新型姜黄素衍生物荧光探针的合成及对半胱氨酸的选择性识别

罗 凡， 郑东滨， 阳志强， 邓 赟

(成都中医药大学药学院 西南特色中药资源国家重点实验室， 四川 成都 611137)

1 引 言

半胱氨酸(Cysteine，Cys)是一种生物体内常见的脂肪族含巯基的小分子氨基酸，它主要来源于甲硫氨酸的脱甲基以及胱氨酸的还原[1]。半胱氨酸具有的独特的亲核性以及氧化还原特性，使得它在各种生理过程中发挥了至关重要的作用，例如细胞代谢、氧化还原稳态、蛋白质的合成等[2-5]。Cys在生理浓度范围时(20～300 μmol·L-1)，能起到保护细胞抗氧化防御、调节新陈代谢等作用[6]。一旦浓度异常，可能会引发一系列的疾病，例如生长不良、肝损伤、神经毒性、造血功能减退、炎症性肠病、慢性阻塞性肺疾病等[7-11]。因此，建立一种快速定量检测Cys的方法至关重要。

传统的半胱氨酸检测技术主要有高效液相色谱法、碘量法、电化学分析法、气质联用技术等，但大多缺点显著，如样品前处理复杂、测试结果不稳定、步骤漫长、易被干扰、重现性不理想等[12-16]。与之相比，荧光分析法具有操作简便、成本低廉、灵敏度高、不易损害细胞等优势[17-20]。荧光探针一般包括识别基团、信号发射基团和连接基团，目前，基于Cys的化学性质，已有许多反应型荧光探针被报道，反应机理包括迈克尔加成反应、醛环化反应、重排反应等[21-26]。

姜黄素(Curcumin，1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮)是一种从姜黄根中提取出的β-二酮化合物，已有研究证明，姜黄素在抗肝癌、抗肿瘤、抗炎解毒等方面发挥了出色的作用[27-28]。同时，姜黄素是一个典型的对称性电子共轭体系，这一优势使其具有独特的光学性质。利用这一特点，研究者们设计了很多新颖的姜黄素衍生物，但大多被用于识别金属离子，对生物巯基化合物的检测报道较少[29]。在前期研究中，我们制备了三异丙基硅修饰的姜黄素类荧光探针，其能在众多阴离子中高选择性、高灵敏性识别检测氟离子，这是首例基于姜黄素骨架的阴离子反应型荧光探针[30]。基于前期的研究基础，本研究设计合成了一种以姜黄素-二氟化硼为基本骨架、2-氯-5-硝基苯甲酰基作结构修饰的Cys猝灭型探针，利用Cys与探针发生取代缩合反应和加成反应，破坏分子共轭结构使荧光猝灭，从而达到检测的目的。

2 实 验

2.1 仪器与试剂

测试仪器：Brucker 600核磁共振仪(内标物为TMS，德国布鲁克公司)，ISQ EC单四极杆质谱仪(Thermofisher公司，美国)，普析TU-1901型紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，F97Pro18033型荧光分光光度计(上海棱光技术有限公司)，PHS-3CPH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)。除2-氯-5-硝基苯甲酰氯购自上海麦克林生化科技有限公司，其余试剂均购自成都科隆化学品有限公司。

2.2 探针的合成

2.2.1 化合物2的合成

根据文献合成了化合物2[30]，将姜黄素(300 mg,0.81 mmol)和三氟化硼乙醚(345 mg,2.43 mmol)置于含30 mL无水二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中回流搅拌过夜，产物经水洗涤三次用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂后经硅胶柱进一步纯化。以二氯甲烷∶石油醚=2∶1(体积比)作洗脱剂，得到黄色化合物2(146 mg，43%)。1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ10.09(s,2H),7.92(d,J=15.5 Hz,2H),7.47(d,J=2.0 Hz,2H),7.34(dd,J=8.3,2.0 Hz,2H),7.02(d,J=15.6 Hz,2H),6.87(d,J=8.2 Hz,2H),6.44(s,1H),3.85(s,6H)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ178.73,151.35,148.18,146.98,126.00,125.28,117.87,115.96,112.40,101.11,55.77。

