基于稀土发光纳米材料的时间分辨成像

王 鑫 韩晓军 陈冠英

(哈尔滨工业大学 化工与化学学院, 黑龙江 哈尔滨 150001)

1 引 言

光学成像技术通常利用外源性的荧光探针对特定的区域进行标记,同时利用灵敏的光学检测器进行信号采集,广泛应用于疾病诊断、生物传感和防伪等领域[1-5]。 实现高分辨、高灵敏的光学成像关键在于设计优质的光学探针。 目前已经开发的光学纳米材料包括无机量子点[6-7]、稀土发光材料[4,8-9]、钙钛矿材料[10]、碳纳米管[11]、有机染料[12]和共轭聚合物[13]等。 然而,光学成像主要的问题是受自体荧光和光散射的限制,降低了生物成像的信噪比和成像深度,从而极大程度地影响了活体检测灵敏度和成像分辨率。 尽管最近的研究表明近红外区生物窗口内的荧光成像技术(700 ～950 nm,第一生物窗口；1 000 ～1 700 nm,第二生物窗口)能够在一定程度上缓解自体荧光和散射现象的影响[3,14-15],但目前报道的近红外材料的荧光波长一般小于1 200 nm,同时难以彻底消除背景荧光干扰,且发光颜色单一,难以通过颜色实现波长可分辨的多通道复合成像。 因此,光学成像仍需开发新型的纳米荧光材料,以满足高信噪比和多通道成像的需要。

时间分辨成像技术是一种利用荧光探针的长寿命特点进行无背景光学分析的成像技术[16]。由于自体荧光信号和散射荧光信号的寿命小于荧光探针的寿命,时间分辨技术能在背景信号完全衰减之后收集探针的荧光信息,因此能避免传统成像过程中产生的背景噪音干扰问题[17-20]。 目前,时间分辨成像技术包括时间门成像技术和在其基础上发展的寿命编码多通道成像技术两种。时间门成像的本质还是荧光成像,尽管采集的衰减信号会引起荧光强度下降,但由于抑制了自体荧光和散射,其成像的信噪比得到了极大的提升[21-22]。 寿命编码多通道成像则是对荧光寿命编码的生物信息进行时域并行光学成像,由于寿命信号与荧光强度、采集信号的效率和是否聚焦都无关系,几乎不受环境因素的影响,十分适用于体内的定量成像研究,而且还可同时对多个寿命信号在时域内进行平行多通道复合成像[23-24]。

稀土发光纳米材料是一类优质光学材料,具有长寿命、可调谐多色发光、发射峰窄和发光稳定等特点[4,25]。 此外,稀土发光离子具有丰富的发光能级,其离子内部4f-4f 电子跃迁能产生从紫外区到近红外区的荧光,而f-f 的禁阻跃迁使其具有较长的荧光寿命[16]。 据报道,稀土纳米材料的荧光寿命能够长达几十微秒到几十毫秒,远大于生物体自源荧光和散射的荧光寿命(低于10 ns),因而非常适用于时间分辨生物荧光成像的研究。另外,稀土发光纳米材料的荧光寿命可通过核壳结构[26]、掺杂浓度[27]、合成尺寸[28]、荧光共振能量转移[19,29]等策略进行精确的调节,从而使其能在不同的时域范围内满足不同成像条件的需求。因此,本文对稀土发光纳米材料的荧光寿命调控及其时间分辨成像的研究情况进行系统的综述和总结,并对其未来发展进行展望。

2 稀土发光纳米材料的荧光寿命调控

影响稀土发光纳米材料荧光寿命的因素主要包括核壳结构、离子掺杂浓度、尺寸大小、荧光共振能量转移和纳米晶内能量迁移过程。

2.1 核壳结构

在单核稀土发光纳米材料上包覆不同的壳层或可以抑制其表面猝灭和交叉弛豫,或能够增强光的吸收和介导能量传递过程。 纳米材料包覆的壳层通常可以分为“惰性”和“活性”壳层,其中“惰性”壳层是指壳层中既无激活剂也无敏化剂,主要起屏蔽能量传递的作用；而“活性”壳层是指壳层中存在激活剂或者敏化剂,起介导能量传递的作用。 本小节主要讨论惰性壳层对荧光寿命的影响,而“活性”壳层部分将在2.5 中讨论。

