基于硫、氮双掺型碳点的稀土荧光信号驱动式汞离子传感器

吴楚侨，林 鑫，蒋腊生，王前明

(华南师范大学 化学学院，广东 广州 510006)

1 引 言

近年来，Hg2+污染环境已成为全球关注的问题。在各种形式中，二价汞离子(Hg2+)被广泛认为是水生生态系统中最危险和最有毒的阳离子之一[1-2]。长期摄入汞会对人类造成毒害，因为Hg2+与含S的配体具有很强的亲和力，可以破坏蛋白质或酶中的S—S或S—H键，甚至在极低水平下导致大脑、中枢神经系统和肾脏出现各种疾病，对人类健康造成极其严重的损害[3-5]。为保护环境和人类的健康，美国环境保护署 (EPA) 规定饮用水中允许Hg2+的最高浓度为10 nmol·L-1[2,6]。因此，有必要开发一种合成步骤简单的材料，以高度敏感和高选择性检测水样中的汞离子。

传统的分析技术普遍存在预处理时间过长、实验仪器昂贵和检测过程复杂的问题[7-9]，无法实现方便快捷的在线Hg2+监控。而荧光探针具有节能、低成本、较高选择性和灵敏度等优势，引起了许多研究者的高度关注。迄今为止，研究人员已经报道了多种对Hg2+具有特异性识别功能的荧光探针[10-15]。然而，大多数荧光探针在与Hg2+的特定结合时仅仅显示出简单的荧光“开启”或“关闭”反应。这种荧光强度的单一变化很容易受到与仪器和环境相关的各种因素的影响，从而阻碍了它们在实际检测中的广泛应用。与传统的单强度荧光传感器不同，比率荧光传感器是基于测量相同激发波长下两种不同发射波长的荧光强度的相对变化，这在很大程度上消除了仪器和环境引起的波动，从而使其在实际应用中具有较大的应用潜力。

与传统荧光传感器相比，稀土荧光传感器具有优越的光谱特性，包括大斯托克斯位移、长荧光寿命和锐线发射谱带，这些优点使其适合用于时间分辨荧光检测[16-17]。Nishiyabu等[18]报道鸟苷单磷酸(GMP) 可以与Tb3+自组装，形成超分子镧系配位聚合物 (Tb-GMP)，由于自组装过程中GMP中部分氧原子和氮原子与Tb3 +离子发生配位，能量从鸟嘌呤G基转移到Tb3+的发射5D4组态，因而Tb-GMP可以释放Tb3+强烈的绿色发光[19-20]。受此启发，我们计划基于Tb-GMP来设计和制备一种新型双发射荧光探针。

在这项工作中，我们研制出一种基于硫、氮双掺型碳量子点(CQD)的稀土荧光信号驱动式双发射传感器并用于检测Hg2+。由于鸟苷单磷酸(GMP)对铽离子具有优异的生物相容性和选择性敏化作用[18,21-22]，因此采用GMP作为中间配体构建GMP/Tb超分子网络。S,N-CQDs既作为载体，又在GMP和Tb3+的自组装中协助构筑双发射比率荧光传感器S,N-CQDs@GMP/Tb。S,N-CQDs@GMP/Tb在UV灯激发下发出蓝偏绿色荧光，这是由于GMP的有效能量传递给Tb3+产生的绿色荧光峰和S,N-CQDs本身的蓝色荧光峰两个强特征发射峰形成的。而Hg2+的加入可以与鸟苷分子相互作用，鸟嘌呤部分氨基和GMP的磷酸基与汞离子产生配位结合形成新的复合物，这将导致GMP能传递给Tb3+的有效能量急剧减少，从而导致发光强度相应降低[20,23]，这就为Hg2+的荧光检测提供了可能性。基于此，我们得到了一种基于S,N-CQDs@GMP/Tb的低成本荧光活性Hg2+检测途径，并为此设计出识别Hg2+的纸质可视化传感器。

