柱前衍生--高效液相色谱法测定重组ⅠⅠⅠ型人源胶原蛋白修复凝胶中胶原蛋白

张晓芸，孙星宇，杨政，徐礼友，谷琴，王晓晨，丁逸梅，2

（1.南京工业大学江苏省药物研究所，南京 210009； 2.南京工业大学药学院，南京 211816；3.江苏海智生物医药有限公司，南京 210018； 4.山东食品药品审评查验中心，济南 250022）

胶原蛋白在祛瘢痕和祛皱、皮肤屏障修复保湿、伤口敷料、创面止血等方面具有显著疗效，成为近年来医疗器械研究用重要的生物材料[1-15]。市售的胶原蛋白大都是从动物结缔组织中提取得到的动物源胶原蛋白，而动物源胶原蛋白属于非同源物质，与人源胶原蛋白存在差异，主要表现为活性低甚至无活性，可能含有动物源病毒，易引起过敏等诸多缺陷[16]。重组人源化胶原蛋白是由DNA 重组技术制备的人源化胶原蛋白特定型基因编码的全长或部分氨基酸序列片段，或含人胶原蛋白功能片段组合[17]，具有高生物活性性，透皮吸收率高，促进细胞黏附、增殖、生长和分化等功能，无病毒隐患，低免疫反应，水溶性好，易于做成各种剂型。人源胶原蛋白有Ⅰ、ⅠⅠ、ⅠⅠⅠ、V 和XⅠ型，正常皮肤组织中主要以Ⅰ型和ⅠⅠⅠ型存在，其中III型人源胶原蛋白大量存在于婴幼儿的皮肤、血管内膜和肠道中。ⅠⅠⅠ型人源胶原蛋白具有延缓皮肤衰老，增加皮肤弹性和修复组织创伤等应用。而随着年龄的增长，ⅠⅠⅠ型人源胶原蛋白在人体中逐渐流失，因此皮肤出现松弛、皱纹和瘢痕等各种衰老现象。

ⅠⅠⅠ型人源胶原蛋白结构为单链结构，基本重复单元为GERGAPGFRGPAGPN-GⅠPGEKGPAGERGAP，为人胶原蛋白ⅠⅠⅠ型肽段，末端序列为PCCGGG，呈现164.88°的柔性弯曲结构，被证实拥有人天然胶原蛋白典型的三螺旋构象的胶原蛋白。目前市场上出现众多以ⅠⅠⅠ型人源胶原蛋白为原材料的医疗器械产品，而国家尚未发布该类产品中重组ⅠⅠⅠ型人源胶原蛋白含量检测方法，且文献报道较少[19]。目前胶原蛋白含量测定的技术手段主要包括高效液相色谱法、紫外分光光度法、羟脯氨酸比色法、高效液相色谱-串联质谱法、酶联免疫测定法（ELⅠSA）法等[18-23]。对于胶原蛋白的检测比较困难，且缺少直接测定方法，羟脯氨酸为胶原蛋白特异性氨基酸，通过水解胶原蛋白测定羟脯氨酸（Hyp）的含量可以确定胶原蛋白的含量。重组人源胶原蛋白为DNA 基因重组合成，其氨基酸组成不含羟脯氨酸。

筛选出重组人源胶原蛋白中合适的氨基酸代替羟脯氨酸，通过测定该氨基酸含量折算出胶原蛋白的含量，从而建立重组人源ⅠⅠⅠ型胶原蛋白修复凝胶中胶原蛋白含量测定方法，为该产品胶原蛋白的含量测定提供质控依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：LC-2010CHT 型，附带LC Solution 工作站，日本岛津企业管理(中国)有限公司。

电子分析天平：（1）BSA224S 型，感量为0.1 mg；（2）QUⅠNTⅠX35-1CN 型，感量为0.01 mg，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

