漂洗降低白及militarine含量的响应面法研究

陈默然， 于华忠， 刘磊磊， 唐克华

(吉首大学 林产化工工程湖南省重点实验室，湖南 张家界 427000)

白及为兰科白及属多年生草本植物，在我国分布广泛[1]。白及药材为白及的干燥块茎，有清热利湿、消肿生肌、收敛止血的功效，临床疗效显著[1-2]。迄今为止，在白及中已发现超过190余种化合物[3]，包括多糖、三萜类、类固醇、苹果酸衍生物等[4-6]。但在2005～2006年注册的保健食品中，白及原料的使用频次极低(仅1～4次)且未见相关产品[7]；在2013～2015年批准的3 073个保健食品中，依旧未见以白及为原料的产品[8]。白及经水提醇沉之后的上清液，再经过乙酸乙酯萃取后的水层是苦味集中部位，从中鉴别确认的苦味成分主要是1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(militarine)[9]。植物中的苦味物质主要包括多酚类、生物碱类、氨基酸及多肽类、皂苷类，以及无机盐类[10]。白及的苦味来源除了militarine之外，可能还有其它的苦味物质，但尚未发现相关的研究报道。militarine是苹果酸衍生物，主要发现于兰科白及属(Bletilla)、杜鹃兰属(Cremastra)和红门兰属(Orchis)植物中[11]，在白及块茎中的含量较高[3]，并已作为白及药材品质鉴别的指标成分[12]。作为糖苷的一种，militarine可溶于水、乙醇，难溶于极性小的有机溶剂[13]。刘娜等[14]对24批次白及饮片运用UPLC法测定，发现militarine质量分数在18.98～44.87 mg/g；唐修静等[15]研究发现，不同炮制方法对白及药材中militarine含量和浸出物含量有一定的影响。militarine是已探明的白及苦味成分，极性强且溶于水、醇。为建立简便、有效降低白及原料苦味的初加工方法，遂开展热水漂洗法降低militarine含量的研究，探讨漂洗温度、漂洗次数、漂洗时间、pH值等因素对该苦味成分的具体影响与响应面法优化的效果，以期为提高白及的感官评价和白及保健产品的开发应用提供理论依据。

1 实 验

1.1 原料、试剂与仪器

白及(Bletillastriata(Thunb. ex A. Murray)Rchb. f.)，张家界圣君中药材有限公司驯化栽培6年。采集2021年3～6月期间的单窝块茎，将表面附着的泥土充分洗净，再剪除须根，冲洗之后自然晾干，用手动切片器，沿着块茎的长轴方向切制，每片厚度控制在2～3 mm。将切片均匀分组，供试。

militarine标准品(纯度98.7%)，上海同田生物科技有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯；无水乙醇、NaOH、HCl等试剂为分析纯；水为实验室自制超纯水。DBS-139手动切片器；SHZ-D(Ⅲ)循环水多用真空泵；GZX-9146 MBE数显鼓风干燥箱；HH-S4电热恒温水浴锅；RS-FS150荣事达小型磨粉机；XO-3200DT数控超声波清洗机，南京先欧仪器制造有限公司；Agilent 1260高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；FE20实验室pH计，梅特勒-托利多仪器(上海) 有限公司。

1.2 HPLC法测定militarine方法的建立

1.2.1对照品溶液和供试品溶液的配制 参考文献[16]配制对照品和供试品溶液。取militarine对照品适量，干燥至质量恒定，精密称定，容量瓶定容，加50%乙醇溶解，摇匀，制成质量浓度为1.3 g/L的对照品溶液。

取干燥好的白及片，磨粉并过3号筛(粒径≤0.48 mm)，精密称取粉末0.200 0 g，置于锥形瓶中，精密加入50%乙醇25 mL，称定质量；超声波处理 30 min，冷却至室温，用50%乙醇补足质量，摇匀，过滤，取上清液，得供试品溶液。

1.2.2色谱条件 采用Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈/0.1%的磷酸水(体积比为22 ∶78)为流动相，流速1 mL/min，检测波长223 nm，色谱柱温30 ℃，进样量20 μL。

1.2.3标准曲线的绘制 精密吸取militarine对照品溶液0.2、 0.4、 0.8、 1.0、 1.2和2.0 mL，置于10 mL 容量瓶中，用50%乙醇稀释至刻度，分别精密吸取上述稀释后的对照品溶液各20 μL，按照1.2.2节色谱条件进行检测，以峰面积为纵坐标(Y)，militarine质量浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线。