2 实 验

2.1 试剂和仪器

柠檬酸(Citric acid)、半胱氨酸(L-cysteine)、N-2-Hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethanesulfonic acid(HEPES)、鸟苷单磷酸(GMP)和硝酸铽六水合物((Tb(NO3)3·6H2O))购自阿拉丁公司(中国上海)。将碱和碱土金属阳离子以氯酸盐的形式作为吸收和荧光试剂加入到溶液中，其他金属阳离子以金属硝酸盐的形式加入。所有试剂和溶剂均从商业供应商购买且不经任何处理直接使用。

采用紫外-2700分光光度计(日本岛津) 测定了紫外相对吸收光谱。采用F-4600分光荧光计(日本日立) 在室温下测试了荧光光谱。采用FLS-920荧光分光光度计(英国爱丁堡) 测定荧光寿命。采用JEM-2100HR(日本电子有限公司) 透射电子显微镜(TEM)观察了样品的形貌。通过X射线能谱(EDS) 分析了其表面元素组成和含量。采用日本Prestige-21光谱仪(日本岛津)，以溴化钾压片法记录了傅里叶变换红外光谱(FT-IR) 。采用phs-3C pH计(中国上海)调整水溶液的pH值。所有测试均是在室温下进行。所有实验重复3次或以上并计算均值及标准差。

2.2 S,N-CQDs制备

采用溶剂热法制备硫、氮双掺杂的碳点(S, N-CQDs) 。将1.5 g柠檬酸和0.8 g L-半胱氨酸溶解在15 mL去离子水中，搅拌使其混合溶解后转移到有聚四氟乙烯内衬的反应釜(50 mL) 中，升温至180 ℃反应12 h后冷却至室温，转移到截留分子量(MWCO) 为1 000 u的透析袋中，在去离子水中透析36 h，期间换三次水，以去除未反应的物质。然后在冷冻干燥器中干燥，获得目标产物S,N-CQDs粉末。随后，将S,N-CQDs固体粉末分散在超纯水中作为储备溶液(浓度为1.0 mg·mL-1) 用于后续所有测试。目前采用相对方法计算了碳点的量子产率(QY)，详细信息见补充材料的实验部分。最终测得的相对量子产率为28%。

2.3 S,N-CQDs@GMP/Tb制备

将S,N-CQDs组装到GMP/Tb纳米颗粒中以形成S,N-CQDs@GMP/Tb复合物。用HEPES缓冲溶液(0.1 mol·L-1, pH 7.4, 10 mL)配制的GMP (50 mmol·L-1) 加入到10 mL 1 mg/mL S, N-CQDs水溶液中，室温下搅拌30 min。随后在剧烈搅拌下将Tb(NO3)3·6H2O (50 mmol·L-1, 10 mL)水溶液加入到上述S,N-CQDs@GMP溶液中。30 min内，该溶液在室温下形成白色沉淀物。最后，通过离心收集、洗涤干燥得到S,N-CQDs@GMP/Tb，待进一步使用。S,N-CQDs@GMP/Tb的合成路线如图1所示。

图1 S,N-CQDs@GMP/Tb合成策略及Hg2+传感机制示意图

2.4 溶液中Hg2+滴定的荧光光谱测定

首先，用HEPES (0.1 mol·L-1, pH 7.4)将S,N-CQDs@GMP/Tb溶液 (1.0 mg·mL-1) 稀释至50 mL，并测量在发射波长位于497，551，593，628，457 nm的荧光峰强度。通过加入不同浓度的Hg2+(10-9～10-8mol·L-1) 配制S,N-CQDs@GMP/Tb溶液(0.1 mol·L-1HEPES中20 μg·mL-1S,N-CQDs@GMP/Tb，pH 7.4)，振荡摇匀5 min后进行荧光光度测定。在10-8mol·L-1Hg2+浓度下加入其他阳离子(10-8mol·L-1)，重复上述滴定实验。所有的荧光光谱都是在400～650 nm的波长范围以305 nm最佳激发波长下获得。

