,h,i)苝； 18—三联苯。图3 2000ng添加样品净化前后色谱图Fig.3 Chromatograms of before and after clean in 2000ng spiked level. a—Chromatogram of impurities； b—Chromatogram of after clean in 2000ng spiked level. These compounds are 1—naphthalene; 2—dichlorodiphenyl; 3—acenaphthylene; 4—acenaphthene; 5—fluorene; 6—phenanthrene; 7—anthracene; 8—fluoranthene; 9—pyrene; 10—benzo(a)anthracene; 11—chrysene; 12—benzo(b)fluoranthene; 13—benzo(k)fluoranthene; 14—benzo(a)pyrene; 15—indeno(1,2,3-cd)pyrene; 16—dibenzo(a,h)anthracene; 17—benzo(g,h,i)perylene; 18—terphenyl

考虑到环境样品中PAHs单体碳同位素分析时样品用量较大，可能会带入更多杂质，选择模拟样C(多杂质高浓度样品)再次对分离净化方法进行验证，回收率为87%～125%(RSD为3%～18%)。但此时UCM峰和共流出仍然比较严重，用同样的流程对其进行了二次净化后UCM基本消失，回收率为65%～127%(RSD为8%～20%)。经过第二次净化后，萘、苊烯、苊的回收率较第一次净化降低了20%左右。净化步骤增加，可能对低分子量、挥发性强的PAHs回收率影响较大。

2.5 PAHs单体碳同位素比值分析精度和准确度

表2 SPE小柱分离前后PAHs的δ13C分析精度和准确度Table 2 Precision and accuracy of δ13C values of PAHs before and after SPE column separation

3 方法验证

采集了北京某加油站附近表土样品两种(JYZ-M和JYZ-W)、北京某公共汽车站附近表土(Bus Station)和安徽某加油站附近表土(HN)，对优化后的PAHs分离净化方法进行验证。上述环境样品加入内标二氟联苯和三联苯后经ASE抽提，按照优化的实验条件进行硅胶柱色谱分离，每种样品进行了3～6次平行实验。JYZ-M和HN经过一次净化后，共流出和UCM基本消除。而JYZ-W和Bus Station经过第一次净化后，UCM和其他成分的共流出仍然比较严重，经过第二次净化后UCM和共流出基本消失，色谱图显示基线平缓。

利用GC-IRMS分析了净化后的PAHs单体碳同位素，但是由于环境样品中PAHs含量较低，GC-IRMS检出限较高，部分PAHs含量低于GC-IRMS检出限。各样品中均有检出的目标物为萘、菲、荧蒽和芘以及内标二氯联苯和三联苯，其单体碳同位素比值分析精度和均值结果见表3，除JYZ-W中的芘以外，PAHs单体碳同位素分析精度优于0.75‰。

表3 表土中多环芳烃单体碳同位素分析结果Table 3 δ13C values of PAHs in topsoil samples

4 结论

优化了SPE净化分离土壤中多环芳烃的条件：选择1000mg/6mL硅胶SPE小柱，利用6mL正戊烷淋洗烷烃和UCM，5mL正戊烷-二氯甲烷(70∶30，V/V)洗脱PAHs。流程简单易操作、溶剂用量少，PAHs回收率可以达到74%～128%，相对标准偏差为2%～13%(n=6)。净化过程大幅降低了未分峰和共流出物的干扰，尤其是对低环数PAHs的干扰。分离净化前后PAHs单体碳同位素比值变化基本在1.1‰以内，前处理过程没有造成目标化合物的碳同位素分馏，可以满足准确高精度的PAHs单体碳同位素分析。

利用表土样品对分离净化方法的可行性进行了验证，理论上该方法对植物、大气沉降、沉积物等样品同样适用。此外，由于同位素分析检出限高以及环境样品中PAHs含量并不高，满足PAHs单体碳同位素分析所需的样品量较大，提取物中杂质含量高，很容易达到SPE小柱的载荷极限，造成部分烷烃存留在之后的PAHs馏分中，影响PAHs的净化分离效果，从而影响其单体碳同位素的分析。今后有必要进一步研究SPE小柱将PAHs与UCM、共流出有效分离的载样量，以满足更多类型环境样品中PAHs分离净化的分析需求。