常见的惰性壳层有NaYF4、CaF2和NaLuF4,其主要作用是保护内核掺杂的敏化剂和激活剂,避免其表面缺陷、杂质和溶剂等引起发光猝灭现象。 因此,惰性外壳包覆的稀土纳米材料的荧光强度和寿命相对于单核纳米材料均能够显著增加。如图1 所示,核壳结构纳米晶NaYF4∶10%Yb3+,30%Nd3+@CaF2在808 nm 近红外光的激发下,1 000 nm 处的荧光寿命比单核纳米晶NaYF4∶10%Yb3+,30%Nd3+增强了16 倍[26]。 此外,研究表明惰性壳层的包覆厚度也会影响稀土发光纳米材料的荧光寿命。 以稀土纳米材料NaYF4∶Yb3+,Er3+包覆惰性壳层NaLuF4为例,在980 nm 近红外光激发下,随着外层NaLuF4的厚度增加,该稀土材料在540 nm、654 nm 和1 525 nm 处的荧光寿命信号均得到与壳层厚度依赖性地增强[30]。 可见,精确调控稀土纳米材料的壳层厚度可以有效调节荧光寿命。

图1 (a)核壳结构纳米晶NaYF4∶10%Yb3+,30%Nd3+@CaF2 抑制表面猝灭示意图；(b)核壳结构纳米晶NaYF4∶10%Yb3+,30%Nd3+@ CaF2 与单核纳米晶NaYF4∶10%Yb3+,30%Nd3+在1 000 nm 处的荧光衰减曲线[26]。Fig.1 (a)Schematic illustration of the NaYF4 ∶10%Yb3+,30%Nd3+ @ CaF2 core/shell nanoparticles designed to suppress the surface quenching effect.(b)Fluorescence decay curves of the emission observed at 1 000 nm from NaYF4 ∶10%Yb3+,30%Nd3+@CaF2 core/shell nanoparticles and NaYF4∶10%Yb3+,30%Nd3+nanoparticles[26].

2.2 离子掺杂浓度

敏化剂和激活剂是稀土发光纳米材料的重要元素,敏化剂能够吸收激发光将能量传递给激活剂,激活剂受到能量激发后发出荧光。 这两种离子的掺杂浓度会影响纳米晶中两种离子之间的间距,从而影响电多极矩或磁多极矩相互作用,引起荧光寿命的改变。 金大勇等利用这个策略,通过改变不同浓度的激活剂(Tm3+离子)掺杂浓度,使稀土发光纳米晶NaYF4,Yb3+,Tm3+的蓝光峰(480 nm)实现了从48 μs(4%Tm3+)到668 μs(0.2%)的寿命调节[31]。 另外,敏化剂浓度差异会引起荧光寿命的改变。 如在稀土核壳材料NaY0.9-xYb0.1,NdxF4@ CaF2中通过改变Nd3+离子的掺杂比例,在808 nm 的近红外光激发下能够在1 000 nm 处产生0.1 ～1.5 ms 范围的荧光寿命(图2)[27]。

图2 (a)6 个不同Nd3+浓度掺杂的NaYF4 ∶Yb3+,Nd3+@CaF2 核壳结构纳米晶荧光衰减曲线,激发光808 nm,发射光1 000 nm；(b)NaYF4 ∶Yb,Nd@ CaF2 核壳结构纳米晶荧光寿命的浓度依赖性[27]。Fig.2 (a)Fluorescence decay curves obtained for the NaYF4∶Yb3+,Nd3+ @ CaF2 core/shell nanoparticles with six different Nd3+ dopant levels. Excitation was performed at 808 nm, and the observed emission wavelength was 1 000 nm. (b)Concentration dependence of the fluorescence lifetime of the NaYF4 ∶Yb,Nd@CaF2 nanoparticles[27].

2.3 尺寸大小

随着纳米合成技术的不断发展,稀土发光材料能够实现从几个纳米到微米尺寸的精准制备。发光材料的尺寸会影响其发光寿命,因此通过精确制备不同尺寸的稀土纳米材料可以有效调控其发光寿命。 Goldys 等制备了一系列不同尺寸的稀土发光纳米晶NaYF4,Yb3+,Er3+(6 ～45 nm),并且发现这些材料的荧光寿命随尺寸减小而降低[32]。 这是由于稀土纳米发光材料的尺寸越小,其表面的非辐射能量猝灭过程越强,从而导致荧光寿命降低。 单分子水平的研究中也证实了荧光寿命信号随着尺寸减小而逐渐降低的规律(图3)[28]。 通常,对于尺寸小于20 nm 的纳米颗粒来说,荧光寿命主要受到表面效应的影响,而对于大尺寸( ＞20 nm)的稀土发光纳米材料,荧光寿命除了表面效应还会受到离子间交叉弛豫的作用。 此外,在核壳结构纳米材料研究中,尺寸因素主要体现在壳层的厚度上,其荧光寿命信号随壳层厚度增加而增强。 这主要是因为壳层越厚抑制表面无辐射跃迁的效果越好。

图3 不同尺寸(8,30,50,150 nm)单颗粒NaYF4∶20%Yb3+,2%Er3+上转换纳米晶扫描透射电镜图像(a)与荧光衰减曲线(b)Fig.3 (a)Scanning transmission electron microscopy(STEM)images of single upconversion nanoparticles(UCNPs)of NaYF4∶20%Yb3+,2%Er3+ with 8, 30, 50, 150 nm diameters. (b)Luminescence decay(normalized)plotted for various UCNP diameters.