2.5 S,N-CQDs@GMP/Tb对金属离子的选择性

通过测试S,N-CQDs@GMP/Tb传感器对15种金属阳离子的响应，评估了该传感器的选择性。金属阳离子包括K+、Na+、Al3+、Ba2+、Be2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+、Pd2+、Cd2+、Cu2+、Fe3+、Hg2+(10-8mol·L-1)被分别加入到S,N-CQDs@GMP/Tb溶液中，分别记录波长位于497，551，593，628，457 nm的荧光发射峰强度的变化。

2.6 基于纸质的可视化传感器制备

本研究中，我们利用普通纤维滤纸制造纸质传感器用于Hg2+浓度的检测。基底材料可以采用相同的大小和厚度进行一次性切割。本研究用尺寸为3 cm圆型滤纸检测Hg2+，用S,N-CQDs@GMP/Tb溶液浸泡圆形滤纸，孵化10 min后，把圆形滤纸取出在空气中自然风干。干燥后，S,N-CQDs@GMP/Tb固定化的滤纸片即可作为Hg2+检测的纸质视觉传感器。将不同浓度的Hg2+(0，2，4，6，10 nmol·L-1) 滴加到已经制做好的圆形滤纸上，立即用波长为254 nm的紫外灯照射，肉眼即可观察到荧光颜色的变化。

3 结果与讨论

3.1 S,N@GMP/Tb的形貌与结构组成

采用透射电镜图研究了S,N-CQDs@GMP/Tb的微观结构和尺寸特征，图2(a)为S,N-CQDs的TEM图像，显示合成的S,N-CQDs呈球形且处于单分散状态，粒径为4 nm左右，晶格间距为0.21 nm，说明该量子点材料具有较好的结晶性能。图2(b)为S,N-CQDs@GMP/Tb的HRTEM图，发现S,N-CQDs的周围形成网络状的交联结构，这使材料的刚性大大增强，说明鸟苷单磷酸在

图2 (a)S,N-CQDs的TEM图像，插图：S,N-CQDs的HRTEM图像;(b)S,N-CQDs@GMP/Tb纳米复合材料的HRTEM图像。

复合结构中对铽离子产生有效的配位结合作用，并引导碳量子点融入并形成延伸的枝状形貌，因此S,N-CQDs@GMP/Tb纳米结构复合物得以顺利组装。此外，还对材料进行了元素分析，图S2为能谱分析数据，C、N、O、P、S和Tb元素峰的存在证实S,N-CQDs、Tb3+和GMP均参与S,N-CQDs@GMP/Tb的构筑。

图3 (a)S,N-CQDs(黑线)、S,N-CQDs@GMP(蓝线)和S,N-CQDs@GMP/Tb(红线)的FT-IR光谱图;(b)S,N-CQDs(黑线)、GMP(黄线)和S,N-CQDs@GMP/Tb(红线) 的紫外-可见吸收光谱。

图3(b)为S,N-CQDs和S,N-CQDs@GMP/Tb的紫外吸收光谱。S,N-CQDs在348 nm处表现出很强的吸收峰，该信号对应的是n-π*跃迁。加入稀土和鸟苷单磷酸之后，348 nm处的吸收峰消失，表明稀土发光中心的引入干扰了非键电子的轨道跃迁。同时，原始碳点位于242 nm处的π-π*跃迁峰移动到254 nm,说明碳点表面的多重羧基有可能参与了稀土离子的配位，并且材料产生了部分聚集效应(从图2(b)电镜图也可得到印证)，因而谱峰发生了明显的红移现象。以上结果证实S,N-CQDs与GMP/Tb发光中心产生了相互作用和微观结构的变化,S,N-CQDs@GMP/Tb纳米复合材料被成功合成。