2.2.2 探针1的合成

将2-氯-5-硝基苯甲酰氯(66 mg,0.3 mmol)、4-二甲氨基吡啶(37 mg,0.3 mmol)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(173 mg,0.9 mmol)置于含20 mL无水二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中室温搅拌10 min后，加入化合物2(120 mg，0.3 mmol)继续搅拌8 h，产物经水洗涤三次干燥有机相并过滤，以二氯甲烷作为洗脱剂经硅胶柱纯化得到橙色粉末化合物1(141 mg，60%)。m.p. 159～161 ℃。1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ8.82(d,J=2.8 Hz,2H),8.50(dd,J=8.8,2.8 Hz,2H),8.12(d,J=15.8 Hz,2H),8.00(d,J=8.9 Hz,2H),7.78(d,J=1.9 Hz,2H),7.61(dd,J=8.3,1.9 Hz,2H),7.52(d,J=8.2 Hz,2H),7.36(d,J=15.7 Hz,2H),6.69(s,1H),3.91(s,6H)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ180.62,161.32,151.58,146.74,146.71,141.98,139.97,134.26,133.47,129.63,128.96,127.01,124.08,123.37,122.60,114.07,102.84,56.83。ESI-HRMS(m/z) calcd for C35H23BCl2F2-N2O12[M+Na]+805.058 7，found[M+Na]+805.059 7。

探针1的合成过程如图1所示。

图1 探针1的合成路线

2.3 光谱测试

配制3 mmol·L-1探针的DMSO溶液作为母液，用去离子水配制300 mmol·L-1的K+、Ca2+、Fe3+、Gly、Leu、Thr、Glu、Ser、Val、Gln、Met，以及15 mmol·L-1的Cys、Hcy、GSH。所有的光学测试均在HEPES缓冲溶液(10 mmol·L-1，含75%DMSO，pH=7.4)中进行。激发波长为470 nm，荧光测试的激发和发射狭缝宽度均设置为10 nm，测试时间为30 min。

3 结果与讨论

3.1 探针对Cys响应的光谱研究

3.1.1 探针与Cys反应的紫外吸收光谱和荧光发射光谱

在HEPES缓冲溶液(10 mmol·L-1，含75%DMSO)的中测试了探针1(10 μmol·L-1)对Cys(100 μmol·L-1)的紫外吸收和荧光发射光谱。如图2(a)所示，探针1在443 nm和468 nm处有最大吸收，加入10当量的Cys后，在443 nm和468 nm的最大吸收峰减小并伴随着387 nm处出现一个新的吸收峰，且探针溶液颜色由黄色变成无色。如图2(b)所示，探针1的最大发射波长为526 nm，加入10当量Cys后，在526 nm处的荧光几乎完全被猝灭，猝灭率为95%，荧光颜色由黄色变为无色。

图2 探针1(10 μmol·L-1)与Cys(100 μmol·L-1)作用的紫外吸收光谱(a)与荧光发射光谱(b)

3.1.2 探针对Cys响应时间的研究

响应时间是衡量一个反应型探针重要的参数之一，所以测试了探针(10 μmol·L-1)与Cys(100 μmol·L-1)随时间变化的荧光光谱。如图3所示，在加入10当量的Cys后，526 nm处的荧光强度在30 min基本完全猝灭，表明探针1可以稳定且快速地检测Cys。

图3 探针1(10 μmol·L-1)在10当量Cys存在下不同时间的荧光强度(526 nm)变化

3.1.3 荧光滴定

为了进一步研究Cys浓度对荧光光谱的影响，进行了荧光滴定实验。向10 μmol·L-1的探针溶液中依次加入不同浓度的Cys，结果如图4(a)所示。在仅有探针的溶液中，荧光强度在526 nm处达到最高值，随着Cys浓度的增大，荧光强度逐渐降低;当Cys浓度增大到10当量时，526 nm处的荧光完全猝灭。如图4(b)所示，在10～70 μmol·L-1的浓度范围内，Cys的浓度与荧光强度呈良好的线性关系，其线性方程为y=-0.0146x+1.1055(R2=0.997 5)，检出限为2.9 μmol·L-1。上述结果证明探针对Cys响应的灵敏度较高。

图4 (a)探针1(10 μmol·L-1)与不同浓度的Cys(0，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，80，90，100 μmol·L-1)荧光滴定曲线，插图为加入不同当量Cys的探针溶液在526 nm处的荧光强度；(b)Cys的浓度与526 nm处荧光强度的线性关系。