2.4 荧光共振能量转移

稀土发光纳米材料可作为能量供体与其他材料的能量受体构建成荧光共振能量转移(Luminescence resonance energy transfer,LRET)体系,因此可通过改变能量受体浓度调节稀土发光纳米材料的荧光寿命。 如陈学元等利用生物素修饰的稀土发光纳米晶NaYF4∶Ce3+/Tb3+和亲和素修饰的异硫氰酸荧光素酯(FITC)分别作为能量供体和受体,通过生物素与亲核素特异性反应将两者键合成有效的LRET 体系。 在290 nm 的紫外光激发下,Tb3+离子发出的489 nm 的荧光与FITC 的激发光490 nm 重叠并发生能量转移,随着亲和素修饰的FITC 的浓度增加,LRET 作用不断增强,稀土发光材料NaYF4∶Ce3+/Tb3+在489 nm 处的荧光寿命呈现受体浓度依赖性地减小[33]。 此外,荧光寿命还可以通过调节供体和受体之间的距离实现。 如将能量供体稀土Eu3+离子的复合物与受体染料(阳离子香豆素六氟磷酸盐)封装在聚苯乙烯微球中,随着受体染料浓度的增加,单位体内Eu3+离子与染料的距离减小,Eu3+离子612 nm 荧光寿命实现了从359 μs 到188 μs 的调控(图4)[29]。 荧光共振能量转移策略对寿命调节范围相对较小,但由于其具有特别的偶联机制,适用特异性标记物的精确分析。

图4 基于LRET 设计的Eu3+复合物微球的荧光寿命测量示意图。 通过受体染料溶液浓度改变增强LRET效应时,Eu3+复合物微球红光的荧光寿命减小。 插图是单个Eu3+复合物微球荧光衰减信号[29]。Fig.4 Lifetime measurements from individual Eu-containing microspheres engineered by LRET scheme. Luminescence lifetime measured at Eu3+ red emission band shortened as the acceptor concentration in the original dye solution increased, as a result of stronger LRET effect. The inset curves are the luminescence decay signals measured from single Eu-LRET microspheres[29].

2.5 控制纳米晶内能量迁移过程

除了调控两种荧光物质之间的能量转移,荧光寿命还可以通过稀土材料内部的能量传递进行调控。 张凡课题组报道了一种通过在多层核壳结构中控制能量传递的策略调控稀土离子的荧光寿命。在稀土上转换纳米材料NaGdF4∶25%Yb,1%Tm@NaYF4∶10%Yb@NaNdF4∶10%Yb@NaYF4中,Yb3+离子是能量传递的重要中转离子,随着能量中转层NaYF4∶10%Yb 厚度由1.5 nm 增加到5.4 nm,多层核壳结构纳米晶的475 nm 蓝光寿命由632 μs 增加到836 μs[19]。

此外,该课题组还开发了一系列不同荧光寿命的近红外二区多层核壳结构纳米晶NaGdF4@NaGdF4∶Yb,Er@NaYF4∶Yb@NaNdF4∶Yb。该稀土纳米晶不仅能通过增加能量中转层(NaYF4∶Yb)厚度上调1 525 nm 的荧光寿命信号(图5(a)),还能以提高发光中心Er3+离子的掺杂浓度下调1 525 nm 的荧光寿命信号(图5(b)),从而实现了从5.8 μs 到20.9 ms 范围的荧光寿命调节[20]。可见,各种荧光寿命的调控策略不是完全独立的,它们之间往往相互联系,因此开发可调谐的长荧光寿命探针需要综合考虑采用多种方法。

总之,在这些调控荧光寿命的方法中,调节离子掺杂浓度是最容易实现的调控策略,但需要考虑浓度猝灭等因素,因此需要通过包覆惰性壳层以减少浓度猝灭的影响。 在调节尺寸的方案中,单核纳米晶的合成可控性有限,不过通过构建核壳结构纳米晶可打破这一限制,以改变壳层的厚度控制尺寸进而调控寿命。 荧光共振能量转移策略能对寿命进行精确调控,但调节范围较小(几百微秒),而控制纳米晶内能量迁移过程可以实现较大范围(从微秒到毫秒)的寿命调控。

图5 (a)能量中转层(NaYF4 ∶Yb3+)厚度d =0 ～7 nm时,Er3+离子掺杂纳米晶的1 525 nm 的荧光衰减曲线；(b)发光Er3+离子浓度为2% ～30%、d=0.9 nm 和发光Er3+离子浓度为15% ～45%、d =0 nm时,Er3+离子掺杂纳米晶的1 525 nm 的荧光衰减曲线。Fig.5 (a)Luminescence decay curves measured at 1 525 nm from the as-prepared Er3+ nanoparticles with energy relay shells of increasing thickness d from 0 to 7 nm(identical composition).(b)Luminescence decay curves of the nanoparticles with incremental Er3+ doping concentration from 2% to 30% for d =0.9 nm and from 15% to 45% for d=0 nm.

