东北红豆杉枝叶中原花色素的提取分离及其糖尿病抑制活性

姜 萍, 曲肼靓, 贾雨欣, 孙智超, 刘思盈, 王 飞

(南京林业大学 化学工程学院,江苏 南京 210037)

红豆杉属在全世界约有11种[1]，红豆杉是提取天然抗癌药物紫杉醇的主要树种[2-4],其主要含有活性多糖、黄酮类、紫杉烷二萜类、生物碱、植物多酚等活性物质[5-7]。由于抗癌药物紫杉醇在红豆杉中含量较低,因此在提取制备紫杉醇时,还可提取分离出原花色素等活性成分,从而提高红豆杉资源的利用率。目前,提取原花色素一般采用传统提取方法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、超临界CO2萃取等提取方法[8-11]。近些年大量研究表明,原花色素具有抗炎、抗癌、抗氧化、抑制糖尿病、抗心血管疾病、降血脂等生物活性。因此,原花色素可以广泛应用于保健品、医药、食品、化妆品等领域。目前,对红豆杉的研究主要集中在紫杉醇等紫杉烷二萜类化合物、黄酮类化合物、多糖类以及生物碱类化合物等[12],而对红豆杉中原花色素的提取工艺、分离方法及其抑制糖尿病活性的报道较少。中国的红豆杉资源约占世界50%以上,对于红豆杉中多种有效成分及其生物活性的研究具有重要的应用价值。本研究采用酶与超声波辅助耦合提取法提取东北红豆杉枝叶中原花色素,采用响应面法优化提取工艺,并探讨了红豆杉枝叶中不同溶剂萃取物及乙酸乙酯萃取物大孔吸附树脂分离组分对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性,以期为红豆杉中原花色素的开发利用提供数据支持,同时为开发出具有潜力的糖尿病抑制剂提供理论依据。

1 实 验

1.1 原料、试剂与仪器

东北红豆杉(TaxuscuspidataSieb. et Zucc)枝叶粉末,含水率8.39%,粒径0.425 mm,由山东威海荣成健康集团有限公司提供,采集于2021年6月。果胶酶,北京擎科新业生物技术有限公司；α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶,Sigma公司；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷,上海麦克林生化科技有限公司；阿卡波糖,拜耳医药保健有限公司；大孔吸附树脂,蚌埠辽源新材料有限公司；葡聚糖凝胶,台州市路桥四甲生化塑料厂；其它试剂均为国产分析纯。

UV-2450紫外-可见分光光度仪,日本SHIMADZU公司；AC5200DTD型超声波清洗机,南京安秀仪器设备有限公司； Cytation 3酶标仪,BioTek公司；Shimadzu LC-IT-TOF-MS液质联用仪,Shimadzu公司；SepaBeanTMmachine T中压制备色谱,南京斑马实验器材。

1.2 红豆杉枝叶原花色素的提取

1.2.1原料中原花色素总含量的测定 称取红豆杉枝叶粉末原料5.00 g置于索氏抽提器中,用50%乙醇为溶剂提取10 h,测定原料中原花色素总含量,做2次平行实验。

1.2.2酶与超声波辅助耦合提取单因素试验 称取红豆杉枝叶粉末原料3.00 g,置于100 mL锥形瓶中,加入不同体积分数乙醇溶剂,再加入果胶酶。在不同的酶质量浓度、液料比、酶解温度、酶解时间、酶超声波功率的条件下,进行酶与超声波辅助耦合提取(提取1次),离心分离,过滤、定容至100 mL,采用香草醛-硫酸法测定提取物中原花色素的含量,并计算原花色素的得率。

1.2.3响应面法优化试验 采用响应面法对红豆杉枝叶中原花色素的酶与超声波辅助耦合提取工艺条件进行优化。根据单因素试验结果,采用Design-Expert 10.0.7.0软件,依据Box-Behnken试验设计原理,设计4因素3水平响应面分析试验[13]。