电热恒温鼓风干燥箱：DHG-9070A 型，上海齐欣科学仪器有限公司。

恒温水浴锅：HH-6 型，常州国华电器有限公司。

超纯水机：PURELAB flex2型，威立雅水处理技术（上海）有限公司。

盐酸：分析纯，南京化学试剂股份有限公司。

磷酸二氢钾：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

乙腈：色谱纯，霍尼韦尔（中国）有限公司。

氢氧化钠：分析纯，南京化学试剂股份有限公司。

无水碳酸钠：工作基准试剂，天津市化学试剂研究所有限公司。

碳酸氢钠：分析纯，阿拉丁生化科技股份有限公司。

三水合乙酸钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

2，4-二硝基氟苯：分析纯，上海麦克林生化科技股份有限公司。

脯氨酸标准样品：标准物质编号为111578-50 mg，批号为111578-201602，中国食品药品检定研究院。

甘氨酸：分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

L-丙氨酸：分析纯，上海麦克林生化科技股份有限公司。

重组人源ⅠⅠⅠ型胶原蛋白：芜湖英特菲尔生物制品产业研究有限公司。

重组人源ⅠⅠⅠ型胶原蛋白修复凝胶样品：批号分别为20221031、20221214、20230202，江苏海智生物医药有限公司。

实验用水为去离子水，威立雅超纯水仪制得。

1.2 仪器工作条件

色谱柱：Kromasil 100-5 型C18柱[250 mm×4.6 mm，5 μm；诺力昂新材料(苏州)有限公司]；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL；检测波长为360 nm；流动相：A相为0.05 mol/L乙酸铵溶液，B相为乙腈，流量为1.0 mL/min；梯度洗脱程序：0～5 min，A体积分数为95%，10～15 min A体积分数为80%→50%，17～18 min A体积分数为50%→95%，30 min A体积分数为95%。

1.3 溶液配制

脯氨酸对照品储备溶液：200 μg/mL，精密称取脯氨酸对照品10 mg，置于50 mL 容量瓶中，加入6 mol/L盐酸溶液溶解并稀释至标线，摇匀。

脯氨酸对照品溶液：20 μg/mL，精密量取质量浓度为200 μg/mL 脯氨酸对照品储备溶液2.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入6 mol/L盐酸溶液稀释至标线，摇匀。

样品溶液：精密称取重组人源胶原蛋白修复凝胶4 g，置于20 mL顶空瓶中，加入6 mol/L盐酸溶液5 mL，再置于110 ℃烘箱中，加热水解24 h，取出放冷至室温，使用中性滤纸过滤（滤纸上加入适量直径3～4 mm 实验用玻璃珠），全部转移置于20 mL 容量瓶中，用水清洗3 次，加入12 mol/L 氢氧化钠溶液2.6 mL，混匀，放冷至室温后，加水定容至标线，摇匀。

磷酸盐缓冲液：pH值为7.0，称取6.8 g磷酸二氢钾，置于1 L容量瓶中，加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液291 mL，用水稀释至标线，摇匀。

空白溶液：精密称取空白凝胶4 g，置于20 mL顶空瓶中，与样品溶液制备同法操作。

1.4 实验步骤

1.4.1 衍生化反应

精密量取脯氨酸对照品溶液和样品溶液各2.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加入1 mol/L碳酸氢钠溶液1.0 mL、0.5 mol/L 碳酸钠溶液0.5 mL、1%DNFB 乙腈溶液100 μL，避光，于60 ℃下恒温水浴中保温1 h，取出，放至室温后，加入适量的磷酸盐缓冲液稀释至标线，摇匀。

1.4.2 重组ⅠⅠⅠ型人源胶原蛋白中脯氨酸的含量计算

重组ⅠⅠⅠ型人源胶原蛋白结构为单链结构基本重复单元为GERGAPGFRGPAGPNGⅠPG-EKGPAG ERGAP，为人胶原蛋白ⅠⅠⅠ型肽段，末端序列为PCCGGG。根据国泰生物多肽分子量计算器将末端序列作为C 段序列计算重组ⅠⅠⅠ型人源胶原蛋白相对分子质量为26 126，含有55 个脯氨酸残基，计算出脯氨酸含量为24.24%。

1.4.3 测定

取衍生化反应后的脯氨酸对照品溶液及样品溶液，按1.2色谱条件进样分析，记录色谱峰面积，按外标法计算样品中脯氨酸的含量。按照重组ⅠⅠⅠ型人源胶原蛋白中脯氨酸的含量，折算为胶原蛋白的含量。