3 时间门成像

时间门成像是一类直接利用衰减荧光信号进行成像的时间分辨技术。 由于荧光探针的发光寿命远大于自体荧光或散射信号的荧光寿命,时间门成像可在脉冲激光激发后通过延迟一定时间再进行荧光信号的采集,从而屏蔽发生在该延迟时间内的背景荧光信号。 稀土发光纳米材料为时间门成像的研究提供了广泛的材料。 目前,长寿命的稀土发光纳米材料已经成功应用于生物组织和微环境响应的时间门成像。

3.1 生物组织的时间门成像

与可见光(400 ～700 nm)相比,近红外生物窗口(700 ～1 700 nm)受自体荧光和光散射的影响较小,能够穿透厘米级的组织进行高分辨的深层成像[11,34]。 然而,当近红外光激发时,动物体内(如皮肤、毛发)的内源性荧光基团依然能够发出荧光,从而降低了靶向区域成像的信噪比[26,35]。为了解决这一问题,金大勇等开发了上转换时间门成像系统,并利用长寿命的上转换纳米材料NaLuF4∶Yb3+,Tm3+实现了高对比度的时间门成像[36]。 如图6,该时间门成像系统包括3 个部分：用来激发长寿命探针的脉冲激发光源；屏蔽激发光和短寿命荧光信号的旋转斩波器；捕获长寿命荧光信号的检测器。 将水相的稀土上转换纳米材料NaLuF4∶Yb3+,Tm3+经皮下注入小鼠腹部,并将小鼠放入时间门成像系统,在980 nm 脉冲光的照射下进行时间门成像。 其结果显示,与传统800 nm 荧光成像相比,时间门成像的信噪比提高了一个数量级(12 倍)。 此外,笔者课题组也开发了类似的近红外二区下转换时间门成像系统,利用长寿命(近1 ms)的近红外二区稀土探针用于研究小鼠的时间门成像。 我们利用聚丙烯酸修饰稀土发光核壳纳米晶NaYF4∶10%Yb3+,30%Nd3+@CaF2,使其具备良好的生物相容性,并将水化寿命探针注入小鼠体内进行1 000 nm 处的时间门成像。 结果显示小鼠的皮肤、食物和眼睛中的自体荧光和散射信号得到明显的抑制,成像的信噪比得到了显著的提高[26]。

由于长寿命的探针在时间门成像过程中荧光信号衰减迅速,检测器捕获的荧光信号通常较弱,因此可以通过增强材料的发光效率来提高衰减的荧光信号。 李富友团队开发了一种14.5 nm 的稀土发光纳米晶α-NaYbF4@CaF2作为高效寿命探针进行时间门成像研究[37]。 在短脉冲的975 nm近红外光激发下,该高效探针能发出相同能级的975 nm 衰减荧光。 更重要的是该探针在内核中只掺入单激发态的Yb3+离子,有效避免交叉弛豫影响,并在壳层保护下突破了浓度猝灭的限制,实现了转换效率近100%的高效近红外发光。 将水化的长寿命探针注入到小鼠体内(13 μg·g-1),在1.1 mW·cm-2功率密度的近红外光激发下即可观察到信噪比大于9 的小鼠器官。 而且,在时间门成像技术帮助下,该高亮的长寿命探针能够在荷瘤小鼠体内长期监测肿瘤的生长情况。

图6 体内近红外时间成像系统示意图[36]Fig.6 Shematic illustrating the TGL system for in vivo NIR imaging[36]

3.2 微环境响应的时间门成像

体内实时监测微环境如pH、温度和酶对生物医学的研究十分重要。 光学成像技术提供了一种非侵入性方式在体内监测微环境变化。 然而,组织的吸收和散射限制了光信号的穿透深度,而且光信号在不同的组织存在差异,限制了其在特定组织的成像。 相对于传统的稳态荧光成像,时间门成像能够消除短寿命的背景噪音,提高成像信噪比,十分适合用于体内微环境的研究。 李富友团队利用稀土发光纳米材料NaYF4∶1%Tm3+@NaLuF4、染料 Rh760 和聚乙二醇化的磷脂mPEG5000-DSPE 构成pH 响应的荧光探针[38]。在690 nm 激发光激发下,NaYF4∶1% Tm3+@NaLuF4和染料Rh760 都能发出800 nm 的近红外光。 而RH760 对pH 敏感,其荧光信号会因pH改变而发生变化。 由于两种材料的荧光寿命不同,可在时间门成像系统中通过区别并采集同一波段不同的荧光信号,两种材料的比率荧光信号可实现1.5 ～7 范围的pH 响应成像。 在动物实验中,利用时间门成像不仅能检测胃肠区域的pH值,还能实时监测由药物和食物消化引起的pH值变化。