1.3 原花色素含量的测定及得率计算

1.3.1标准曲线的绘制 采用香草醛-硫酸法[14],以儿茶素为标准品,得到线性关系良好的标准曲线方程。配制质量浓度为0.1、 0.2、 0.3、 0.4和0.5 g/L的儿茶素标准品甲醇溶液,各取0.5 mL放入棕色试剂瓶中,加入3%香草醛甲醇溶液2.5 mL,再加入2.5 mL 30%硫酸溶液,混合均匀。室温条件下显色15 min,采用紫外分光光度计测定其500 nm处的吸光度。以吸光度(Y)为纵坐标,原花色素质量浓度(X)为横坐标绘制标准曲线,得到原花色素标准曲线回归方程为：Y=4.020 8X-0.009 1,R2=0.999 9。

1.3.2原花色素得率计算 按式(1)计算原花色素得率：

(1)

式中：Y—原花色素的得率,%；c—提取液中原花色素质量浓度,mg/L；V—提取液体积,mL；n—提取液的稀释倍数；m—原料的气干质量,g；w—气干原料含水率,%。

1.4 红豆杉枝叶提取物的萃取与分离

1.4.1不同溶剂的萃取 称取红豆杉枝叶原料200 g,用60%乙醇溶液在优化条件下通过酶与超声波辅助提取,浸提3次,合并提取液,过滤,减压浓缩,得浓缩液。依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取,得到5种不同溶剂的萃取物。将得到的5种萃取物进行抑制糖尿病活性实验，选择抑制糖尿病活性较好的乙酸乙酯萃取物进一步分离纯化。

1.4.2大孔吸附树脂分离 取3 g乙酸乙酯萃取物经大孔吸附树脂flash快速中压制备色谱进行分离,选择水/乙醇反相溶剂系统,依次用水,10%、 20%、 30%、 40%、 50%和95%乙醇梯度洗脱,流速为20 mL/min,254和280 nm紫外检测,收集流出液,减压浓缩,冷冻干燥,得到CBFr.1～CBFr.7这7个分离组分,测定原花色素含量,选择原花色素含量较高的CBFr.4进行进一步分离纯化。

1.4.3葡聚糖凝胶分离 取200 mg CBFr.4分离组分经过Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析分离,采用甲醇/水溶剂系统进行梯度洗脱,薄层色谱(TLC)跟踪检测,采用V(乙酸乙酯) ∶V(正丁醇) ∶V(乙酸) ∶V(水)=5 ∶4 ∶2 ∶1为展开剂,碘蒸气熏显色法,合并得到LFr.4分离组分。

1.4.4硅胶柱层析分离 取76.8 mg LFr.4分离组分经硅胶柱层析分离,二氯甲烷/甲醇溶剂系统洗脱,TLC跟踪检测,展开剂为氯仿/甲醇(体积比1 ∶1),碘蒸气熏显色法,合并得到一种原花色素化合物SP,对其进行MS分析。

1.5 分离产物SP的MS分析

采用Shimadzu LC-IT-TOF-MS仪进行MS分析。样品以0.35 mL/min的流速洗脱到ESI离子源中,加热块、弯曲去溶剂化线(CDL)保持在200 ℃。使用氮气作为雾化器和干燥气体,流速设定为1.5 mL/min。ESI源电压设定为4.5 kV,检测器设定为1.61 kV。m/z从100到1 000的负值和正值模式都采集数据。

1.6 糖尿病抑制活性实验

1.6.1α-淀粉酶抑制活性 在含有5 μL 10 g/L淀粉溶液的96孔板中，加入35 μL不同质量浓度样品溶液。混合物在37 ℃下反应5 min,向每个孔中加入10 μL 2Uα-淀粉酶溶液,并在37 ℃下孵育10 min,然后加入150 μL/孔鲁哥比染色液。使用酶标仪测量595 nm处的吸光度值,平行实验3次，以阿卡波糖作为阳性对照。根据式(2)计算样品的抑制率(η),根据不同质量浓度样品抑制率的变化得到半数抑制质量浓度(IC50)值[15]。