1.2.4精密度实验 精密吸取标准品稀释溶液，连续进样5 次，每次20 μL，测定militarine的峰面积，计算相对标准偏差(RSD)。

1.2.5重复性实验 取样品5份，按1.2.2节色谱条件，测定militarine的峰面积，计算RSD。

1.2.6稳定性实验 取一份样品，按1.2.2节色谱条件，分别于0、 2、 4、 8、 12、 24 h 进样20 μL，测定militarine的峰面积，计算RSD。

1.2.7加标回收率 精密称取已知含量的白及粉末3份，加入各对照品适量，按1.2.2节色谱条件，测定militarine的峰面积，计算回收率。

1.3 热水漂洗降低白及中的militarine

1.3.1白及切片漂洗处理 对均匀分组的切片按组逐一称质量，放入温度参数预调的多孔水浴锅进行漂洗，用盐酸和NaOH溶液调节漂洗液pH值。漂洗过程中定时翻动切片，处理达到设定时间，用具孔不锈钢勺捞出各组白及切片并沥干水，再置于60 ℃的烘箱中干燥2～3天，即得干燥白及切片。

1.3.2单因素试验 选择漂洗温度、漂洗时间和漂洗液pH值这3个因素，分别考察了不同因素对热水漂洗处理的白及鲜茎切片中militarine含量的影响。设置的单因素分别为：漂洗温度(60、 70、 80、 90和100 ℃)，漂洗时间(10、 20、 30、 40和50 min)，漂洗液pH值(3.5、 5.0、 6.5、 8.0和9.5)，在保证白及切片完全浸没于漂洗液的前提下，从减少用水量、降低能耗等方面综合考虑，切片与漂洗液的比例统一设置为1 ∶5(g ∶mL)。

1.3.3响应面优化 通过对单因素的系统考察，以漂洗温度(X1)、漂洗时间(X2)和漂洗液pH值(X3)为自变量，以白及militarine下降比例(Y)为响应值，运用Box-Behnken法[17]对工艺条件进行优化。

1.3.4militarine含量的测定方法 取干燥至质量恒定的白及切片，磨粉过筛，提取[16]多次并定容至25 mL，测定各组白及的militarine含量。每个处理组均留出不处理的白及样片，采取类似方法提取，再测定其militarine含量。热水漂洗处理前的白及鲜茎切片militarine质量分数(ω1)及漂洗后的militarine质量分数(ω2)，均换算为下降比例(Y)以供分析，计算公式为：Y=(ω1-ω2)/ω1×100%。

1.4 漂洗次数对白及militarine含量的影响

在最佳漂洗降苦味参数组合下，研究漂洗1～3次对白及中militarine含量的影响。每组均留出未经处理的白及鲜茎切片为空白对照，将实验组与空白组样本的militarine含量下降比例作为分析依据。

2 结果与分析

2.1 HPLC法测定militarine的方法学验证

militarine质量浓度(X)与峰面积(Y)的回归方程为：Y=22 482X-11.903(R2=0.999 9)，表明militarine质量浓度与峰面积在25.662～256.62 mg/L范围有良好的线性关系。精密度试验的RSD为1.4%，表明仪器精密度良好；重复性试验的RSD为2.5%，表明本方法重复性良好；稳定性试验的RSD为0.29%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。加标回收率平均值为101.08%，RSD为1.04%，反映HPLC法能有效提取检测样品中的militarine。

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1漂洗温度的影响 固定热水漂洗时间50 min、pH值6.5，研究漂洗温度对白及中militarine质量分数的影响，结果见图1(a)。由图可知，在60～100 ℃范围内，militarine质量分数的下降比例随温度升高而增大，100 ℃下漂洗的白及militarine质量分数为18.16 mg/g，相比未处理样(43.77 mg/g)质量分数已下降58.51%。热水漂洗温度最高只可设定为100 ℃，故漂洗处理的温度宜在80～100 ℃范围内选择。

图1 漂洗温度(a)、漂洗时间(b) 和漂洗液pH值(c)对白及militarine质量分数的影响Fig.1 Effect of rinsing temperature(a), rinsing time(b) and rinsing solution pH value(c) on the B. striata militarine mass fraction