2 结果与讨论

2.1 衍生化条件的优化

2.1.1 氨基酸的选择

ⅠⅠⅠ型人源胶原蛋白结构为单链结构基本重复单元为GERGAPGFRGPAGPN-GⅠPGEKGPAGERGAP，为人胶原蛋白ⅠⅠⅠ型肽段，末端序列为PCCGGG。根据氨基酸序列，ⅠⅠⅠ型人源胶原蛋白不含羟脯氨酸；含量较高的氨基酸分别为甘氨酸，丙氨酸、脯氨酸。羟脯氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸对照品、重组ⅠⅠⅠ型人源胶原蛋白、重组ⅠⅠⅠ型人源胶原蛋白修复凝胶、空白凝胶高效液相色谱图见图1。由图1 可知，重组ⅠⅠⅠ型人源胶原蛋白中未检出羟脯氨酸；而甘氨酸和丙氨酸分别受空白凝胶干扰，脯氨酸含量较高且不受空白凝胶干扰，专属性良好，因此选择脯氨酸作为重组ⅠⅠⅠ型人源胶原蛋白修复凝胶中胶原蛋白含量测定的特征氨基酸。

图1 羟脯氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸对照品、重组ⅠⅠⅠ型人源胶原蛋白、重组ⅠⅠⅠ型人源胶原蛋白修复凝胶、空白凝胶高效液相色谱图

2.1.2 衍生化试剂2，4-二硝基氟苯的用量考察

采用2，4-二硝基氟苯（DNFB）与脯氨酸在碱性环境下衍生化生成DNFB-脯氨酸，该反应为可逆反应，衍生化试剂的用量过少则衍生化不完全，用量过多易产生逆向反应。分别使用80、90、100、110、120 μL 质量分数为1%的DNFB 乙腈溶液进行试验，考察DNFB 用量对响应值的影响，不同体积1%的DNFB 乙腈溶液对应色谱峰面积见图2。由图2 可知，1% DNFB 乙腈溶液体积为100 μL 时色谱峰面积最大。

图2 衍生化试剂不同用量对应的色谱峰面积

2.1.3 衍生化环境pH的考察

采用DNFB与脯氨酸在碱性环境下衍生化生成DNFB-脯氨酸，该反应为可逆反应，酸性条件不利于衍生化反应；强碱性条件下DNFB-脯氨酸水解，也不利于衍生化反应。分别在pH值为7.2、7.9、8.3、8.5、9.1、9.5、10 条件下进行试验，考察pH 值对响应值的影响，不同pH值对应的色谱峰面积见图3。由图3可知，pH控制在8.5～9.0之间DNFB-脯氨酸的响应值最大。

图3 不同pH值对应的色谱峰面积

2.1.4 衍生化温度的考察

采用DNFB与脯氨酸在碱性环境下衍生化生成DNFB-脯氨酸，该反应需要提供一定能量才能产生衍生化反应。分别选择衍生化温度为50、60、70 ℃进行试验，考察温度对响应值的影响，结果表明，该反应从60 ℃起衍生化趋于平稳，说明温度60 ℃能够满足衍生化需要的反应能量，因此选择衍生化温度为60 ℃。

2.1.5 衍生化时间的考察

考察60 ℃条件下加热时间对响应值的影响，结果表明，当加热时间为40～90 min 时，DNFB-脯氨酸的衍生化趋于平稳，说明加热时间不是关键因素，且加热超时不会发生逆向反应，虽然40 min反应已经平衡，但考虑凝胶基体复杂性，仍然选择衍生化时间为60 min。

2.2 水解时长的优化

胶原蛋白充分水解，且水解后的脯氨酸在高温浓酸的环境下稳定是本次研究的前提条件，重点筛选出在110 ℃条件下使用6 mol/L 盐酸溶液水解胶原蛋白消耗的时长。分别选择水解时间为1、2、4、7、13、19、24、28 h，考察胶原蛋白的水解情况，同时可以直观反映脯氨酸在高温酸性环境下的稳定性。结果表明，胶原蛋白在24 h内水解完全，且超出24 h后脯氨酸仍保持稳定，未见明显降解，因此选用水解时长为24 h。