η=(A2-A1)/(A3-A1)×100%

(2)

式中：A1—不受抑制的酶的吸光度值(空白对照)；A2—样品和酶混合的吸光度值；A3—不加酶的吸光度值。

1.6.2α-葡萄糖苷酶抑制活性 按照Boue等[16]建立的方法测定α-葡萄糖苷酶抑制活性。在96孔板中加入不同质量浓度样品溶液10 μL,同时加入120 μL磷酸缓冲液和20 μL 2U葡萄糖苷酶溶液,混匀,37 ℃孵育10 min,再加入20 μL 2.5 mol/L 4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)溶液,混匀,37 ℃孵育15 min；立刻加入80 μL 0.2 mol/L Na2CO3,混匀,在405 nm处测定吸光度,以阿卡波糖作为阳性对照。根据式(3)计算样品的抑制率(η′),得出IC50值。

η′=(A′2-(A′1-A0))/A′2×100%

(3)

式中：A0—不同质量浓度样品溶液的吸光度值；A′1—样品对α-葡萄糖苷酶作用后的吸光度值；A′2—无抑制剂的溶液反应后的吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 不同条件对原花色素提取得率的影响

2.1.1乙醇体积分数 在果胶酶质量浓度0.1 g/L、超声波功率144 W、酶解时间60 min、液料比14 ∶1(mL ∶g，下同)和酶解温度50 ℃的条件下提取1次,探讨乙醇体积分数与原花色素得率的关系,结果见图1(a)。由图可知,随乙醇体积分数增加原花色素得率增大,乙醇体积分数60%时达最大值2.44%,提取率53.04%(原料含原花色素4.60%)；当乙醇体积分数大于60%时,原花色素得率下降。这是由于当乙醇体积分数增加,溶剂的渗透性增强,加剧了原花色素溶出；但当乙醇体积分数达到一定程度,脂溶性物质比例增大,降低了原花色素得率。因此,适宜的乙醇体积分数为60%。

a.乙醇体积分数ethanol volume fraction; b.酶质量浓度enzyme concentration; c.酶解温度enzymolysis temperature; d.酶解时间enzymolysis time; e.超声波功率ultrasonic power; f.液料比liquid-solid ratio图1 不同条件对原花色素提取得率的影响Fig.1 Effect of different conditions on proanthocyanidins extraction yield

2.1.2酶质量浓度 选择提取溶剂为60%乙醇、超声波功率120 W,其他提取条件同2.1.1节,探讨酶质量浓度与原花色素得率的关系,结果见图1(b)。由图可见随着酶质量浓度增大,原花色素得率逐渐增大,在酶质量浓度0.15 g/L时达到最大,得率为2.60%。继续升高酶质量浓度,得率反而下降。适量的果胶酶可以破坏植物细胞壁,使原花色素更容易溶出,当酶质量浓度大于0.15 g/L时,酶的活性部位无法与更多的底物相结合,从而使原花色素得率有所下降。因此,较好的酶质量浓度为0.15 g/L。

2.1.3酶解温度 选择乙醇体积分数60%、酶质量浓度0.15 g/L、超声波功率120 W,其他条件同2.1.1节,探究酶解温度与原花色素得率的关系,结果见图1(c)。由图1(c)可知,酶解温度在40 ℃以下时,原花色素得率随着温度升高而升高；在40 ℃时得率达到最大值为3.57%；超过40 ℃时,原花色素得率反而下降。原因是当温度过高时,某些原花色素不稳定,其结构发生改变。因此,较好的酶解温度为40 ℃。

2.1.4酶解时间 选择乙醇体积分数 60%、超声波功率120 W、酶质量浓度 0.15 g/L、酶解温度40 ℃,其他提取条件同2.1.1节,探讨酶解时间与原花色素得率的关系,结果见图1(d)。由图1(d)可知,在50 min以内时,原花色素得率随酶解时间的延长而增加,得率在50 min 时达到最大值为3.14%；50 min后原花色素得率开始下降。这是因为原花色素结构不稳定,长时间的酶解会使原花色素发生变化,且酶解时间过长会导致酶活降低。因此,50 min是较好的酶解时间。