2.2.2漂洗时间的影响 固定热水漂洗温度90 ℃、pH值6.5，研究漂洗时间对白及中militarine质量分数的影响，结果见图1(b)。由图1(b)可知，20 min的漂洗处理即可使militarine质量分数快速下降；随着处理时间的延长，militarine质量分数的下降比例呈缓慢递增变化，在处理50 min时白及militarine质量分数为18.16 mg/g，相比未处理样(43.11 mg/g)质量分数已下降59.60%。从能源消耗成本与提高生产时效的实践要求来看，50 min的热水漂洗处理时间已够长，且能达到较理想的苦味成分降低结果，继续延长热水漂洗处理时间对苦味物质militarine质量分数降低的实际意义不大。

2.2.3漂洗液pH值的影响 固定热水漂洗时间50 min、漂洗温度90 ℃，研究pH值对militarine质量分数的影响，结果见图1(c)。由图可知，pH值在3.5～9.5范围内，相比未处理样(50.40 mg/g)militarine质量分数的下降比例在51.59%～58.37%之间，表明在热水漂洗中pH值对militarine的溶出影响较小。漂洗液pH值为6.5时，militarine的下降比例最小，为51.59%，此时militarine质量分数为19.80 mg/g，在偏弱碱性的水中militarine的下降比例有递增趋势。综合考虑漂洗液pH值宜在6.5～9.5范围内选择。

2.3 响应面试验优化工艺条件

2.3.1响应面试验设计及结果 鉴于在偏弱碱性的水中militarine的下降比例有递增趋势，遂重点考察弱碱性、近中性的pH值环境因子组合影响。从生产实践应用的时间投入、能耗等经济成本降低需要考虑，选择各单因素中值水平为：漂洗温度90 ℃、漂洗时间40 min、漂洗液pH值8，试验因素及水平见表1。

表1 响应面法试验设计及结果Table 1 Experimental design and results of response surface methodology

以白及鲜茎切片的militarine质量分数下降比例为响应值，运用Box-Behnken试验方法，进行漂洗温度(X1)、漂洗时间(X2)和漂洗液pH值(X3)的3因素3水平响应面试验，各试验因素组合及测定结果见表1。对表1试验结果进行回归拟合，得到二次回归方程:

表2 回归模型的方差分析Table 2 Variance analysis of the models

2.3.2验证实验 为检测响应曲面法所得因素组合结果预测的可靠性，进行验证实验。根据软件分析得到的最优工艺组合条件，考虑实践操作时的便利，将漂洗温度调整为95 ℃，然后进行5 次平行实验，militarine质量分数下降比例的平均值为63.55%，与模型方程的理论预测值仅相差1.97%。

拟合方程模型预测值及响应面试验个别组数值都存在优于验证实验组数值的情况，推测原因有3方面：1) 单因素试验中，温度、时间的中值选择并不是拐点，更多的是考虑到实践应用时的需要，对响应面优化结果可能造成一定影响；2) 由于白及含有丰富的多糖，切片内的多糖在高温下容易渗出并成膜，导致militarine溶出的传质通道受阻，只进行单次漂洗可能造成实验结果误差；3) 每窝白及的切片分组可能不是十分均匀，且受白及块茎的不规则形状及militarine可能在块茎中存在部位分布差异的影响，也可造成实验误差。

2.4 漂洗次数对白及militarine质量分数的影响

两次漂洗后的白及militarine质量分数下降比例由61.94%提升到76.02%，第3次漂洗后则提升到83.10%。在漂洗过程中，由于白及切片中的多糖或其它可溶浸出物的溶出，容易在切片表面成膜，增加漂洗次数的过程相当于不断破坏切片表面的膜，有助于militarine更充分的溶出。显然，漂洗次数继续增加，militarine质量分数下降比例还有可能继续提升。由于每次漂洗时间接近1 h，漂洗次数增加导致的加工综合成本也将成倍增加，故建议漂洗次数最多不超过3次。

3 结 论

3.1采用响应面法研究了热水漂洗法的漂洗温度、漂洗时间及漂洗液pH值对白及鲜茎切片的militarine质量分数下降比例的影响，得到的最佳因素组合为：漂洗温度95.02 ℃、漂洗时间50 min、pH值6.5。最优条件下简化温度为95 ℃，并进行5次平行实验，militarine质量分数下降比例平均值为63.55%。

3.2热水漂洗次数对白及鲜茎切片的militarine质量分数降低有显著影响。3次漂洗后，militarine质量分数下降比例达到83.10%，故建议漂洗次数最多不超过3次。热水漂洗法降低白及militarine质量分数，操作条件要求简单，能显著降低白及中已明确的苦味成分，满足苦味降低的白及保健食品原料加工要求。