3.2 S,N-CQDs@GMP荧光光谱分析

为了研究S,N-CQDs被组装到GMP/Tb中的光物理行为，我们基于S,N-CQDs@GMP/Tb开展稳态荧光测试。如图4所示，S,N-CQDs@GMP发射的荧光略低于S,N-CQDs在457 nm发射的荧光，在加入Tb3+之后，得到S,N-CQDs@GMP/Tb的荧光光谱在457 nm的发射峰进一步降低，同时得到了除上述峰以外在497，551，593，628 nm处的4个Tb3+的特征发射信号[2,29]，这主要是Tb3+的f-f轨道上的电子跃迁导致的，4个Tb3+特征信号可归因于5D4→7F6、5D4→7F5、5D4→7F4和5D4→7F3组态的跃迁。因此，将镧系Tb3+掺入S,N-CQDs@GMP中，使材料在Tb3+离子的绿光区域得到了增强。当被254 nm的UV灯激发时，S,N-CQDs@GMP/Tb发出蓝绿复合的荧光，而不是由纯S,N-CQDs发出的蓝色荧光。鸟苷单磷酸配体的引入使得有机结构与稀土离子之间的分子内能量传递效率提升，紫外区富集的能量被转移到铽离子的最低激发态，从而实现了荧光信号从蓝区向绿区移动的趋势。

图4 S,N-CQDs(黑线)、 S，N-CQDs@GMP(蓝线)和S,N-CQDs@GMP/Tb(红线)的荧光发射谱。

3.3 S,N-CQDs@GMP/Tb传感系统的最佳pH水平

检测环境中的pH变化是离子检测系统中一个重要的影响因素，为此，实验在不同的pH条件下，测试了S,N-CQDs@GMP/Tb传感器的荧光强度对Hg2+响应的影响。在Hg2+存在下不同的pH水平的体系中监测荧光发射强度，选取稀土Tb3+最强特征荧光峰(发射波长位于551 nm) 归一化作图得到图S3，显示在pH=7～8范围内荧光强度较强，说明在中性环境中该传感器具有较好的光学性质。因此，后续所有操作均在中性环境中进行检测。

3.4 S,N-CQDs@GMP/Tb在液相中的传感

如图5(a)、(b)所示，结果发现除Hg2+、Cu2+、Fe3+外，大多数金属离子对S,N-CQDs@GMP/Tb没有明显的荧光猝灭作用。虽然在加入Cu2+、Fe3+后，荧光强度均有降低，但对Tb3+特征峰的猝灭效果不及Hg2+对Tb3+特征荧光的猝灭，从图中仍可获得Cu2+、Fe3+滴定之后清晰的铽离子5D4→7F6、5D4→7F5跃迁信号。此外，加入Hg2+后位于457 nm的荧光峰增强效应也比其他离子更为突出。由此可以看出，除了Hg2+之外，其他金属离子的加入并不会导致荧光强度比的显著变化，这表明S,N-CQDs@GMP/Tb能够对Hg2+产生“绿-蓝”的信号转化，有望基于比率荧光的概念开发出用于汞离子识别的探针材料。

图5 (a)S,N-CQDs@GMP/Tb在HEPES缓冲液(0.1 mol·L-1，pH 7.4)中存在和不存在各种物种时(10-8 mol·L-1) 的荧光光谱；(b)条形图表示存在各种阳离子(10-8 mol·L-1)时S,N-CQDs@GMP/Tb的特征发射峰强度比F551/F457。

3.5 S,N-CQDs@GMP/Tb对Hg2+浓度的定量测定

如图6(b)，S,N-CQDs@GMP/Tb溶液中稀土锐线窄带发射信号很强，表明在极性溶液体系中能保持稀土的稳定发光。但在Hg2+存在的情况下，S,N-CQDs@GMP/Tb的荧光发生明显变化(示意图6(a))。因此，在S,N-CQDs@GMP/Tb中逐步滴加Hg2+(0～10-8mol·L-1) 进行梯度实验来证实S,N-CQDs@GMP/Tb对Hg2+浓度测定的可行性。

图6 (a)加入Hg2+后，S,N-CQDs@GMP/Tb的荧光颜色变化示意图;(b)S,N-CQDs@GMP/Tb(绿线)和S,N-CQDs@GMP/Tb+Hg2+(蓝线)的发射光谱。