温度是生物微环境中一个重要的生理和病理指标。 如图7,稀土上转换发光材料(Tm-UCNPs)可与温度敏感PbS 量子点构建成复合的上转换纳米团簇,用于体内测温和监测肿瘤内部温度变化[39]。 在865 nm 的近红外光的激发下,PbS 量子点发出温度敏感的810 nm 上转换荧光(短寿命),而Nd3+离子敏化的Tm-UCNPs 上转换纳米晶发出稳定的810 nm 上转换荧光作为参照(长寿命)(图7(a))。 由于寿命不同,这两个同波段的上转换荧光可以通过时间分辨技术分开,因此通过采集这两种荧光的比率可实现对温度的测量,其热灵敏度高达5.6%·K-1。 而且,由于该复合探针的激发光和发射光均在生物窗口内,十分适用于体内测温。 通过修饰聚乙二醇,该复合荧光探针可用于在光热治疗过程中实时监测肿瘤温度的变化,避免由于过热造成的组织损伤(图7(b))。

除了pH、温度,稀土发光纳米材料还能应用于酶响应的时间门成像。 Nazare 等开发了一种激活型稀土复合探针用于时间门成像检测细菌中的硝基还原酶[40]。 在该研究中,喹诺酮前体包覆稀土Tb3+离子复合物在紫外光的照射下并不发光,而硝基还原酶能激活惰性的喹诺酮(邻胺桂皮酸内酰胺)前体形成光敏感态的天线,并将能量传递给稀土Tb3+离子的发光中心产生550 nm 的荧光。 Tb3+离子的时间分辨光谱表明,随着硝基还原酶浓度的增加,其在550 nm 处的可见荧光显著增加。 而且,硝基还原酶浓度与稀土荧光探针的时间分辨光谱成良好的线性关系,其检测限低至4.4 ng·mL-1。 在时间门成像技术的帮助下,该酶响应的稀土复合探针在显微成像中成功分辨了临床中的多种多重耐药细菌,如肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍氏不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属等,这十分有助于开发新型诊断细菌感染的工具。

此外,LRET 型探针在微环境响应的时间门成像研究中发挥了重要的作用。 由于LRET 的能量受体会对微环境具有特异性响应,稀土发光材料作为能量供体,在接受能量传递后其荧光信号会发生相应的改变,从而实现对微环境的成像。基于此,LRET 型稀土发光探针还可以应用于无机分子[41]、DNA[42]、蛋白质[43]响应的时间门成像。 如稀土Tb3+复合物与罗丹明构建的LRET 系统对溶酶体的一氧化氮(NO)敏感,当该系统与NO 反应后,时间门光谱显示Tb3+复合物540 nm的荧光显著减少,而罗丹明发出565 nm 的荧光明显增加,而且二者的荧光比值与NO 浓度成线性关系。 在时间门成像中,利用该响应的复合探针可检测出肝癌细胞(HepG2)和大型蚤中的NO[41]。

图7 上转换发光的纳米簇用于相同波段的比率测温示意图。 (a)测温机制示意图；(b)相同波段的比率测温在体内温度监测示意图[39]。Fig.7 Schematic of UCL-NCs for the same wavelength ratiometric thermometry. (a)Schematic mechanisms of the UCL-NCs.(b)Schematic illustration of the same wavelength ratiometric temperature monitoring in vivo[39].

3.3 活体定量检测

近红外荧光能够穿透深层组织,然而组织对光的吸收和散射存在差异,荧光信号强度发生不同程度的衰减,阻碍了其在体内对标记物的精确检测。 最近的研究表明,鲁棒的荧光寿命信号传感与组织深度无关,这有利于对生物体内部进行精确的量化分析。 复旦大学张凡课题组制备了一种肿瘤微环境(过氧亚硝酸盐,ONOO-)响应的稀土-花青染料LRET 纳米复合探针,用于基于寿命的原位肝癌细胞传感(图8(a))[23]。 在该纳米复合探针中,能量供体稀土下转换发光纳米晶NaYF4@NaYF4∶1% Nd3+与对ONOO-敏感的能量受体NIR-Ⅱ 染料MY-1057 之间产生LRET 效应,导致其在1 060 nm 的荧光寿命显著减小。 当活性氮存在时(特别是ONOO-),由于该探针中的能量受体MY-1057 被降解,复合探针的荧光寿命信号得到了恢复(图8(b))。 基于此,利用该复合探针在肝部区域进行寿命编码成像,不仅可以准确地区分肝癌病变和正常组织,而且还能定量检测不同尺寸肿瘤病灶中的ONOO-。 而对于普通的荧光成像,由于纳米材料在肝部的高度蓄积导致信噪比低,难以区分肝部的病变组织(图8(c))。