2.1.5超声波功率 选择乙醇体积分数60%,其他条件同2.1.1节,探究超声波功率与原花色素得率的关系,结果见图1(e)。由图1(e)可知,在超声波功率较低时,原花色素得率随着功率提高而增大；得率在超声波功率为120 W时达到最大值3.09%。超声波功率继续增大,原花色素得率反而下降。由于超声波机械效应会造成植物细胞壁的破坏,使得活性物质更容易被提取出来；超声波功率进一步加大时,会使得原花色素发生降解而破坏,且其他成分更易析出。因此,120 W为较好的超声波功率。

2.1.6液料比 选择提取溶剂为60%乙醇,其他条件同2.1.1节,探讨液料比对原花色素得率的影响,结果见图1(f)。由图1(f)可知,液料比小于14 ∶1时,原花色素得率会随液料比的增大而增大；大于14 ∶1时,原花色素得率会随液料比的增大而减小；在14 ∶1时得率最大值为2.79%。这可能是由于溶剂量的加大使物料与溶剂的接触面积增大,原料中的原花色素更易被浸提出来；当液料比增加到一定值时,溶剂和原料已充分接触,如果继续加大溶剂量,反而会使杂质更多地被提取出来,导致原花色素得率下降,并且加大溶剂量,也使提取和回收成本增大[17]。因此,适宜的液料比为14 ∶1。

2.2 酶与超声波辅助耦合提取的响应面优化

2.2.1响应面试验设计及结果 结合单因素试验结果选取酶解温度(X1)、酶解时间(X2)和酶质量浓度(X3)为自变量,以原花色素得率为响应值(Y),根据Box-Behnken模型,运用Design-Expert 10.0.7.0软件进行设计,通过响应面法对试验数据进行分析[17],试验方案及结果见表1。

表1 响应面试验设计及结果Table 1 Experimental design and results of response surface analysis

表2 回归模型方差分析Table 2 Variance analysis of the regression model

2.3 产物SP的MALDI-TOF-MS分析

由SP样品的MALDI-TOF-MS二级分析图谱可知,原花色素分子质子峰(m/z)[M-H]-为577.13,主要碎片峰有287.05、 289.07、 407.07、 425.08。其中425.08主要是原花色素I的醚键断裂得到的碎片峰II；407.07为II失去1分子水形成的碎片峰III；289.07为原花色素I失去了刺槐亭醇醌式氧化物V形成的碎片峰儿茶素IV,具体裂解途径见图2。

图2 样品SP的TOF-MS裂解途径Fig.2 TOF-MS fragmentation pathway of sample SP

由此可以看出,SP样品的分子式为C30H26O12,相对分子质量为578。因此,该原花色素化合物为儿茶素与刺槐亭醇缩合的二聚体。

2.4 对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性

2.4.1不同溶剂萃取物 由表3可知,红豆杉粗提物不同溶剂萃取物在1 g/L质量浓度下,乙酸乙酯萃取物对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有较好的抑制活性,抑制率达到83.60%和63.03%(阿卡波糖抑制活性分别为90.90%和85.73%)；其次正丁醇萃取物对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶也有一定的抑制活性,抑制率分别为63.03%和53.97%；二氯甲烷、石油醚、水萃取物则抑制活性不高。这是由于红豆杉枝叶粗提物不同萃取组分中，乙酸乙酯和正丁醇萃取物中原花色素的含量较多,且乙酸乙酯萃取物中原花色素的含量最多,而原花色素具有较强的抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶作用[21]。因此,乙酸乙酯萃取物对抑制糖尿病有较好的活性。

表3 不同溶剂萃取物对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率Table 3 Inhibition rate of α-amylase and α-glucosidase by different solvent extracts