3.2 探针的选择性研究

为了测试探针对Cys的选择性，向探针1(10 μmol·L-1)中加入1 mmol·L-1不同分析物(K+、Ca2+、Fe3+、Gly、Leu、Thr、Glu、Ser、Val、Gln、Met)，以及100 μmol·L-1的Cys、Hcy、GSH，测定其紫外吸收光谱。如图5(a)所示，加入Cys后，探针在443 nm和468 nm处的最大紫外吸收明显下降，其他干扰物对探针的紫外吸收无明显影响，只有Hcy和GSH显示出轻微的干扰。为了进一步评估探针检测Cys的抗干扰能力，在不同分析物的探针溶液中加入100 μmol·L-1的Cys，测定其荧光发射光谱。如图5(b)所示，结果显示的变化与紫外吸收一致，Cys可以使探针在526 nm处的荧光完全猝灭，即使在过量的其他干扰物的存在下也不会发生变化。Hcy和GSH的荧光强度虽略有降低，但与Cys相比降低程度不明显，猝灭率分别为21%和30%。这表明探针对Cys的响应具有较高的选择性。

图5 (a)探针1(10 μmol·L-1)与不同分析物作用的紫外吸收光谱；(b)在不同分析物的存在下，探针1(10 μmol·L-1)与10当量的Cys作用的荧光强度(526 nm)变化(1.Cys, 2.Fe3+, 3.Ca2+, 4.K+, 5.Gly, 6.Leu, 7.Thr, 8.Glu, 9.Ser, 10.Val, 11.Gln, 12.Met, 13.Hcy, 14.GSH)。

3.3 探针对Cys检测pH范围的研究

为了研究探针在生理条件下对Cys是否有良好的检测性能，研究了pH对纯探针(10 μmol·L-1)以及加入100 μmol·L-1Cys后的探针的荧光强度的影响。如图6所示，在pH值5.0～8.0范围内，纯探针溶液的荧光强度基本保持不变; 加入100 μmol·L-1的Cys后，在pH值6.5～8.0范围内，探针溶液的荧光强度发生了显著的变化。在pH值为7.4时，加入的Cys能使探针的荧光基本完全猝灭。上述研究表明探针能在生理条件下实现对Cys的较好选择性识别。

图6 探针1(10 μmol·L-1)与加入Cys(100 μmol·L-1)的探针溶液在pH=5～8的影响下526 nm处荧光强度的变化

3.4 探针对Cys的识别机理研究

为了研究探针对半胱氨酸识别机理，对加入10当量的半胱氨酸的探针溶液进行高分辨质谱检测，如图7所示，在m/z=207.050 84处的峰可以合理地归属于[2-2H+]2-(理论值为207.054 3)。推测探针与Cys发生如图8所示的反应，可能存在两种反应途径:一是探针分子加入Cys后，巯基与苯环上的氯原子发生亲核取代反应(图8中Route 1)，氨基进攻羰基碳发生分子内缩合生成苯并七元环3(在m/z=267.008 24处的峰可以归属于化合物3，理论值为267.007 6)；二是化合物2骨架双键与Cys发生加成反应(图8中Route 2)，导致共轭结构被破坏，荧光猝灭(在m/z=560.132 0处的峰可以归属于化合物[4+Na]+，理论值为

图7 探针1与10当量Cys反应质谱图

图8 探针1对Cys的可能识别机理

560.133 8)。这两种途径也可能同时进行。

3.5 水样检测

为了研究探针1在环境监测中的应用，对成都中医药大学的自来水、河水中不同浓度的半胱氨酸进行了检测。直接过滤水样，调节pH至7.4，向含探针的水样中添加不同浓度的半胱氨酸(20，40，60 μmol·L-1)。如表1所示，计算了自来水和河水中半胱氨酸的回收率，回收率范围为98%～109%。结果表明，探针1在实际水样半胱氨酸的定量检测中有潜在的应用价值。

表1 水样中Cys的检测结果

4 结 论

本文合成了一种以姜黄素-二氟化硼作为基本骨架的新型猝灭型探针。该探针在生理条件下对Cys表现出高灵敏度、高选择性以及快速响应，其检测限为2.9 μmol·L-1。识别机理推测为Cys与姜黄素中2-氯-5硝基甲酰基基团发生亲核取代关环反应和Cys与姜黄素骨架双键发生加成反应，使分子的共轭结构被破坏，导致探针荧光猝灭。响应时间为30 min，溶液颜色由黄色变为无色。此外，该探针能成功应用于水样模拟检测。本研究为构建新的天然姜黄素衍生物荧光探针提供了思路。

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