类似地,Tm3+离子掺杂的稀土发光纳米材料与近红外染料IR-820 也可以构建成基于LRET的纳米传感系统用于检测ClO-分子[44]。 在该体系中,稀土纳米晶NaYF4∶Tm3+的吸收和发射都在同一能级(3H4),极大地提高了发光效率,比核壳结构纳米材料(NaYF4∶20% Yb3+,1% Tm3+@NaYF4)的上转换发光强度提高了33 倍,可作为一个高效的能量供体。 而染料IR-820 在800 nm处有很强的吸收,可作为能量受体。 由于染料IR-820 对ClO-非常敏感,易发生分解,该LRET纳米传感系统的寿命信号随着ClO-的浓度升高而不断增长,因此可以利用荧光寿命信号的变化测定ClO-的浓度。 此外,在关节炎的小鼠模型中,利用该探针进行寿命编码成像可以有效地标记出炎症区域。

此外,利用寿命成像还可以用于监测体内pH的变化。 张俊龙等通过在卟啉上引入羧酸盐制备了稀土Yb3+离子卟啉复合物作为pH 敏感的寿命探针[45]。 在pH =9.0 ～5.0 的生理环境下,该探针在900 ～1 100 nm 范围的荧光寿命信号随pH的减小而呈依赖性地增加(从13. 4 μs 增大到135 μs)；而在pH ＜5 的环境下,该探针会发生团聚,造成溶解度下降致使Yb3+离子复合物从水中暴露出来,当pH 从5.0 降到1.0 时,荧光寿命依然呈随pH 减小而依赖性增加(从135 ms 增加到170 ms)。 在小鼠口腹灌胃实验中,利用该pH 探针进行时间寿命编码成像可以实时监测小鼠体内正常代谢、禁食和服用铝碳酸镁药物时的pH 变化。 然而,该探针使用的激发波段在可见区(500 ～600 nm),其穿透深度方面存在明显的不足。 因此,仍需要开发近红外激发/发射的寿命探针,用于实现对体内的生理和病理环境的定量可视化分析,这将在临床诊断和治疗方面具有很大的应用潜力。

图8 在NIR-Ⅱ区进行基于寿命的原位肝癌细胞传感示意图。 (a)ONOO -敏感型传感器：磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)修饰NaYF4@NaYF4∶1%Nd 与MY-1057 复合物(DSNP@ MY-1057-GPC-3)；(b)ONOO - 存在时能量受体染料MY-1057 敏感地降解,导致NIR-Ⅱ区荧光寿命恢复；(c)利用DSNP@MY-1057-GPC-3 探针对肝细胞癌小鼠进行非侵入的NIR-Ⅱ荧光信号和寿命信号成像[23]。Fig.8 Schematic illustration of lifetime-based detection of hepatocellular carcinoma(HCC) in the second near-infrared(NIR-Ⅱ) window. (a)Scheme of the ONOO --responsive nanosensor DSNP@ MY-1057-GPC-3. (b)In the presence of ONOO -, the structure of the energy acceptor MY-1057 degrades sensitively, leading to the lifetime recovery in NIR-Ⅱregion. (c)Illustration of noninvasive NIR-Ⅱintensity- and lifetime-based imaging for HCC mice after administration of DSNP@MY-1057-GPC-3 nanosensor[23].

4 寿命编码多通道成像

寿命编码成像是利用不同荧光寿命信号作为密码进行成像的时间分辨技术。 在寿命编码成像中,目标分子与寿命编码的荧光探针特异性结合后可获得该探针的寿命信息,通过对图像的数据处理可解码标记物的寿命信息,从而实现目标分子的特异识别。 寿命编码的多通道成像则能利用多个寿命信号对不同标记物同时进行分析,实现生物检测中的高通量分析或防伪领域的高阶加密。 稀土发光纳米材料具有可调谐的长寿命,便于产生多个稳定的编码寿命信号进行时域多通道复合成像,并在最近得到了学术界广泛的关注。

图9 寿命编码防伪文件及储存的光学信息。 3 种不同的图像叠加成一个混合图片,其中Tm 寿命探针(CYb∶CTm)20∶4 是麦考瑞大学的标志,20∶4代表悉尼歌剧院,20∶0.5 代表悉尼海港大桥。 (a)荧光成像显示的复合图片；(b)根据像素寿命成分进行时间分辨扫描显示的分离图片[29]。Fig.9 Demonstration of lifetime-encoded document security and photonic data storage. Three overlapping patterns are printed with different Tm τ-dots： (CYb∶CTm) 20∶4 for the ‘Macquarie University’ logo, 20∶1 for the Sydney Opera House image, and 20∶0.5 for the Sydney Harbour Bridge image. (a)Intensity-based luminescence imaging gives a complex picture.(b)Timeresolved scanning separates the patterns based on the lifetime components of every pixel[29].