2.4.2乙酸乙酯层大孔吸附树脂分离组分 如图3(a)所示,大孔吸附树脂分离得到的7个组分中,CBFr.1对α-淀粉酶抑制活性较高,其IC50值为0.036 g/L,略高于阿卡波糖IC50值0.021 g/L。其次为CBFr.2,其IC50值为0.039 g/L；CBFr.3～CBFr.6的α-淀粉酶抑制能力相当,IC50值分别为0.043、 0.041、 0.042和0.045 g/L,CBFr.7的α-淀粉酶抑制活性较低，IC50值为0.053 g/L。可以看出,乙酸乙酯萃取物大孔吸附树脂分离组分均具有一定的α-淀粉酶抑制活性。

图3 乙酸乙酯层大孔吸附树脂分离组分对α-淀粉酶(a)和α-葡萄糖苷酶(b)的抑制率Fig.3 Inhibition rate of α-amylase(a) and α-glucosidase(b) activity by macroporous adsorption resin fractions separated by ethyl acetate

如图3(b)所示,大孔吸附树脂分离得到的7个组分中,CBFr.3对α-葡萄糖苷酶抑制活性最好,IC50值为0.04 g/L,略低于阿卡波糖IC50值0.063 g/L；其次为CBFr.1和CBFr.4,其IC50值分别为0.058 和0.065 g/L,与阿卡波糖相当；CBFr.2的IC50值为0.074 g/L,略高于阿卡波糖，抑制活性较好；CBFr.5的IC50值为0.125 g/L，有一定的抑制活性；CBFr.6和CBFr.7对α-葡萄糖苷酶抑制活性最差。结合上述分析可以看出：CBFr.1～CBFr.4都有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性,以及一定的α-淀粉酶抑制活性,这样既可以达到降血糖的效果,又减少了因过量降低α-淀粉酶活性而产生的副作用。故红豆杉乙酸乙酯萃取物大孔吸附树脂的0～30%乙醇洗脱物CBFr.1～CBFr.4对糖尿病都有较好的抑制活性，表明红豆杉枝叶乙酸乙酯萃取物具有作为天然Ⅱ型糖尿病抑制剂的潜力。

3 结 论

3.1采用单因素试验和响应面法优化东北红豆杉枝叶中原花色素的酶与超声波辅助耦合提取工艺,得到最佳提取工艺条件为：60%乙醇溶液为溶剂、酶质量浓度0.15 g/L、液料比14 ∶1(g ∶mL)、酶解时间50 min、酶解温度40 ℃和超声波功率120 W,此条件下提取1次,原花色素提取得率为3.84%,提取率达到83.48%。

3.2乙酸乙酯萃取物经AB-8大孔吸附树脂、葡聚糖凝胶、硅胶柱层析分离纯化得到一个原花色素化合物SP,通过TOF-MS结构鉴定和紫外全波长扫描,确定该化合物为儿茶素与刺槐亭醇的二聚体原花色素。

3.3乙酸乙酯萃取物经大孔吸附树脂分离得到的7种组分(CBFr.1～CBFr.7)其抗糖尿病活性结果表明：红豆杉枝叶乙酸乙酯萃取物对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶都有较好的抑制作用；分离的7个组分中,CBFr.1对α-淀粉酶抑制活性最高,IC50值为0.036 g/L,CBFr.2～CBFr.5也有较好的抑制能力；CBFr.3对α-葡萄糖苷酶抑制活性最好,IC50值为0.04 g/L(低于阿卡波糖的0.063 g/L)，CBFr.1和CBFr.4的抑制活性与阿卡波糖相当，CBFr.6和CBFr.7的抑制活性最差。故红豆杉乙酸乙酯萃取物大孔吸附树脂的0～30%乙醇洗脱物CBFr.1～CBFr.4可作为Ⅱ型糖尿病抑制剂,为红豆杉枝叶的综合利用开辟了一条新的途径。