2.3 色谱条件的选择

分别选择检测波长为（360±2） nm、柱温为（30±2） ℃、流动相流量为（1.0±0.2） mL/min进行试验，考察分析条件波动下对测定结果的影响。结果表明，以上分析条件下重组人源胶原蛋白修复凝胶中胶原蛋白含量波动均低于±2%，说明波长、柱温和流量的微小波动对重组人源胶原蛋白修复凝胶中胶原蛋白含量测定的影响较低。

2.4 系统适应性试验

分别精密吸取脯氨酸对照品、修复凝胶样品和空白衍生化溶液各10 μL，按1.2色谱条件测定。样品、对照品衍生化溶液在脯氨酸-BNBF处有相同保留时间为10.8 min，空白溶液对羟脯氨酸测定无干扰，结果表明该法专属性良好。脯氨酸-DNBF衍生物理论塔板数大于5 000，脯氨酸-DNBF 衍生物峰拖尾因子为1.0，与相邻峰分离度均大于1.5。衍生化溶液的高效液相色谱图见图4。

图4 衍生化溶液高效液相色谱图

2.5 线性关系

分别精密量取脯氨酸对照品储备溶液逐级稀释，配制成质量浓度分别为10、16、20、24、40 μg/mL的脯氨酸系列标准工作溶液，进行衍生化。分别精密量取上述溶液，注入液相色谱仪，用该方法测定，以脯氨酸质量浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线图，用最小二乘法进行线性拟合，得到线性方程：y=6.469×104x+1.577×103，线性相关系数为0.999 6。结果表明，脯氨酸溶液的质量浓度在10～40 μg/mL范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验

取同一批号重组人源胶原蛋白修复凝胶进行水解并衍生化，平行配制6 份样品溶液，按1.2 色谱条件测定，记录峰面积，按脯氨酸对照计算脯氨酸含量，再根据脯氨酸的含量折算胶原蛋白的质量分数，试验结果见表1。

表1 重组人源胶原蛋白修复凝胶样品精密度试验结果

由表1可知，测定均值为0.138 6 mg/g（n=6），测定结果的相对标准偏差为3.85%，表明该方法的精密度良好。

2.7 样品加标回收试验

精密量取空白凝胶4 g，置于20 mL 顶空瓶中，分别加入质量浓度为60、80、100 μg/mL 胶原蛋白（PA2208S003 批，脯氨酸含量为24.24%），每个浓度平行配制3份，水解和衍生化后测定，结果见表2。

表2 重组人源胶原蛋白修复凝胶样品加标回收试验结果

由表2可知，样品加标平均回收率为95.68%，表明该方法准确可靠，可用于重组人源ⅠⅠⅠ型胶原蛋白修复凝胶中胶原蛋白含量测定。

2.8 溶液稳定性

在室温条件下，分别取脯氨酸对照品衍生化溶液、样品衍生化溶液，分别于0、1、2、4、8、12、16、20、24 h，注入高效液相色谱仪测定，测定值的相对标准偏差低于1%，表明脯氨酸对照品衍生物和修复凝胶水解衍生物在室温条件下放置0～24 h稳定。

3 结语

采用高效液相色谱法建立了重组ⅠⅠⅠ型人源胶原蛋白修复凝胶中胶原蛋白含量的方法。分析重组ⅠⅠⅠ型人源胶原蛋白的氨基酸序列以及专属性定位，筛选出脯氨基酸作为重组ⅠⅠⅠ型人源胶原蛋白含量测定的特征氨基酸。以HPLC法测定样品中脯氨酸含量，再进行分子量折算得到胶原蛋白含量。选择衍生化条件为110 ℃，水解时间为24 h，衍生化弱碱条件为pH 8.5～9.0，衍生化试剂为100 μL 1%DNFB乙腈溶液，衍生化温度为60 ℃保温1 h，所得到的修复凝胶中胶原蛋白含量最高。结果表明，所建方法专属性强、科学合理，能比较客观地反映修复凝胶中脯氨酸的含量，从而较客观地反映胶原蛋白含量，可用于修复凝胶中胶原蛋白含量的测定。该研究结果可为形成重组ⅠⅠⅠ型人源胶原蛋白各类制剂的制定质量控制标准提供参考依据。