金大勇课题组在稀土多寿命编码的复合成像方面做了早期的研究工作。 他们利用具有不同寿命的稀土上转换纳米晶NaYF4∶Yb3+,Tm3+进行了多级防伪的研究[31]。 在该研究中,将3 种寿命(τ=52,159,455 μs)的稀土上转换纳米晶NaYF4∶Yb3+,Tm3+制成防伪墨水,在同一张纸上依次喷涂上3 种不同的图形进行加密设置。 利用常规Tm3+475 nm 蓝光信号下进行成像只得到了一个模糊的图像(图9(a)),而利用寿命信号进行编码的复合成像却可以清晰地分辨这3 种图形(麦考瑞大学、悉尼歌剧院和悉尼海港大桥)(图9(b))。 该研究提供了一种安全的加密防伪策略,以不同寿命的防伪墨水对文件进行加密,只有知道正确解码规则才能获得密码信息。 此外,他们还利用4 种不同寿命的稀土Eu3+离子的微球(R-315,R-276,R237 和R-118,R 代表Eu3+离子发出的612 nm 的红光)分别偶联靶向核酸,用于检测不同病菌的单链DNA[29]。 在同一检测样品中,时间分辨正交扫描显微系统能同时采集多个Eu3+离子复合物微球的时域荧光。 通过对复合图像解码可以有效地鉴别人体免疫缺陷病毒(HIV)、埃博拉病毒(EV)、乙型肝炎病毒(HBV)和人乳头瘤病毒16(hpv 16)4 种病毒的单链DNA。 因此,多寿命编码的复合成像避免了传统荧光信号产生交叉干扰的问题,实现了高通量体外检测生物样本。

近期,笔者课题组利用不同的稀土寿命探针进行了活体多通道复合成像研究。 我们将两种不同寿命编码的稀土核壳结构纳米材料NaYF4∶Yb,Nd@CaF2分别以口服和尾静脉注射注入小鼠体内。 在980 nm 处的近红外荧光寿命成像结果显示长寿命的稀土探针(τ=1.3 ms)富集在肝部,而短寿命的稀土探针(τ=0.7 ms)富集在胃部。 体内的多路寿命复合成像能精确地分辨不同寿命的纳米探针,并追踪了它们不同的生物分布途径[27]。 在应用两个寿命的信号进行成像的基础上,我们还开发了一系列可调谐寿命(78 ～2 157 μs)的上转换纳米发光材料NaYF4@ NaYbF4@NaYF4∶Yb3+/Tm3+@ NaYF4,用于体内的时域多通道上转换复合成像[24]。 体内多通道成像中,3种寿命的上转换探针以尾静脉和皮下的方式注入小鼠体内,在980 nm 近红外脉冲光激发下,800 nm 处的荧光寿命编码复合成像可以有效地分别出肝部(τ5=1 158 μs)和腹部皮下组织(τ2=920 μs,τ9=1 528 μs)的寿命着色(图10)。

此外,复旦大学的张凡课题组在利用稀土发光寿命进行多路复合成像方面也做出了重要贡献。 在可见区的研究中,3 种颜色(蓝绿红)的上转换纳米材料(NaGdF4∶Yb3+,Ln3+@NaYF4∶Yb3+@NaNdF4∶Yb3+@NaYF4,Ln=Tm,Er/Pr,Er)可分别通过多层核壳结构和控制能量传递调控出不同寿命的信号,具有很强的编码能力[19]。 将不同寿命和颜色的上转换纳米材料封装在多孔聚苯乙烯微球中,并分别修饰上9 种人乳头瘤病毒(HPV16,18,31,33,35,39,45,51,68)的DNA 探针,在多寿命编码的复合成像中,根据寿命和颜色不同可分辨出这9 种高风险的HPV。 在近红外区的研究中,3 种寿命(τ=0.553,1.73,7.21 ms)的稀土下转换纳米材料NaGdF4@NaGdF4∶Yb3+,Er3+@NaYF4∶Yb3+@NaNdF4∶Yb3+分别偶联3 种乳腺癌标记物的抗体,用于不同肿瘤分型的鉴定和分析[20]。 将抗体标记的寿命编码探针经尾静脉注入肿瘤小鼠体内,采集多个近红外二区1 525 nm 的荧光寿命信号进行编码复合成像。 该荧光寿命的复合成像结果显示雌激素受体(ER)、黄体酮受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER2)3 种标记物在MCF-7 肿瘤中的表达分别为62. 3%、17.9% 和19.8%,而在BT-474 肿瘤中的表达为25. 4%、28%和46.6%,因此可以判断出在不同的肿瘤细胞中3 种肿瘤标记存在表达差异。 可见,高通量的复合编码成像能够在活体中鉴别和检测多种分子样品,有可能成为核酸分析、蛋白鉴定和临床诊断的一种新型重要工具。