图7(a)显示了S,N-CQDs@GMP/Tb在HEPES缓冲液中(0.1 mol·L-1，pH 7.4)，通过加入不同浓度的Hg2+进行滴定实验的情况，Hg2+离子浓度从0增加到10-8mol·L-1，记录了在305 nm激发下的光致发光光谱。如图7所示，随着逐渐加入Hg2+，位于457 nm的S,N-CQDs特征荧光峰逐渐增强，Tb3+的4个特征峰则循序下降，S,N-CQDs@GMP/Tb在497，551，592，628 nm的荧光峰下降程度与0～10-8mol·L-1范围内的Hg2+浓度成正比。随着Hg2+浓度的增加，S,N-CQDs@GMP/Tb的绿色荧光逐渐减弱的同时，蓝色荧光逐渐增强，这正好为Hg2+提供了稀土荧光信号驱动的比率荧光传感检测的可能。F551/F457的发射强度与浓度的变化遵循简单线性方程Y=3.70114-0.03124X(R2=0.982 9)(图7(b))。根据σDL=3σSD/K(σSD为空白样品的标准偏差，K为斜率)[30]确定检测限为7.04 nmol/L，低于美国环境保护署(EPA) 规定饮用水中允许Hg2+的最大浓度10 nmol/L。除此之外，我们在S,N-CQDs@GMP/Tb制备过程中，分别加入不同浓度的GMP前驱体(25，50，75 mmol·L-1)，得到的3种材料微观结构上有较大变化(图S4)，低浓度(25 mmol·L-1)时还有较为明显的球状准聚集体，高浓度(75 mmol·L-1)时枝状形貌消失，聚集加剧。三者用于检测Hg2+，发现不同GMP浓度下的S,N-CQDs@GMP/Tb的发射峰强度比F551/F457与Hg2+浓度呈线性关系(图S5)，依次计算得到检测限分别为12.2，7.04，16.78 nmol·L-1，以50 mmol·L-1合成的S,N-CQDs@GMP/Tb具有最低的检测限(表S1)，因此实验选择 50 mmol·L-1为合成预设条件。

图7 (a)在HEPES缓冲液(0.1 mol·L-1, pH 7.4)中，不同浓度的Hg2+(10-9～10-8 mol·L-1)存在下, S，N-CQDs@GMP/Tb的发光响应曲线;(b)S,N-CQDs@GMP/Tb的发射峰强度比F551/F457与Hg2+浓度的线性关系。

3.6 选择性测试

除了灵敏度，干扰实验也是评估传感系统的一个重要手段。为了进一步考察S,N-CQDs@GMP/Tb材料对Hg2+的特定靶向性，实验在相同温度和操作条件下，分别加入K+、Na+、Al3+、Ba2+、Be2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+、Pd2+、Cd2+、Cu2+、Fe3+(10-8mol·L-1)，研究其影响结果。如图8，当在10-8mol·L-1Hg2+存在时，该材料受到与环境相关的金属离子的共存对Hg2+

图8 条形图表示在HEPES缓冲液(0.1 mol·L-1, pH 7.4) 中，10-8 mol·L-1 Hg2+与10-8 mol·L-1几种阳离子混合存在的情况下，S,N-CQDs@GMP/Tb的特征发射峰强度比F551/F457。

3.7 Hg2+的检测机制

为了解Hg2+与S,N-CQDs@GMP/Tb纳米级复合材料的相互作用，我们研究了在Hg2+不存在和存在下S,N-CQDs@GMP/Tb发射寿命的变化。如图9(a)所示，S,N-CQDs@GMP/Tb纳米复合物的寿命为0.632 8 ms；加入Hg2+(10-8mol·L-1) 后，寿命为0.662 3 ms。加入Hg2+前后复合物的荧光寿命变化甚小，可以忽略不计，由此说明Hg2+的加入并未导致传感系统中激发态发生改变[31]。此外，我们进一步通过紫外吸收光谱研究荧光猝灭机制，如图9(b)，由于每次加入的Hg2+浓度比S,N-CQDs@GMP/Tb浓度少了两个数量级，因此在少量的Hg2+存在下，难以观察到S,N-CQDs@GMP/Tb吸收的变化。然而，在Hg2+、S,N-CQDs@GMP/Tb共存条件下，随着Hg2+的滴加，S,N-CQDs@GMP/Tb在254 nm的紫外吸收峰强度依次增加，说明Hg2+与鸟苷单磷酸产生了竞争性配位形成新的复合物，因而对其π-π*跃迁造成了影响。由此说明传感器的检测机制是Hg2+的介入取代了Tb3+与GMP发生基态改变，生成了新的基态复合物导致荧光静态猝灭。

图9 (a)S,N-CQDs@GMP/Tb的荧光寿命(黑线)与S,N-CQDs @GMP/Tb+Hg2+的荧光寿命(紫线);(b)不同浓度Hg2+(10-9～10-8 mol·L-1)存在下S,N-CQDs@GMP/Tb的紫外-可见吸收光谱。

3.8 真实样品中的Hg2+检测

为研究定量荧光传感器在真实样品中检测Hg2+的可行性，在纯饮用水、自来水和河水等水样中检测Hg2+(表1)。由于浓度非常低，水样中无法检测到Hg2+，于是我们采用标准的加标法测定汞含量。纯饮用水样品中，汞的回收率为95.83%～103.75%，相对标准偏差(RSD)为1.4%～3.3%。自来水样中的汞回收率为95%～102.67%，RSD为2.9%～4.1%。河水水样中的汞回收率为98.25%～106%，RSD为2.3%～2.8%。可接受的回收结果和令人满意的RSD值表明S,N-CQDs@GMP/Tb测定实际水样中汞含量的准确性和可靠性，稀土信号驱动式比率荧光传感器对环境水样中Hg2+的检测具有很大的潜力。

表1 水样中Hg2+检测的回收率

3.9 利用纸质传感器对Hg2+的可视化分析

传统检测材料一般是以粉末形式存在，称量、取用尤其是手执式操作极为不便，因此开发针对客体检测的固体器件，尤其是不需要通过特殊物理方法构筑的简易装置，对后期应用具有现实意义。本实验采用的是普通纤维滤纸用作承载发光活性组分的基底材料。滤纸被裁剪成平均尺寸为3 cm的圆形，再使用S,N-CQDs@GMP/Tb溶液(10 mg·mL-1)浸泡10 min，然后把样品取出在空气中室温条件下风干，即可作为便携式的离子检测材料。

如图10所示，在不同浓度的Hg2+中，肉眼即可观察到Hg2+指示的纸质视觉传感器在254 nm紫外线灯下发生了从绿色到蓝色的明显荧光颜色转换。该固相检测手段响应时间迅速，可在30 s内完成。由S,N-CQDs@GMP/Tb衍生的器件具有成本低廉、方便携带、取用等优点，具有较好的应用前景，有望满足药物监测、临床分析和食品加工等领域对Hg2+含量测定的需求。

图10 在254 nm紫外光激发下，滴加50 μL不同浓度(0，2，4，6，10 nmol·L-1)的Hg2+溶液后，Hg2+指示的纸质视觉传感器的荧光彩色图像。

4 结 论

本文在碳量子点基础上，以稀土荧光信号变化构筑了一种S,N-CQDs@GMP/Tb的Hg2+比率荧光传感器。实验分别采用高分辨透射电镜、能谱分析、红外吸收和紫外光谱证实了材料的结构。光物理分析表明稀土铽离子可以在碳基质材料中呈现出禁阻跃迁的特征信号，并得到蓝-绿混合发光。该材料对Hg2+的浓度具有较高选择性和灵敏度，线性范围为10～110 nmol·L-1，检测限为7.04 nmol·L-1。此外，利用S,N-CQDs@GMP/Tb沉积形成的滤纸，有效设计并获取了一种建立在固相基底上的光学传感器件，在手持紫外灯下肉眼可区分荧光颜色从绿色变化到蓝色。该项研究有机地把碳量子点和稀土荧光结合在一起，利用两个信号的比率荧光变化完成了对污染离子的检测，这对于生物医学、环境保护等领域实现快速检测和诊断具有较为重要的参考价值。同时，所提出的方法对检测Hg2+也具有可靠、准确、简便的优点，为后期开发具有巨大应用潜力的柔性传感策略开辟了新的途径。

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