图10 体内时域多通道复合上转换成像：(a)将纳米颗粒注入小鼠,并利用自制的时间分辨系统进行上转换成像示意图；(b)聚丙烯酸(PAA)包覆的τ2、τ5 和τ9 3 种寿命的多核壳结构纳米晶的上转换荧光衰减曲线；(c)将PAA 包覆的τ2 和τ9两种寿命的多核壳结构纳米晶皮下注入昆明小鼠腹部,进行上转换荧光成像(左上)和寿命成像(右上)。 在第二只昆明小鼠中(下),除了皮下注τ2 和τ9纳米晶外,还通过尾静脉注入PPA 包覆的τ5 纳米晶,进行内部器官上转换荧光成像(左下)和上转换寿命成像(右下)。 τ 寿命值与(b)中的纳米颗粒一致[24]。Fig.10 Temporal multiplexed in vivo upconversion imaging. (a)Schematic illustration of nanoparticles administration into a mouse, which was then imaged using a home-built time-resolved upconversion luminescence imaging system. (b)Measured upconversion luminescence decay profiles of PAA-coated core/multishell nanoparticles with lifetimes of τ2, τ5 and τ9(aqueous dispersion). (c)Upconversion luminescence intensity(top left) and lifetime(top right) imaging of PAA-coated core/multishell nanoparticles with lifetimes of τ2 and τ9 in a Kunming mouse and also in a second Kunming mouse(bottom)(subcutaneous injection of these nanoparticles into abdomen). Intravenous administration of PAA-coated core/multishell nanoparticles with a lifetime of τ5 was implemented for the second mouse,enabling us to light up the internal organs for both luminescence intensity(bottom left) and lifetime(bottom right) upconversion imaging. τ values correspond to those of nanoparticles in (b)[24].

5 结论与展望

时间分辨成像技术能利用寿命信号有效地消除自体荧光和光散射,为光学成像提供了新机遇。稀土发光纳米材料作为新型荧光探针具有良好的光学性质,如发射峰窄、发光稳定和可调谐的长寿命等,适用于时间分辨成像。 通过稀土纳米结构设计已经开发出多种寿命调控策略(核壳结构、浓度、尺寸、荧光共振能量转移、能量迁移过程)用于开发新型寿命探针。 目前,可调控的长寿命稀土纳米发光材料已经应用于高对比度和灵敏度的时间分辨成像(时间门成像和寿命编码成像),不仅可以实现生物组织成像、微环境监测、疾病标记物检测和多级防伪,而且还能利用多个寿命信号进行高通量的时域成像,在同一样品中定量分析多个检测样品。 尽管稀土发光纳米材料在时间分辨成像中已经取得了一些进展,但在实际应用过程中仍然存在一些挑战。

(1)量子产率是困扰稀土发光纳米材料应用最重要的问题之一[46]。 由于时间门成像的研究中需要采集衰减的荧光信号,稀土纳米发光材料的发光亮度会影响其成像效果。 尽管寿命编码成像与稀土纳米发光材料的发光强度无关,但是发光强度会影响寿命信号的采集速度,一般发光越弱采集速度越慢,限制了成像样品的快速分析。通过提高激发功率可以有效地提升稀土发光纳米材料的发光亮度,但是高功率激发会引发热效应,不利于生物样品成像。 因此,急需提高稀土发光纳米材料的量子效率,以低功率激发实现时间分辨成像。

(2)寿命编码成像的定量研究。 由于荧光寿命信号与组织深度、激发功率和探针浓度都无关,寿命编码成像为活体内精确的定量研究提供了新策略[23]。 虽然稀土发光材料与染料的LRET 传感器能实现体内的定量检测,但其检测范围会受到纳米材料尺寸和染料的结合率限制。 因此,基于LFET 的寿命编码成像还需要构建更加稳定和高效的生物功能交联方法以提高LRET 配对效率,同时增加响应受体的种类。

(3)时域多通道成像。 利用稀土荧光寿命作为可分辨的时域信号能够在同一样品中以最小的体积检测多种分析样本,可为生物传感和临床疾病诊断提供精确的数据。 高通量的分析需要多种荧光寿命探针与特定的标记物特异性结合,而目前多种标记物的研究模型有限,基于时间分辨技术的多通道成像还有很大的应用潜力。